novel-m0287-3p調控斜紋夜蛾中腸蛻皮激素受體的表達

鐘其恩,岑永杰,馬 康,彭亞楠,鄭思春

(華南師范大學生命科學學院昆蟲科學與技術研究所,廣州市昆蟲發育調控與應用研究重點實驗室,廣州 510631;梅州市華師昆蟲發育生物學與應用技術重點實驗室廣梅園研發中心,廣東梅州514779)

1993年,Ambros和Lee等人在線蟲Caenorhabditidelegans中發現了第一個miRNA(lin-4),它通過調控胚胎后期的發育基因lin-14從而調控了線蟲幼蟲從L1期到L2期的轉換。在此后的一年中,又相繼發現了100多個有關人類細胞、果蠅drosophilid以及線蟲的非編碼小分子RNA,掀起了miRNA研究的浪潮(Leeetal., 1993; Reinhartetal., 2000; Chenetal., 2004; Zhouetal., 2009)。而miRNA的生物合成受到嚴格的調控,其表達具有組織和時空特異性的特點。一個miRNA成熟體的形成主要經歷4個階段:miRNA基因首先在RNA聚合酶II的作用下形成約為1 000 bp左右的初級轉錄產物pri-miRNA,該產物具有帽子結構和Poly A尾巴,二級結構呈長發卡結構(Cullen, 2004; Leeetal., 2004; Kimetal., 2005)。接著pri-miRNA在Drosha酶作用下,形成具有70 bp左右不完全互補配對的莖環結構的miRNA前體(pre-miRNA)(Lundetal., 2004; Lucas and Raikhel, 2013)。細胞核內的pre-miRNA經轉運蛋白復合物運送到細胞質后,由Dicer酶識別并剪切形成長度22 bp左右的雙鏈miRNA。雙鏈miRNA分子中較穩定的一條鏈通過與基因沉默復合體RISC結合,最終組裝成與靶基因結合的miRNP復合物(Martinezetal., 2002; Yietal., 2003; Miskaetal., 2005; Bartel, 2009; Marcoetal., 2010)。

在生物體內,miRNA與靶基因之間的關系并非簡單的專一關系,靶基因和miRNA相互結合的位點可以是單個也可以是多個,兩者的調控關系復雜且精密(Shenetal., 2008; Formanetal., 2008; Duursmaetal., 2008; Brodersen and Voinnet, 2009; Shinetal., 2010)。研究表明,miRNA 5′端可以通過完全和不完全的配對方式,結合到靶基因mRNA的非編碼區(UTR)或者編碼區(CDS),從而發揮其對基因調控的功能(Wightmanetal., 1993; Leeetal., 1993; Lytleetal., 2007; Orometal., 2008; Shenetal., 2008)。一般認為,當以完全互補配對的形式結合時,miRNA通過降解mRNA而下調靶基因的表達;當以不完全互補配對的形式結合時,miRNA則通過抑制mRNA翻譯而抑制基因表達(Buchan and Parker, 2007; Lelandaisetal., 2010)。此外,miRNA調控基因表達的方式可以是正調控或負調控,在不同的細胞周期,這種調控具有不同的效應。如在G1/G0阻滯期,miRNA啟動基因的表達;而在細胞分裂期,它們抑制基因的表達。miRNA的這種激活和抑制效應在細胞周期中可持續切換(Vasudevan and Steitz, 2007; Vasudevanetal., 2007; Orometal., 2008)。

昆蟲的生長與發育主要受到蛻皮激素和保幼激素兩大激素的協同調控,miRNA也參與了這些重要的生命過程的調控。在果蠅的幼蟲末期和預蛹期,體內高滴度的蛻皮激素誘導let-7、miR-100和miR-125的表達,同時抑制miR-34的表達,而保幼激素的作用則剛好相反(Bashirullahetal., 2003; Sempereetal., 2003)。另一方面,蛻皮激素能夠通過抑制miR-14的表達而增強其信號強度,更有利于調控變態發育(Varghese and Cohen, 2007)。在家蠶Bombyxmori中,miR-281能夠抑制蛻皮激素受體B構型的表達,所以miR-281在幼蟲蛻皮階段時期維持在一個較高的水平;而在家蠶化蛹階段,受蛻皮激素的影響,miR-281表達量降低(Jiangetal., 2013)。在斜紋夜蛾中,miR-14-3p通過靶向蛻皮激素級聯基因ECR和E75而參與調控蛻皮激素信號通路(Luoetal., 2020)。然而,未見有novel miRNA參與調控蛻皮激素信號通路的報道。

基于miRNA在調控昆蟲的生命過程中的重要作用,實驗室對斜紋夜蛾幼蟲中腸和頭部組織的miRNA進行了深度測序與建庫,總共發現了530個 miRNA,其中包含了413個新的miRNA,占總數的77.92%(Zouetal., 2020)。為了進一步研究這些大量的novel miRNA在斜紋夜蛾體內的功能與調控機制,選擇其中一個表達量較高的novel-m0287-3p作為研究對象,并利用生物信息學與分子生物學實驗相結合的方法進行相關研究。結果表明,novel-m0287-3p在斜紋夜蛾體內通過調控蛻皮激素受體而影響發育,可能是潛在的防治害蟲的核酸分子,具有重要的應用價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1供試昆蟲

實驗所用的斜紋夜蛾幼蟲和Spli-221細胞株來自中山大學昆蟲研究所。斜紋夜蛾幼蟲在溫度27±1℃、相對濕度70%±5%和光周期12 h光照∶12 h黑暗條件下,采用人工飼料飼養。而Spli-221細胞株在含有10%胎牛血清(FBS)昆蟲培養基(SF-900 Ⅲ SFM, GIBCO,Invitrogen,USA)中于28℃恒溫培養,每隔2～3 d觀察細胞生長狀況,并以1∶3的比例稀釋培養基后傳代培養。

1.1.2實驗主要試劑

Taq酶/Ex-Taq DNA聚合酶、DNA限制性內切酶、T4連接酶、pMD′18-T載體、dNTP、RT-PCR試劑盒、熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司(中國);質粒提取試劑盒及Gel Extraction Kit分別為美國Omega和美國Axygen公司的產品;FuGENE?HD轉染試劑及熒光素酶的檢測試劑盒Dual Luciferase kit購自美國Promega公司;用于細胞培養的胎牛血清和優化培養基Opti-MEM以及SF900-Ⅲ(GIBCO,美國)培養基購自Life公司(美國)。novel-m0287-3p mimic和novel-m0287-3p agomir (模擬體類似物)及陰性對照NC (negative control,序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU TT-3′,為無義小片段)均由上海吉瑪基因股份有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1總RNA及蛋白的提取

總RNA的提取按照TaKaRa公司的RNA抽提試劑盒(Trizol Reagent)的方法并加以優化。向組織材料中加入1 mL Trizol Reagent并充分研磨后于冰上靜置5～10 min,繼而加入氯仿∶異戊醇=24∶1(V/V)200 μL,劇烈震蕩15 s后冰上放置10 min,于12 000 rpm和4℃離心20 min。將上層水相轉移到新的離心管中,加入等體積預冷異丙醇,上下顛倒混勻,-20℃放置30 min。再次離心20 min,棄上清。加入600 μL 75%乙醇上下顛倒洗滌RNA,離心5 min,棄上清。重復上述洗滌步驟一次。開蓋于室溫晾干沉淀15 min,最后用DEPC水溶解RNA,保存于-80℃。

1.2.2反轉錄

根據TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書進行mRNA的反轉錄。miRNA的反轉錄采用加尾法,miRNA首先在polyA聚合酶的作用下合成聚腺苷酸尾巴,再由oligo-dT逆轉錄引物反向合成cDNA。具體步驟參考TaKaRa公司的Mir-XTMmiRNA First-Strand Synthesis and SYBR?qRT-PCR試劑盒說明書操作。

1.2.3實時熒光定量PCR(qPCR)分析

qPCR實驗按照TaKaRa公司的2×SYBR?Premix EX TaqTMKit試劑盒的說明書進行。當用目的組織mRNA的cDNA作為qPCR模板時,以斜紋夜蛾核糖體蛋白49基因(ribosomal protein 49 gene,rp49) (GenBank登錄號: XM_022963351)為內參基因。反應條件為:95℃預變性5 min,1個循環;95℃ 5 s,60℃ 20 s,40個循環;最后95℃ 60 s;50℃ 30 s;95℃ 30 s,1個循環。miRNA引物設計用premier 5.0軟件完成,本研究使用相關PCR的引物序列如表1所示。

表1 本研究所使用的引物

1.2.4細胞轉染及熒光素酶檢測

轉染前一天,將1 mL密度為2×105/mL的斜紋夜蛾Spli-221細胞加入12孔板的單孔中,培養細胞至密度達到80%～95%后進行轉染。轉染時,每孔用50 μL Opti-MEM培養基稀釋1 μg質粒/0.5 μg模擬體(mimics)和3 μL的FuGENE?HD轉染試劑,充分混勻并于室溫放置10～15 min;定時收集細胞用于檢測。用于構建雙熒光素酶檢測的psicheck-2載體(Promega,美國)內部含有LUC(螢火蟲熒光素酶)和RLUC(海腎熒光素酶)基因,將斜紋夜蛾EcRb13′UTR的兩個靶位點片段分別構建到海腎熒光素酶基因的3′UTR區域后,將載體分別與novel-m0287-3p mimics和NC mimics共轉染Spli-221細胞,使用Promega公司的Dual Luciferase kit試劑盒檢測熒光素酶活性。

2 結果與分析

2.1 novel-m0287-3p的鑒定及其靶基因預測與分析

實驗室前期通過對斜紋夜蛾幼蟲的中腸和頭部組織中miRNA的測序、建庫和分析,獲得了一系列miRNA序列(Zouetal., 2020)。本研究選擇了一個含量較高的novel-m0287-3p作為研究對象。為了開展其功能研究,首先確定novel-m0287-3p是否是一個新的miRNA。通過RNAfold(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold. cgi)分析,發現novel-m0287-3p前體的二級結構符合miRNA前體二級結構特征,具有典型的莖環結構(圖1-A)。novel-m0287-3p前體序列為:5′-AAATGCAAATTGTTGAATACATGACAAAATCCTGTA ATAGCATACATCATGATTTTGTCAAGTATTTCGCAAT TTTTATTC-3′,novel-m0287-3p成熟體序列(5′-TGATTTTGTCAAGTATTTCGCA-3′)位于發夾結構的一個莖區,長度為22 bp,這與已知動物體內Dicer酶的加工特征相一致。隨后將novel-m0287-3p成熟體序列與miRBase數據庫(miRBase, http://www.mirbase.org)中已知的miRNA進行比對(圖1-B),未發現有相似的miRNA。由此,可以確定novel-m0287-3p為新的miRNA。

圖1 novel-m0287-3p前體二級結構預測及與miRBase數據庫比對結果Fig.1 Prediction of the secondary structure of novel-m0287-3p precursor and the results of comparison in the miRBase database注:A,novel-m0287-3p前體的二級結構;B,novel-m0287-3p成熟體序列在miRBase數據庫中比對的結果。Note: A,Secondary structure of the novel-m0287-3p precursor; B, Results of the novel-m0287-3p mature sequence alignment in the miRBase database.

2.2 novel-m0287-3p對斜紋夜蛾生長發育的影響

為了研究novel-m0287-3p對斜紋夜蛾生長發育的影響,分別選取斜紋夜蛾4齡第1天以及6齡第3天生長狀況相一致的幼蟲進行體腔注射novel-m0287-3p agomir(模擬體類似物)。每頭幼蟲注射10 μg agomir。與對照組相比,4齡第1天的幼蟲注射novel-m0287-3p agomir后,其體重增長明顯減慢,說明其生長受到抑制(圖2-A);而novel-m0287-3p agomir處理后的6齡幼蟲化蛹發生滯后(圖2-C),與正常蟲相比較,蟲的發育延緩一天進入蛹期。綜合以上結果,推測novel-m0287-3p可能參與調控營養代謝,致使斜紋夜蛾生長緩慢;也可能直接參與調控蛻皮激素信號通路,而影響斜紋夜蛾蛻皮及變態發育。

圖2 注射novel-m0287-3p對斜紋夜蛾4齡和6齡幼蟲發育的影響Fig.2 Effects of novel-m0287-3p injection on the development of the 4th instar (A) and the 6th instar (B) of Spodoptera litura注:A,注射novel-m0287-3p后4齡幼蟲的體重變化;B,4齡幼蟲注射novel-m0287-3p 72 h后的表型變化;C,注射novel-m0287-3p后對6齡幼蟲化蛹的影響;(1),6齡第4天;(2),6齡第5天;(3),6齡第6天;(4),蛹期;NC,模擬體的陰性對照;novel-m0287-3p,novel-m0287-3p模擬體類似物。Note: A, Changes in body weight of 4th instar larvae after injection of novel-m0287-3p; B, Phenotypic changes of 4th instar larvae injected with novel-m0287-3p for 72 h; C, Effects of injection of novel-m0287-3p on pupation of 6th instar larvae; (1), 6LD4; (2), 6LD5; (3), 6LD6; (4), Pupation; NC, Negative control; novel-m0287-3p, novel-m0287-3p agomir; L, Larval; D, Day.

2.3 預測ECR是novel-m0287-3p的靶基因

由于novel-m0287-3p延后了幼蟲的蛻皮,因此分析novel-m0287-3p是否可能靶向蛻皮激素信號通路基因。蛻皮激素信號通路中的關鍵基因蛻皮激素受體存在兩種構型EcRA(XM_022963763)和EcRb1(XM_022963759),并且兩種構型的3′UTR是一樣的(Luoetal., 2020)。通過PITA和RNAhybrid兩個軟件分析發現,novel-m0287-3p在EcRb1的3′UTR中可能存在兩個結合位點,分別處于3′UTR上的3 055及4 195位點(圖3-A、B)。

圖3 novel-m0287-3p在EcRb1 3′UTR的兩個結合位點Fig.3 Two binding sites in the EcR 3′UTR for novel-m0287-3p

將預測得到的2個長度為100 bp、包含了可能與novel-m0287-3p結合位點的EcR3′UTR片段克隆到psi-check2質粒中,并與合成的novel-m0287-3p模擬物共轉染到Spli-221細胞中。如果novel-m0287-3p能結合到上面預測靶位點,則novel-m0287-3p進入到細胞后,海腎熒光素酶mRNA會被降解或者抑制翻譯,海腎熒光素酶的活性因而降低。結果顯示,與對照組相比,海腎熒光素酶活性降低(圖4-A、B),說明novel-m0287-3p能與靶基因EcR3′UTR結合,負調控靶基因EcRb1的表達。

圖4 novel-m0287-3p作用EcR 3′UTR的雙熒光素酶活性測定Fig.4 Determination of dual luciferase activity with theEcR 3′UTR regulated by novel-m0287-3p注:A,novel-m0287-3p與EcR 3′UTR上的3 055位點作用后的熒光強度;B,novel-m0287-3p與EcR 3′UTR上的4 195位點作用后的熒光強度;NC,模擬體類似物的陰性對照;novel-m0287-3p,novel-m0287-3p模擬體類似物;**表示同一處理時間處理組與對照組間差異顯著P<0.01;***表示差異極顯著P<0.001,獨立樣本t檢驗。Note:A, Fluorescence intensity of novel-m0287-3p interacting with site 3 055 on EcR 3′UTR; B, Fluorescence intensity of novel-m0287-3p interacting with site 4 195 on EcR 3′UTR; NC, Negative control; novel-m0287-3p, novel-m0287-3p mimics; ** showed significantly difference between treatments and control groups by student’s t test at 0.01 level; ***showed significantly difference between treatments by student’s t test at 0.001 level.

2.4 novel-m0287-3p和EcRb1在中腸中表達

為了進一步研究novel-m0287-3p和EcR在蟲體中的關系,選取齡期最長的6齡幼蟲作為研究對象,分別提取6齡第1天、第3天及第5天的斜紋夜蛾不同組織(頭部、中腸、脂肪體和表皮)的總RNA,反轉錄后通過實時熒光定量PCR分析兩者轉錄水平,分別以snRNAU6和rp49作為novel-m0287-3p和EcRA、EcRb1的內參基因。結果顯示,在斜紋夜蛾6齡幼蟲的這3個時期的組織表達譜中,novel-m0287-3p都在中腸具有最高的表達量,而在其他組織幾乎無表達,表明novel-m0287-3p主要是在中腸調控相關基因表達(圖5-A);相同地,EcRb1在中腸中的表達量也比其他組織高,而EcRA在中腸的表達量相對較低,說明EcRb1為中腸EcR的主要表達形式(圖5-B、C)。表達譜分析的結果暗示兩者在斜紋夜蛾中腸可能存在互作關系。

圖5 novel-m0287-3p與EcRb1在斜紋夜蛾幼蟲的不同組織的表達譜分析Fig.5 novel-m0287-3p and EcRb1expression levels at different tissues of Spodoptera litura larvae注:A,novel-m0287-3p在各個組織的相對表達量;B,EcRb1在各個組織的相對表達量;C,EcRA在各個組織的相對表達量;L,幼蟲期;D,天;FB,脂肪體;MG,中腸;HD,頭部;EP,表皮。Note:A, Relative expression of novel-m0287-3p in various tissues; B, Relative expression of EcRb1 in various tissues; C, Relative expression of EcRA in various tissues; L, larva; D, day; FB, Fat body; MG, Midgut; HD, Head; EP, Epidermis.

2.5 novel-m0287-3p抑制EcRb1表達

蟲體內novel-m0287-3p與EcRb1表達譜的結果暗示了novel-m0287-3p可能調控EcRb1表達。為了進一步研究兩者間的關系,選取4齡第1天、生長狀況一致的斜紋夜蛾幼蟲進行體腔注射novel-m0287-3p,每頭幼蟲注射10 μg miRNA。注射novel-m0287-3p 72 h后檢測中腸的EcRb1表達水平。結果顯示,注射novel-m0287-3p后,斜紋夜蛾中腸EcRb1的mRNA水平發生下調(圖6)。說明novel-m0287-3p能夠抑制斜紋夜蛾幼蟲EcRb1的表達。

圖6 注射novel-m0287-3p后斜紋夜蛾中腸的EcRb1表達水平分析Fig.6 Analysis of EcRb1 mRNA level in the Spodopteralitura midgut after novel-m0287-3p injection注:NC,模擬體類似物的陰性對照;novel-m0287-3p,novel-m0287-3p模擬體類似物;*表示同一處理時間處理組與對照組間差異顯著P<0.05,獨立樣本t檢驗。Note:NC, negative control;novel-m0287-3p, novel-m0287-3p mimics; *showed significantly difference between treatments and control groups by student’s t test at 0.05 level.

3 結論與討論

斜紋夜蛾的miRNA數據庫表明蟲體中存在大量novel miRNA(Zouetal., 2020),其功能不詳。而miRNA的鑒定方法主要有3種:克隆構建cDNA文庫法,生物信息學預測和高通量測序法。在研究早期為了尋找和鑒定未發現的miRNA,主要通過克隆技術構建cDNA文庫,基因克隆適合生物體內豐度較高miRNA的研究,而對于那些只在某些特定組織和細胞表達或者表達量低的miRNA則不適合(Chenetal., 2008; Zhouetal., 2009)。本研究在實驗室前期對斜紋夜蛾幼蟲中腸組織的miRNA高通量測序的基礎上,選擇其中一個本底表達量比較高的novel-m0287-3p進行了序列鑒定和功能研究。通過RNAfold分析novel-m0287-3p的前體結構,并將其成熟體序列與miRBase數據庫的miRNA比對,確定novel-m0287-3p是一個全新的miRNA(圖1)。

目前,用來進行miRNA靶基因預測的生物信息學網站和軟件多種多樣,但主流的主要有以下幾種:TargetScanS、miRanda、PITA、RNAhybrid。盡管每個軟件之間的算法不盡相同,但遵循的原理基本一致,大體上分為以下幾點:(1)miRNA與靶基因結合形成二級結構間的熱力學穩定性;(2)miRNA種子區域和靶基因的互補性;(3)靶基因及其靶位點在同源物種中的保守性;(4)miRNA與靶基因結合形成二級結構的復雜程度(Lewisetal., 2004;John, 2004;Krüger and Rehmsmeier, 2006)。本實驗使用PITA和RNAhybrid兩個在線軟件共同對novel-m0287-3p進行靶基因預測,求其交集基因以提高結果的精準度。預測發現novel-m0287-3p可能靶向蛻皮激素信號通路基因EcRb1(圖3)。

為了進一步探究novel-m0287-3p的功能,本研究通過采用基因沉默技術,用novel-m0287-3p模擬體類似物分別注射4齡與6齡幼蟲,皆得到了幼蟲生長發育受到抑制的結果(圖2),并且發現在這些蟲中的EcRb1表達量下降(圖6)。進一步通過雙熒光素酶報告系統證明了novel-m0287-3p結合于EcRb13′UTR的兩個位點(圖4)。表明EcRb1是novel-m0287-3p的靶基因之一。蛻皮激素是調控昆蟲蛻皮與變態發育的重要因素,其受體EcR的表達下降將導致昆蟲不能正常蛻皮而生長延緩,甚至死亡。因此,本研究證明了novel-m0287-3p在調控昆蟲發育中的功能,同時也證明了斜紋夜蛾中所存在的大量novel miRNA是具有功能的。

已有研究表明miRNA調控EcR的表達。在家蠶中,馬氏管特異性表達的miR-281調控靶標基因Bm-EcR的表達(Jiangetal., 2013);在果蠅中,miR-14通過靶向基因EcR而調控蛻皮激素信號通路(Varghese and Cohen, 2007);在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera中,針對靶基因Ha-EcR設計的人造miRNA可以影響棉鈴蟲的正常生長和產卵量(Yogindran and Manchikatla, 2016)。本研究的結果表明novel-m0287-3p通過結合3′UTR而調控EcR的表達。這些結果表明了不同物種中的EcR受不同miRNA的調控。由于每個基因有可能受多個miRNA的調控,因此,僅novel-m0287-3p不能完全抑制EcR的表達(圖6),這可能是注射novel-m0287-3p不能完全控制斜紋夜蛾蛻皮的原因(圖2)。同時,通過預測,本研究發現novel-m0287-3p可能靶向相關營養代謝通路基因。因此,注射novel-m0287-3p后的斜紋夜蛾發育延緩也可能是營養代謝受到影響的緣故,這需要后續實驗的進一步驗證。

本研究中利用熒光定量PCR的方法分析了novel-m0287-3p和EcRb1的時空表達譜(圖5),發現novel-m0287-3p具有中腸特異性表達的特點,表明novel-m0287-3p在主要是在中腸調控靶基因而發揮作用,可能調控EcR在中腸的表達量較高的基因EcRb1。兩者的時空表達譜以及結合實驗表明兩者在中腸發生關系,而調控圍食膜的發育。通過向斜紋夜蛾幼蟲血淋巴注射novel-m0287-3p agomir及其陰性對照NC agomir,并對中腸中EcRb1的mRNA表達量進行檢測后發現,與對照相比,注射novel-m0287-3p后斜紋夜蛾體內EcRb1的mRNA水平發生下調,說明所注射的novel-m0287-3p能夠運輸至中腸,抑制中腸內EcRb1的表達。

綜上所述,本研究通過表達譜分析、結合實驗和敲除實驗,證明了novel-m0287-3p對斜紋夜蛾中腸EcRb1表達的調控,從而證明了novel-m0287-3p在斜紋夜蛾發育中的功能。