紅裸須搖蚊幼蟲腸道可培養細菌多樣性及耐受重金屬功能初步研究

安佳婷,徐海軒,楊浩成,閆春財,孫澤陽

(天津師范大學生命科學學院天津市動物多樣性保護與利用重點實驗室,天津 300387)

搖蚊,隸屬于雙翅目Diptera搖蚊科Chironomidae,廣泛分布于世界范圍內各種水體中,是一類數量和種類極其龐大的水生昆蟲,是淡水水域中底棲動物的主要類群之一,其生物量可占到底棲動物的70%～80%。搖蚊地理分布廣泛,具有耐受極端條件的能力,可以生活于熱帶沼澤(Pinho and Andersen, 2021)、極地(Moubayed-Breil and Ashe, 2019)、海洋(Sugimaruetal., 2008)、冰川積水(Moubayed and Langton, 2019)等極端環境中。同時,大量研究表明,一些搖蚊幼蟲可以在污染的水體環境中大量生存,體現出較強的耐污能力(Alhouetal., 2012)。例如,Chironomuskiiensis,Chironomusjavanus,Polypedilumtrigonus3種搖蚊的數量與底泥中高濃度有機物及重金屬離子成正相關(Al-Shamietal., 2010)。相關報道稱在受銅、鉻和鋅污染嚴重的河流區域,搖蚊生物量占總底棲動物的80%,而對比同一條河流中未受污染區域,搖蚊生物量僅占10%(Winneretal., 1980; Loayza-Muroetal., 2013)。因此,國內外環境學家普遍將搖蚊作為重要的水質評估的指示生物(Caoetal., 2019)和水生態毒理學實驗模式生物,開展生物監測的應用研究也逐漸增多(周東等, 2018; White and Liber, 2020)。盡管搖蚊對環境污染能夠產生較強的抗性這一事實已經被較多學者報道,但其對環境脅迫因子的響應機制仍不清晰。

昆蟲腸道內微生物與宿主個體經過長期協同進化,形成了一種互利互惠的共生關系,能夠直接或間接對宿主造成潛在影響,在促進個體消化、吸收利用營養、參與解毒過程、影響發育和壽命、抵抗外來病原的侵入、提高宿主免疫活性、合成生物信息素等方面體現出無可替代的作用(Jingetal., 2020)。昆蟲腸道微生物群落主要包括病毒、古細菌、細菌、真菌和原生動物等(周帆等, 2020),而種類繁多的細菌是其優勢種群,主要包含變形菌Proteobacteria、厚壁菌Firmicutes、放線菌Actinomycetes、擬桿菌Spirochetes等。

不同種類昆蟲的腸道微生物群落組成存在差異,鱗翅目Lepidoptera家蠶Bombyxmori的腸道優勢菌主要有變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、放線菌門Actinomycetes和擬桿菌門Bacteroidaceae(Chenetal., 2018);鱗翅目Lepidoptera稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis的腸道優勢細菌來自變形菌門Proteobacteria、厚壁菌門Firmicutes、放線菌門Actinomycetes、酸桿菌門Acidobacteria、綠彎菌門Chloroflexi和擬桿菌門Bacteroidaceae(劉小改, 2016)。研究發現,即使是同一物種,腸道微生物群落結構也在個體的不同狀態下表現出表型差異,并被證實高度依賴于棲息地生態環境(Youngetal., 2018; Evaristeetal., 2019; Wuetal., 2020)與食物種類(相輝和黃勇平, 2008),昆蟲從食物或環境中獲得微生物,并經過腸道選擇后形成共生菌。

值得關注的是,近年來國內外研究發現昆蟲腸道內微生物可以通過直接或間接途徑幫助昆蟲緩解甚至消除外源有毒物質對其帶來的不利影響,是昆蟲個體對抗外源有害因子的有效保護機制之一。例如,咖啡果小蠹Hypothenemushampei腸道微生物群落中的假單胞菌屬Pseudomonas以咖啡因作為唯一的碳氮源,以此幫助蟲體對有害物質咖啡因進行降解(Ceja-Navarroetal., 2015)。蜜蜂腸道微生物可以通過調控蜜蜂的內源性解毒酶表達量來幫助其抵御噻蟲啉和氟纈氨酸兩類殺蟲劑,促進蜜蜂的健康(Wuetal., 2020)。

盡管如此,目前研究人員對昆蟲腸道微生物的菌群結構探索只局限在極少數昆蟲類群中,搖蚊腸道菌群結構及其參與個體抵御有害物質的潛在作用還未曾見報道。本研究以華北地區常見的耐污種紅裸須搖蚊4齡幼蟲為實驗對象,探究銅離子及鎳離子對紅裸須搖蚊幼蟲的急性毒理效應。重點采用傳統分離培養法對其腸道內可培養細菌進行初步鑒定及分析,在了解搖蚊幼蟲腸道細菌群落組成的基礎上探究相關菌株對重金屬銅離子及鎳離子的耐受程度,為進一步研究這些共生菌對宿主抵御外源有害物質(如重金屬)的潛在功能提供必要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 紅裸須搖蚊幼蟲采集、飼養及處理

搖蚊幼蟲于2021年5-7月采集于天津市北大港地區獨流減河流域隨機5個取樣點,分別為S1(117°20′32″ N; 38°49′38″ E),S2(117°24′46″ N; 38°48′31″ E),S3(117°22′55″ N; 38°45′44″ E),S4(117°25′24″ N; 38°44′41″ E),S5(117°32′49″ E;38°46′17″ N),采樣點均為淤泥底質。將采集的搖蚊幼蟲用蒸餾水初步清洗后,在體視鏡下依據頭殼等形態學特征進行分析。將經過鑒定的紅裸須搖蚊幼蟲置于通氧且盛裝脫氯自來水的塑料桶內混合培養,室內溫度保持在22～24℃之間,每天早晚各換一次水。

在預實驗的基礎上,用蒸餾水配置梯度濃度為156.25、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.13 mmol/L的CuSO4溶液,以及濃度為168.07、84.03、42.02、21.01、10.5 mmol/L的NiCl2溶液。對照組為蒸餾水。隨機挑選780頭生理狀態、外觀形態無明顯差異的幼蟲分別放入各燒杯中進行實驗,每個濃度設置3個重復,每個重復20頭幼蟲。實驗期間不投喂任何食物,通入微氧,每24 h更換一次溶液。分別記錄經24、48、72、96 h處理后幼蟲的死亡數目(判斷標準:用鑷子輕輕夾幼蟲腹部,若未蜷縮則認定為死亡),并利用IBM SPSS Statistics 26軟件計算半數致死濃度(LC50)(賈春生, 2006)。

1.2 幼蟲腸道內容物提取

幼蟲在脫氯水,156.25 mmol/L CuSO4溶液以及84.03 mmol/L NiCl2溶液中培養96 h后,各隨機選取5頭生理狀態較好的幼蟲。在無菌環境下,將幼蟲置于冰上3～5 min使其昏迷后進行蟲體表面消毒,使用75%酒精棉片輕輕擦拭幼蟲表面30 s,隨后用0.25%無菌次氯酸鈉溶液沖洗幼蟲表面2次,每次1 min,用無菌生理鹽水沖洗浸泡幼蟲表面3次,每次1 min,最后用雙蒸水沖洗幼蟲表面3次,每次1 min,以去除蟲體表面殘留液體。將體表消毒好的幼蟲放在置于培養皿中的載玻片上,使用滅菌后的解剖刀切開幼蟲口器和尾部,用滅菌后的鑷子從幼蟲頭部輕輕取出腸道,立即用滅菌PBS緩沖液漂洗腸道,去除其它內臟及其附屬物,采集腸道及其內容物。在1.5 mL離心管中提前加入1 mL滅菌PBS緩沖液,將剖離的腸道裝入無菌離心管后用勻漿器將腸道充分研磨形成勻漿后備用。

1.3 幼蟲腸道可培養細菌分離

1.3.1實驗所用培養基

每種培養基的體積為500 mL,4種培養基中的有效成分如下,于121℃下滅菌20 min,備用。

(1)普通肉湯培養基(LB):LB粉末12.5 g,瓊脂7.5 g;

(2)牛肉膏蛋白胨培養基(NA):蛋白胨5 g,牛肉膏1.5 g,氯化鈉2.5 g,瓊脂7.5 g;

(3)腦心浸液培養基(BHI):腦心浸液粉末12.25 g,瓊脂7.5 g;

(4)MC培養基(MC):MC粉末20 g,瓊脂7.5 g。

1.3.2實驗過程

將來自脫氯自來水中培養的普通幼蟲的腸道勻漿液稀釋為10-3、10-4、10-5三個梯度待用。分別取100 μL溶液均勻涂布于LB、NA、HBI、MC培養基上,每個濃度梯度設置3個重復,同時將完成體表消毒的幼蟲在培養基上滾動做為參照,以保證體表消毒徹底。平板倒置放入人工氣候箱中37℃培養72 h,觀察參照是否有菌落長出,若無菌落長出,證明體表消毒合格,則選擇菌落分散較好的培養皿,每24 h根據菌落特征,分別挑取形態、大小、顏色不同的單菌落在新的相應培養基上劃線純化培養(至少5次),直至得到形態穩定的單克隆菌株。

0.5 mmol/L CuSO4溶液、0.5 mmol/L NiCl2溶液經0.45 μm孔徑濾膜過濾器去除細菌后,依次加入滅菌后的LB、NA、BHI、MC培養基中,分別配制成濃度為6.25、3.125、0.625、0.3125 mmol/L的CuSO4培養基和NiCl2培養基。將暴露于濃度為156.25 mmol/L的CuSO4溶液、84.03 mmol/L的NiCl2溶液中的幼蟲腸道內容物勻漿液按照上述步驟均勻涂布并培養。

1.4 細菌的菌落形態觀察及性質檢測

腸道可培養細菌在固體培養基上進行純化培養,分別觀察細菌形狀、菌落形態、顏色、隆起度、邊緣形狀、表面狀態、光澤、干濕情況、透明度等菌落特征。將經分離純化得到的純菌株按照革蘭氏染色法進行性質判斷,并在顯微鏡下觀察細菌的形態。

1.5 細菌DNA提取及16S rRNA基因片段的擴增

取5 mL塑料搖菌管分別加入3 mL LB、NA、HBI、MC液體培養基,將經分離純化得到的純菌株接入相應的培養基中,放入搖床36℃,220 rpm/min振蕩培養,直至OD600達到0.7～1.0。采用DNA提取試劑盒提取各細菌基因組DNA,方法依據生工生物工程(上海)有限公司提供的Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒。使用超微量紫外可見分光光度計(美國丹諾兒Denovix)檢測所提DNA在260 nm、280 nm處的紫外吸光值,OD260/OD280在1.8～2.0范圍內即為合格。以各細菌提取的DNA為模板,利用細菌通用引物27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)/1492R(TACGGYT ACCTTGTTACGACTT)進行PCR擴增。PCR反應體系共50 μL,其中包括:4.0 μL dNTPs(2.5 mmol/L),0.5 μL Taq酶(5 U/μL),5.0 μL 10×PCR buffer,上游引物27F及下游引物1492R(10 μmol/L)各2.0 μL,2.0 μL基因組DNA,其余用ddH2O補齊體系。PCR反應條件為:預變性94℃ 3 min;變性94℃ 30 s,退火54℃ 30 s,延伸72℃ 1.5 min(24個循環);最后延伸72℃ 10 min;4℃保存。PCR擴增產物用1%(質量體積比)瓊脂糖凝膠電泳檢測,將檢測合格的樣品送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.6 幼蟲腸道細菌系統發育樹構建

雙向測序測得的序列通過DNAMAN軟件進行矯正及拼接,拼接完成后的16S rDNA序列提交到http://www.ncbi.nlm.nih.gov中與GenBank核酸數據庫中的序列進行BLAST同源性比對,查找并選出與菌株相似度最高的序列作為參照菌株并下載核酸序列,使用Clustal W軟件比對序列(Tamuraetal., 2013),運用軟件MEGA X以鄰位相連算法(Neighbor-Joining)構建系統發育樹(Saitou and Nei, 1987),判定其親緣關系。

2 結果與分析

2.1 重金屬脅迫下紅裸須搖蚊幼蟲的半數致死濃度測定

幼蟲在接觸重金屬溶液初期反應強烈,不斷蜷縮和舒展蟲體。暴露數小時后,實驗組各濃度梯度幼蟲活動情況與對照組無顯著差異,在重金屬溶液中暴露24～72 h時,實驗組各濃度梯度搖蚊幼蟲活力顯著降低并出現死亡,在銅離子溶液中存活的幼蟲蟲體發黑,長度變長,在鎳離子溶液中存活的幼蟲蟲體顏色變為棕色后變為黑色,長度變短,但刺激幼蟲腹部,幼蟲仍會蜷縮蟲體,對照組幼蟲活力基本不變,存活狀態好。記錄24、48、72、96 h紅裸須搖蚊幼蟲的在重金屬下的存活數目,計算得出紅裸須搖蚊幼蟲在重金屬銅暴露下的24 h-LC50、48 h-LC50、72 h-LC50及96 h-LC50分別為6304.86、403.59、29.33以及14.43 mmol/L(表1),幼蟲在重金屬鎳暴露下的24 h-LC50、48 h-LC50、72 h-LC50及96 h-LC50分別為339.52、182.18、102.59以及60.94 mmol/L(表2)。

表1 重金屬銅暴露不同時間紅裸須搖蚊幼蟲的半數致死濃度

表2 重金屬鎳暴露不同時間紅裸須搖蚊幼蟲的半數致死濃度

2.2 幼蟲腸道內細菌的種類

將5頭于脫氯水中培養紅裸須搖蚊幼蟲的腸道內容物稀釋為10-3、10-4、10-5三個梯度,分別涂布于LB、MC、NA、BHI 4種培養基上,經培養后獲得腸道原始菌株。選擇單菌落數目在30～300株的培養基,挑選生長時間、形態、大小、顏色不相同的菌落進行分離純化。提取分離后的菌落基因組DNA,并以其為模板擴增16S rRNA基因片段。結果顯示,從紅裸須搖蚊幼蟲腸道中共分離出16株不同的細菌(編號依次為N01-N16),其中從LB培養基中分離到4株,從MC培養基中分離出4株,從NA培養基中分離出6株,從BHI培養基中分離出2株。經NCBI Blast程序比對后,分離到的紅裸須搖蚊幼蟲腸道細菌與相應菌株的16S rRNA基因序列相似度在99%～100%之間。這16種可培養細菌分別屬于變形菌門Proteobacteria和黃桿菌門Flavobacteria,共涉及9個科(表3)。

表3 紅裸須搖蚊幼蟲腸道微生物16S rRNA基因序列對比結果

2.3 幼蟲腸道細菌的形態特征

對紅裸須搖蚊幼蟲腸道中分離得到的16株細菌的菌落特征與革蘭氏染色結果進行觀察,結果見附件增強出版材料。16株菌株中所有菌株的革蘭氏染色結果均呈陰性,且除N06、N13為球狀外,其余菌株均為桿狀。分離的全部細菌均可以在37℃生長,培養24～48 h后菌落形態明顯。

2.4 系統發育研究

將分離得到的紅裸須搖蚊幼蟲腸道可培養細菌16S rRNA基因序列進行系統發育進化分析,構建系統發育樹(圖1)。共有16株細菌,主要分為兩類,即變形菌門:黃單胞菌科、叢毛單胞菌科、耶爾森菌科、弧菌科、腸桿菌科、摩根菌科、莫拉菌科、假單胞菌科和黃桿菌門:黃桿菌科。

圖1 16S rRNA基因序列系統發育進化分析Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA sequences

系統發育樹共分為3大支12小支,變形菌門中,N08拉烏爾菌屬的R.terrigena與其模式菌株R.terrigena(KC790258.1)聚為一小支,N11摩根菌屬的M.morganii與其模式菌株M.morganii(MK123498.1)聚為一支,N06沙雷氏菌屬居泉沙雷氏菌與其模式菌株S.fonticola(MN227496.1)聚為一支,這三支聚為一小支,說明N08、N11、N06三個種的親緣關系較近。耶爾森菌科耶爾森菌屬的N04Y.pekkanenii與其模式菌株Y.pekkanenii(KY606578.1),N12Y.kristensenii、N03Y.intermedia與其模式菌株Yersiniakristensenii(LR745657.1)聚為一支。N05氣單胞菌屬氣單胞菌與其模式菌株Aeromonassp.(MN540110.1)聚為一小支,N16假單胞菌屬假單胞菌與其模式菌株Pseudomonassp.(KM117221.1)聚為一小支,N13不動桿菌屬不動桿菌與其模式菌株Acinetobactersp.(AM412145.1)聚為一小支,N01窄食單胞菌屬嗜麥芽孢子菌與其模式菌株S.pavanii(MN889300.1)聚為一小支,這六支聚為一大支,說明N08、N11、N06、N04、N12、N03、N05、N16、N13、N01的親緣關系比較近。N14代爾夫特菌屬的D.acidovorans、N02代爾夫特菌屬代爾夫蒂亞菌與其模式菌株D.acidovorans(NR113708.1)聚為一小支,N10叢毛單胞菌屬的C.testosleroni,N15叢毛單胞菌屬叢毛單胞菌與其模式菌株C.testosteroni(MK426827.1)聚為一小支,這兩小支又聚成一大支,說明N14、N02、N10、N15的親緣關系較近。N09金黃桿菌屬金黃桿菌與其模式菌株Chryseobacteriumsp.(MN540120.1)聚為一類,單獨成為一大支。

2.5 幼蟲腸道內細菌耐重金屬的研究

按照相似方法對重金屬銅、鎳脅迫下的紅裸須搖蚊幼蟲在含有銅離子、鎳離子的培養基中進行腸道細菌純化分離,最終在含有銅離子、鎳離子的培養基中均分離得到7株細菌,根據16S rRNA基因序列結果分別鑒定得到細菌,經過Blast比對后,在含有銅離子的培養基中分離得到7株細菌與無處理搖蚊腸道細菌中N01、N03、N06、N09、N10、N11、N12為同種菌,7株菌株均可以在含銅固體培養基上生長(≤ 3.125 mmol/L),并且N06(沙雷氏菌屬)在含銅培養基上生長時,菌落周圍Cu2+的藍色明顯減淡或消失(圖2)。

圖2 N06(沙雷氏菌屬)在含有不同濃度銅離子的固體培養基上生長情況Fig.2 Growth circumstances of the strain N06(Serratia sp.) exposed to distinct dosages of Cu2+

在含有鎳離子的培養基中分離得到7株細菌與無處理搖蚊腸道細菌中分離的N05、N06、N10、N13、N14、N15、N16為同種菌,7株菌株均可以在含鎳培養基上生長(≤ 2.101 mmol/L)。14株細菌均可以在37℃生長,培養24～48 h后菌落形態明顯。

3 結論與討論

搖蚊是一種分布廣泛、種類繁多、數量眾多的昆蟲,其生命周期包括卵、幼蟲、蛹、成蟲4個階段,屬于完全變態昆蟲,90%的生命周期以幼蟲的狀態在底泥中度過(田文龍等, 2021)。目前大量研究表明,昆蟲腸道微生物能夠幫助昆蟲個體抵御外界不良因素(如重金屬、有機農藥等)的脅迫,例如蠅類、水虻等昆蟲幼蟲可以高效轉化有機廢物而自身不受到侵害,這與其腸道中的共生微生物有著密切聯系(楊紅和黃勇平, 2018)。也有研究表明,蚊科昆蟲的腸道微生物群不僅可以影響幼蟲的生長、成蟲對生態環境的適應性以及繁殖能力,同時對蚊子免疫基因的表達也發揮了潛在作用(Strand, 2018)。當培養基中鉛含量為500 mg/L時,家蠅腸道中的波氏桿菌Bordetellasp,海氏普羅威斯登菌Providenciaheimbachae和松鼠葡萄球菌Staphylococcussciuri可以吸附培養基中10%的鉛,幫助家蠅耐受環境中的高濃度金屬鉛(王婉強, 2021)。目前許多研究人員都在探索昆蟲腸道微生物,但僅在家蠶、蜜蜂等類群中有零星報道,本試驗則以華北地區的優勢耐污種紅裸須搖蚊為研究對象,對其腸道內可培養微生物進行分離研究,將正常蟲體與重金屬離子(銅、鎳)暴露下蟲體內的腸道可培養細菌進行比較,分析其在種類、進化關系、耐受重金屬能力等方面的不同。

在紅裸須搖蚊幼蟲腸道分離得到的16株不同遺傳型的可培養細菌,分屬于黃單胞菌科1種,黃桿菌科1種,摩根菌科1種,莫拉菌科1種,假單胞菌科1種,叢毛單胞菌科4種,弧菌科2種,腸桿菌科2種,耶爾森菌科3種。其中,15種屬于變形菌門,1種屬于黃桿菌門,表明變形菌門在紅裸須搖蚊幼蟲腸道可培養細菌中占據優勢地位,同時意味著變形菌門可能對紅裸須搖蚊幼蟲的營養吸收、生長發育等方面有重要的作用。盡管每種昆蟲的腸道微生物種類和豐富度存在巨大差異,但有研究表明棉鈴蟲腸道微生物主要由黃桿菌屬、沙雷氏菌屬、寡養單胞菌屬以及腸桿菌屬構成(趙晨晨, 2020),家蠶腸道微生物的優勢菌群主要是假單胞菌屬、腸球菌、代爾夫特菌(李莉等, 2021),羽化后的南亞實蠅腸道中金黃桿菌屬、黃桿菌屬、寡養單胞菌屬Stenotrophomonas、腸桿菌屬、普羅威登斯菌屬Providencia、假單胞菌屬以及沙雷氏菌屬均為優勢菌群(駱米娟, 2016)。結合本研究結果,認為昆蟲腸道微生物群落存在一部分共有的核心菌群。

本研究首次利用傳統微生物體外純化培養技術從紅裸須搖蚊幼蟲腸道中分離到16株不同遺傳型的可培養細菌,與其它昆蟲腸道可培養微生物相比,多于孫博通等在斜紋夜蛾Spodopteralitura4齡幼蟲腸道中分離到的10種細菌(孫博通等, 2017),但少于章雨璐等在椰心葉甲Brontispalongissimi腸道中分離得到的22種細菌(章雨璐等, 2021)。已有大量研究表明,昆蟲腸道微生物的種類和數量與昆蟲種類、發育階段(李選文等, 2021)、生長環境、消化道形態、食性、食物喂養條件等因素有密切關系,伴隨著昆蟲取食、消化、排泄,腸道成為了一個可變的動態環境,腸道微生物的結構、種類、數量也被賦予動態的變化(魯迎新等, 2016)。椰心葉甲等植食性昆蟲食性廣、食量大、個體大,腸道結構較為復雜,而紅裸須搖蚊幼蟲個體較小,棲息在水體底泥當中,食物來源極為局限,主要以水體中的有機碎屑和水體沉積物中的有機物為食,并且食量較小,腸道結構也較為簡單,因而腸道可培養細菌的種類和數量也相對較少。另外,由于昆蟲腸道這一特殊的半封閉環境有其復雜的理化性質和特有的營養結構,以及不同部位不同的微生態環境,故而生存著許多特化的菌群以及共生菌群等,經過長期的共同進化,絕大部分菌群高度適應腸道這個特殊環境,體外培養無法完全模擬腸道內的厭氧環境、菌群相互作用、氧化還原電位、pH值等條件,使得體外培養只能分離出極少一部分共生菌,絕大多數腸道微生物因為不適宜的環境條件而無法分離。盡管如此,傳統的微生物體外分離純化技術仍有其不可替代的作用,體外培養技術的培養方法和技術成熟,在適宜條件下微生物生長速度快,能夠快速分離并且直觀地觀察到菌落特征、生理生化特征以及細菌形態,同時快速分析菌株的相關功能。

本研究從環境重金屬角度出發,通過靜水染毒法對紅裸須搖蚊幼蟲進行了急性毒性試驗,重金屬銅對紅裸須搖蚊幼蟲24、48、72、96 h的LC50分別為6304.86、403.59、29.33、14.43 mmol/L,與銅對其他種類搖蚊的急性毒理效應對比(李浩, 2012),紅裸須搖蚊幼蟲對重金屬銅呈現更強的耐受性。從較高濃度重金屬銅脅迫下仍健康存活的紅裸須搖蚊幼蟲腸道中分離得到7株可培養細菌,分別隸屬于耶爾森菌屬、金黃桿菌屬、叢毛單胞菌屬、沙雷氏菌屬、窄食單胞菌屬、摩根菌屬,它們與正常飼養的紅裸須搖蚊幼蟲腸道可培養細菌重合,并能夠在含銅固體培養基中正常生長,體現了菌株的耐金屬性,可能與紅裸須搖蚊幼蟲耐受銅離子有關。值得關注的是腸桿菌科沙雷氏菌屬居泉沙雷氏菌生長在含有銅離子的固體培養基時,菌落周圍藍色消失出現,表明該菌株可能具有利用或代謝銅離子的潛力。研究表明StenotrophomonasmaltophiliaPD2這一種具有耐銅性,且能夠對水體環境中銅離子展現出一定的生物吸附力(Ghosh and Saha, 2013)。與此同時,研究組發現1.25 mM Cu暴露下紅裸須搖蚊幼蟲腸道內Stenotrophomonas的相對豐度從1.27%提升到25.76%(未發表數據),從側面說明搖蚊幼蟲腸道內存在的Stenotrophomonas對于攝入的銅離子有較高的響應機制,可能存在一定的銅代謝能力,以減少銅離子對幼蟲的傷害。

幼蟲在重金屬鎳下暴露24 h-LC50、48 h-LC50、72 h-LC50、96 h-LC50分別為339.52、182.18、102.59以及60.94 mmol/L,與閆賓萍(2006)研究的鎳對羽搖蚊幼蟲24 h-LC50和48 h-LC50分別為5.7 g/L、1.4 g/L相比,紅裸須搖蚊對重金屬鎳的耐受能力明顯更強。從重金屬鎳脅迫下的紅裸須搖蚊幼蟲腸道中分離到7株可培養細菌,分別隸屬于沙雷氏菌屬、代爾夫特菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、不動桿菌屬、叢毛單胞菌屬,它們全部與正常飼養的紅裸須搖蚊幼蟲腸道可培養細菌重合,且能夠在含鎳培養基中正常生長。Weyens(2015)研究表明,一株假單胞菌屬細菌Pseudomonasputida對鎳離子有明顯的生物吸附作用,楊樹接種Pseudomonasputida后,使根系對鎳的吸收增加了45%,Bhattacharya等(2013)也發現了一株新的不動桿菌對鎳離子表現出一定的耐受性同時可以去除高濃度的鎳離子。對比在銅離子和鎳離子脅迫下的幼蟲腸道微生物,均可發現叢毛單胞菌科細菌的存在,表明其對兩種重金屬均有較高的抵抗能力,同時Ghosh等(2020)研究發現一株水生叢毛單胞菌Comamonasaquatica有效地減少了銅和鎳在魚體內的積累,對銅和鎳的生物富集有較好的控制作用,Staniland等(2010)的研究也表明Comamonastestosteroni對銅和鎳有抗性。

綜上所述,紅裸須搖蚊幼蟲腸道內可培養微生物在幼蟲抵抗重金屬的毒害方面發揮了不可替代的作用。紅裸須搖蚊幼蟲是重要的水質監測指示生物,探究搖蚊科昆蟲腸道微生物群落結構及特定菌株在重金屬脅迫下體現的耐受性,不僅可以為搖蚊腸道微生物資源庫的開發及個體對抗環境中不利因素提供一定的思路,也可以為從昆蟲腸道這一特殊環境中篩選出具備重金屬代謝功能的細菌資源,為水體或沉積物重金屬污染的防控奠定一定基礎。

參考文獻(Reference)

Alhou B, Micha JC, Goddeeris B. Diversity of the chironomidae(Diptera) of river Niger related to water pollution at Niamey (Niger) [J].AfricanNetworkofScientificandTechnicalInstitutions, 2012, 12 (1): 89-99.

Al-Shami SA, Che S, Hassanahmad A,etal.Distribution of Chironomidae (Insecta: Diptera) in polluted rivers of the Juru River Basin, Penang, Malaysia [J].JournalofEnvironmentalSciences, 2010, 22 (11): 1718-1727.

Bhattacharya A, Gupta A. Evaluation of Acinetobacter sp. B9 for Cr(VI) resistance and detoxification with potential application in bioremediation of heavy-metals-rich industrial wastewater [J].EnvironmentalScienceandPollutionResearch, 2013, 20 (9): 6628-6637.

Cao Y, Langdon PG, Yan Y,etal.Chironomid communities from subalpine peatlands in subtropical China as indicators of environmental change [J].JournalofPaleolimnology, 2019, 62 (4): 165-179.

Ceja-Navarro JA, Vega FE, Karaoz U,etal.Gut microbiota mediate caffeine detoxification in the primary insect pest of coffee [J].NatureCommunications, 2015, 6: 1-9.

Chen B, Du K, Sun C,etal.Gut bacterial and fungal communities of the domesticated silkworm (Bombyxmori) and wild mulberry-feeding relatives [J].TheISMEJournalEmultidisciplinaryJournalofMicrobialEcology, 2018, 12 (9): 2252-2262.

Evariste L, Barret M, Mottier A,etal.Gut microbiota of aquatic organisms: A key endpoint for ecotoxicological studies [J].EnvironmentalPollution, 2019, 248: 989-999.

Ghosh A, Saha PD. Optimization of copper bioremediation byStenotrophomonasmaltophiliaPD2 [J].JournalofEnvironmentalChemicalEngineering, 2013, 1 (3): 159-163.

Ghosh A, Ali S, Mukherjee SK,etal.Bioremediation of copper and nickel from freshwater fishCyprinuscarpiousing rhiozoplane bacteria isolated fromPistiastratiotes[J].EnvironmentalProcesses, 2020, 7 (1): 443-461.

Jia CS. Calulatiang the LC50 of insecticides with software SPSS [J].ChineseBulletinofEntomology, 2006, 43 (3): 414-417. [賈春生. 利用SPSS軟件計算殺蟲劑的LC50 [J]. 應用昆蟲學報, 2006, 43 (3): 414-417]

Jing TZ, Qi FH, Wang ZY. Most dominant roles of insect gut bacteria: Digestion, detoxification, or essential nutrient provision? [J].Microbiome, 2020, 8 (1): 38.

Li H. Toxic Effects of Copper and Cadmium Exposure onChironomusplumosusandPropsilocerusakamusi[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University Master Thesis, 2012. [李浩. 銅和鎘對羽搖蚊幼蟲(Chironomusplumosus)和紅裸須搖蚊幼蟲(Propsilocerusakamusi)的毒性效應 [D]. 武漢:華中農業大學碩士論文, 2012]

Li L, Ma GH, Liu YH,etal.Research progress on the intestinal microorganisms of silkworm [J].GuangdongSericulture, 2021, 55 (4): 1-3, 11. [李莉, 馬光皇, 劉語涵, 等. 家蠶腸道微生物的研究進展 [J]. 廣東蠶業, 2021, 55 (4): 1-3, 11]

LI XW, Xiong Z, Huang YY,etal.Diversity of cultivable bacteria in intestine from key instar larvae ofDendrolimuskikuchii[J].JournalofWestChinaForestryScinece, 2021, 50: 40-47, 77. [李選文,熊忠平,張珊, 等. 思茅松毛蟲關鍵齡期幼蟲腸道可培養細菌多樣性分析 [J]. 南方農業學報, 2021, 50: 40-47, 77]

Liu XG, Yang YJ, Liao QJ,etal. Analysis of bacterial community structure and diversity in the intestine ofCnaphalocrocismedinalis(Lepidoptera: Pyralidae) [J].ActaEntomologicaSinica, 2016, 59 (9): 965-976. [劉小改,楊亞軍,廖秋菊,等. 稻縱卷葉螟腸道細菌群落結構與多樣性分析 [J]. 昆蟲學報, 2016, 59 (9): 965-976]

Loayza-Muro RA, Marticorena-Ruiz JK, Palomino EJ,etal.Persistence of chironomids in metal polluted andean high altitude streams: Does melanin play a role? [J].EnvironmentalScienceandTechnology, 2013, 47 (1): 601-607.

Lu YX, Liu YQ, Li Q,etal.Research progress on intestinal microbial diversity of insects [J].JournalofHenanAgriculturalSciences, 2016, 45 (11): 1-7. [魯迎新,劉彥群,李群,等. 昆蟲腸道微生物多樣性研究進展 [J]. 河南農業科學, 2016, 45 (11): 1-7]

Luo MJ. Molecular Diversity Analysis of the Intestinal Bacterial Communities from AdultBactroceratau(Walker) and Their Trapping Effect [D]. Fuzhou: Fujian Agriculture and Forestry University Master Thesis, 2016. [駱米娟. 南亞實蠅成蟲腸道微生物分子多樣性分析及引誘效果 [D]. 福州:福建農林大學碩士論文, 2016]

Moubayed J, Langton PH.Chaetocladiusberythensissp. n.,C.callauensissp. n.,C.guardioleisp. n. andC.pareraisp. n., four relict species inhabiting glacial springs and streams in eastern Pyrenees and Lebanon (Diptera: Chironomidae) [J].NorwegianUniversityofScienceandTechnology(NTNU)Library, 2019, 39, 42-59.

Moubayed-Breil J, Ashe P.Rheocricotopus(s. str.)costaisp. n. andR. (s. str.)pyrenaeussp. n., two relict species from glacial rheocrenes and streams in corsica and the eastern pyrenees (Diptera: Chironomidae, Orthocladiinae) [J].TrakyaUniversityJournalofNaturalSciences, 2019, 20 (1): 35-46.

Pinho LC, Andersen T. NeotropicalNilothaumaKieffer, 1921 (Diptera, Chironomidae): Key, eleven new species, re-descriptions, new combination and new records [J].ZooKeys, 2021, 1033: 81-125.

Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees [J].MolecularBiologyandEvolution, 1987, 4 (4): 406-425.

Staniland S, Coppock M, Tuffin M,etal.Cobalt uptake and resistance to trace metals inComamonastestosteroniisolated from a heavy-metal contaminated site in the Zambian Copperbelt [J].GeomicrobiologyJournal, 2010, 27 (8): 656-668.

Strand MR. Composition and functional roles of the gut microbiota in mosquitoes [J].CurrentOpinioninInsectScience, 2018, 28: 59-65.

Sugimaru K, Kawai K, Imabayashi H. A new marine chironomid species of the genusTanytarsus(Diptera: Chironomidae) from Okinawa, Japan [J].ThePlanktonSocietyofJapan,TheJapaneseAssociationofBenthology, 2008, 3 (4): 240-242.

Sun BT, Lan BM, Wang Q,etal.Isolation and preliminary functional analysis of the larval gut bacteria fromSpodopteralitura[J].BioticResources, 2017, 39 (4): 264-271. [孫博通,藍波妙,王倩,等. 斜紋夜蛾幼蟲腸道細菌分離鑒定及其功能初步分析 [J]. 生物資源, 2017, 39 (4): 264-271]

Tamura K, Stecher G, Peterson D,etal.MEGA6: Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 [J].MolecularBiologyandEvolution, 2013, 30 (12): 2725-2729.

Tian WL, Hou GL, Zhang YL,etal. Research progress in morphological deformities of chironomid larvae induced by contaminants in water and sediments [J].ChineseJournalofEcology, 2021 ,40 (12): 4069-4080. [田文龍,侯桂林,張瑗玲,等. 水相及沉積物固相污染物作用下搖蚊幼蟲口器畸形研究進展 [J]. 生態學雜志, 2021, 40 (12): 4069-4080]

Wang HM. The Regulatory Mechanism of Bacterial Heavy Metal and Antibiotic Resistance Mediated by Montmorillonite upon Cadmium Stress [D]. Guangzhou: South China University of Technology Master Thesis, 2020. [王慧敏. 鎘脅迫下蒙脫石對細菌重金屬及抗生素抗性機制調控研究 [D]. 廣州:華南理工大學碩士論文,2020]

Wang WQ. Lead Tolerance and Transport Mechanism inMuscadomestica[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University Master Thesis, 2021. [王婉強. 家蠅對鉛的耐受性及轉運機制研究 [D]. 武漢:華中農業大學碩士論文,2021]

Weyens N, Beckers B, Schellingen K,etal.The potential of the Ni-Resistant TCE-degradingPseudomonasputidaW619-TCE to reduce phytotoxicity and improve phytoremediation efficiency of poplar cuttings on a Ni-TCE co-contamination [J].InternationalJournalofPhytoremediation, 2015, 17 (1-6): 40-8.

White KB, Liber K. Chronic toxicity of surface water from a canadian oil sands end pit lake to the freshwater invertebratesChironomusdilutusandCeriodaphniadubia[J].ArchivesofEnvironmentalContaminationandToxicology, 2020, 78 (3): 439-450.

Winner W, Boesel MW, Farrell MP. Insect community structure as an index of heavy-metal pollution in lotic ecosystems [J].CanadianJournalofFisheriesandAquaticSciences, 1980, 37 (4): 647-655.

Wu N, Wang X, Xu X,etal.Effects of heavy metals on the bioaccumulation, excretion and gut microbiome of black soldier fly larvae (Hermetiaillucens) [J].EcotoxicologyandEnvironmentalSafety, 2020, 192: 110323.

Wu Y, Zheng Y, Chen Y,etal.Honey bee (Apismellifera) gut microbiota promotes host endogenous detoxification capability via regulation of P450 gene expression in the digestive tract [J].MicrobialBiotechnology, 2020, 13 (4): 1201-1212.

Xiang H, Huang YP. Symbiosis between gut microbiota and insects [J].ChineseBulletinofEntomology, 2008, 45 (5): 687-693. [相輝, 黃勇平. 腸道微生物與昆蟲的共生關系 [J]. 昆蟲知識,2008,45 (5): 687-693]

Yan BP. The Toxicity Effect of Ni, Hg and PCP toChironomusLarva. [D]. Qingdao: Qingdao University of Science and Technology Master Thesis, 2006. [閆賓萍. 鎳、汞和五氯酚對搖蚊幼蟲的毒性作用 [D]. 青島:青島科技大學碩士論文,2006]

Yang H, Huang YP. Insect microbiome: As guardians of insect health and adaptation [J].ActaMicrobiologicaSinica, 2018, 58 (6): 961-963. [楊紅, 黃勇平. 昆蟲微生物組:昆蟲健康和適應的守護者 [J]. 微生物學報, 2018, 58 (6): 961-963]

Young E, Carey M, Meharg AA,etal.Microbiome and ecotypic adaption ofHolcuslanatus(L.) to extremes of its soil pH range, investigated through transcriptome sequencing [J].Microbiome, 2018, 6 (1): 48.

Zhang YL, Lv BQ, Yang F,etal.Isolation, identification and functional analysis of intestinal micro-organisms ofBrontispalongissimiGestro [J].ChineseJournalofTropicalCrops, 2021, 42 (4): 1066-1070. [章雨璐,呂寶乾,楊帆,等. 椰心葉甲腸道微生物的分離鑒定及功能分析 [J]. 熱帶作物學報, 2021, 42 (4): 1066-1070]

Zhao CC. The Biodiversity of Helicoverpa Armigera Symbiotic Bacteria and Its Regulatory Effects on the Defense Response in Cotton [D]. Huazhong Agricultural University Master Thesis, 2020. [趙晨晨. 棉鈴蟲共生菌多樣性及對棉花防御反應的調控作用 [D] 武漢:華中農業大學碩士論文,2020]

Zhou D, Zhang W, Zhu LM,etal.Community structure of Chironomid larvae and their indicative significance for water quality in streams of Xianju National Park,China [J].ChineseJournalofAppliedEcology, 2018, 29 (11): 3857-3866. [周東, 張瑋, 朱利明,等. 仙居國家公園溪流搖蚊幼蟲群落結構及其對水質的指示作用 [J]. 應用生態學報, 2018, 29 (11): 3857-3866]

Zhou F, Pang ZC, Yu XQ,etal. Insect gut microbiota research: Progress and applications [J].ChineseJournalofAppliedEntomology, 2020, 57 (3): 600-607. [周帆,龐志倡,余小強,等. 昆蟲腸道微生物的研究進展和應用前景 [J]. 應用昆蟲學報, 2020, 57 (3): 600-607]

附錄圖1 實驗室馴化的紅裸須搖蚊幼蟲腸道可培養細菌菌落

圖2 實驗室馴化的紅裸須搖蚊幼蟲腸道可培養細菌革蘭氏染色結果

表1 紅裸須搖蚊幼蟲腸道可培養細菌菌落特征

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