江西新崗山森林昆蟲種內遺傳距離研究

馬 奉,周青松,曹煥喜,陳婧婷,4,王明強,5,謝婷婷,楊娟娟,4,陶雙倫,張 峰,羅阿蓉*,朱朝東,4

(1. 吉首大學生物資源與環境科學學院,湖南吉首 416000;2. 中國科學院動物研究所動物進化與系統學(院)重點實驗室,北京 100101;3. 中國科學院動物研究所國家動物標本資源庫,北京 100101;4. 中國科學院大學生命科學學院,北京 100049;5. 中國科學院成都生物 研究所山地生態恢復與生物資源利用重點實驗室與生態恢復生物多樣性保護四川省重點實驗室,成都 610041;6. 南京農業大學植物保護學院,南京 210095)

昆蟲種類繁多,生物學特性復雜多樣,在生態系統中發揮著植食、分解、傳粉、寄生、捕食等服務功能,是生物多樣性的重要組成部分,在生態系統中占有重要地位(彩萬志等, 2011;Kunin, 2019;王明強等, 2022)。準確、快速地進行物種鑒定是昆蟲生物多樣性監測評估等研究的基礎(Dayrat, 2005)。在DNA分類學出現以前,昆蟲分類學家在發現和描述物種時通?；谛螒B學特征,不僅耗時、費力,而且需要長時間形態學知識和經驗的積累(Hongetal., 2022; Zhuetal., 2022)。因此,面對大量昆蟲物種鑒定需求,形態分類學在描述昆蟲物種多樣性時往往很難提供高效、及時的支撐(Hebertetal., 2003; Yuetal., 2012)。此外,雌雄二型、變態發育、表型可塑與遺傳可變性等問題,還會導致模棱兩可甚至相互矛盾的鑒定結果(Knowlton, 1993; Jarman and Elliott, 2000; Hebertetal., 2003)。因此,加強對多類群和大樣本量物種界定方法的探索,提升昆蟲分類學效率,在昆蟲多樣性研究工作中顯得非常重要而緊迫。

本世紀初以來,DNA條形碼(DNA barcoding)技術為分類學研究提供了新的技術支撐,促使昆蟲物種鑒定和多樣性監測方法更加經濟、高效,極大地提升了對已知物種、研究尚不充分或有待發現類群的物種界定效力(Hebertetal., 2003)。該技術利用標準化的基因片段作為分子標記,基于種內遺傳距離小于種間遺傳距離的原則,在很多類群中實現物種識別及鑒定(Hebertetal., 2003; Hebert and Gregory, 2005)。選取合適的分子標記是使用DNA條形碼開展物種鑒定的關鍵因素(Waugh, 2007; Luoetal., 2011)。相較于核基因,線粒體基因具有母系遺傳、進化速率快、基因重組率發生率低等特點(劉青青和董志軍, 2018)。其中,線粒體細胞色素C氧化酶亞基I基因(Cytochromecoxidase subunit I, 簡稱COI)不存在內含子,在保證足夠變異的情況下,容易被通用引物擴增,被普遍用作動物各類群的通用條形碼區域(Hebertetal., 2003)。目前,基于COI基因的DNA條形碼在昆蟲物種鑒定、隱存種發現及種間互作關系等研究中已得到廣泛應用和驗證。例如:Hebert等(2004a)利用DNA條形碼對哥斯達黎加鱗翅目弄蝶科昆蟲Astraptesfulgerator的研究,發現了隱存種;Pentinsaari等(2014)對北歐1 872個甲蟲的COI條形碼區域進行了測序和有效識別,加速了甲蟲新物種的發現;Wang等(2020, 2021)利用COI基因對大量鱗翅目幼蟲進行了物種界定,進一步闡明了植食性昆蟲與植物之間的互作關系。此外,部分學者甚至單獨應用DNA條形碼開展昆蟲分類研究(Meierottoetal., 2019; Sharkeyetal., 2021)。

隨著基因組測序技術的發展,DNA宏條形碼(DNA metabarcoding)作為DNA條形碼技術的拓展,已經在一定程度上克服了物種多樣性研究中的取樣瓶頸,能解決易獲得但形態較難區分的昆蟲及土壤、水體等環境樣品分析中的問題(Thomsen and Willerslev, 2015; Deineretal., 2017; 高養春等, 2020)。不過,盡管新的技術在測序通量和效率等方面有了大幅提升,DNA宏條形碼在數據產生過程中容易受PCR擴增偏差、測序深度等因素的影響;其后續的數據處理需要較復雜的生物信息學分析;所獲數據在物種注釋過程中能鑒定到的物種水平也依賴于物種數據庫的建立和完整性(Yuetal., 2012; 王萌等, 2021)。因此,DNA宏條形碼所恢復的生物多樣性信息,仍然可能與實際情況存在較大偏差。相比之下,DNA條形碼在物種鑒定準確性、高效性等方面依然具有綜合優勢,在昆蟲物種鑒定和生物多樣性研究中仍占據重要地位(Zahirietal., 2017; DeSalle and Goldstein, 2019; Wangetal., 2020; Wangetal., 2021)。

長期以來,昆蟲DNA條形碼研究工作大多局限于某個具體類群,因此其對不同昆蟲類群物種多樣性評估的功效一直存在爭議。例如,Meier等(2006)利用1 333條COI序列,對449種雙翅目昆蟲進行了分子分類學研究,獲得了較低的物種鑒定成功率(<70%);不過,Ashfaq等(2018)在利用DNA條形碼開展多樣性調查中,則發現雙翅目具有較高的物種分辨率(92%)。又如:Hebert等(2003)曾提出鱗翅目昆蟲的物種區分閾值為3%;蜉蝣目、毛翅目的有效閾值卻為2% (Zhouetal., 2010; Webbetal., 2012)。本研究對來自中國江西新崗山的昆蟲樣品開展DNA條形碼研究,比較不同類群所獲MOTU(Molecular operational taxonomic unit)的種內遺傳距離,期望進一步闡釋DNA條形碼在不同昆蟲類群的作用功效。

1 材料與方法

1.1 研究地點和樣本

采樣地點位于我國江西省新崗山,其為中國亞熱帶森林生物多樣性與生態系統功能實驗樣地(Biodiversity-ecosystem functioning experiment China, 簡稱BEF-China)(29°08′～29°11′N、117°90′～117°93′E)(馬克平, 2013);其地處亞熱帶,年平均氣溫16.7℃,年均降雨量1 821 mm,具典型的季風氣候(Yangetal., 2013; Bruelheideetal., 2014)。

本研究于2020年利用馬來氏網在BEF-China樣地中采集昆蟲標本,并保存在無水乙醇中。從所獲樣品中隨機選取5瓶樣品,手動分揀其中昆蟲個體。鑒于DNA提取、易操作性等因素,本研究僅選取個頭較大的個體(體長>0.5 cm),以建立方法流程。隨后,按形態特征將所選樣品初步分成不同的類群(即非嚴格的“形態種”),并對每個類群選取1～3頭用無水乙醇沖洗,再分別取腿置于離心管中保存于-20℃下用于DNA提取。

1.2 DNA提取和PCR擴增

首先將樣品取出并在室溫下晾干殘余酒精,再用液氮速凍后研磨。使用天根生化科技(北京)有限公司或凱杰(QIAGEN GmbH, Hilden, Germany)公司提供的血液和組織DNA提取試劑盒提取全基因組DNA,具體實驗步驟參照相應試劑盒說明書操作。所提取的基因組DNA于-20℃保存。

本研究所有聚合酶鏈式反應(PCR)均使用LongGene PCR儀進行擴增。PCR總體系為30 μL:15 μL Premix PrimeSTAR HS (TaKaRa),正反引物(10 μM)各1 μL,ddH2O 10 μL ,DNA模板3 μL。針對擴增目標,即線粒體COI基因5′端長度為658 bp區域,首選通用引物LCO1490和HCO2198(Folmeretal., 1994),其具體反應程序見表1。對于以上程序擴增不成功的,則采用引物LCO1490和HCOout(Carpenter and Wheeler, 1999),并結合PCR反應程序Ⅵ(PCR Ⅵ,表1)(Huangfuetal., 2022)進行擴增。

表1 PCR使用引物及反應程序

取6 μL PCR產物用于1%瓊脂糖凝膠電泳,觀察電泳目標條帶是否明亮,并拍照記錄電泳結果。將凝膠電泳檢測出目標條帶的樣品送北京天一輝遠生物科技有限公司進行Sanger測序。

1.3 數據分析

1.3.1序列處理及初步鑒定

記錄測序公司返回的序列測序情況,并采用BioEdit(Hall, 1999; 2011)、MAFFT v7(https://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)和MEGA v7 (Kumaretal., 2016)軟件對序列進行處理。首先,將所有COI序列采用MAFFT進行比對,用MEGA翻譯為氨基酸序列以核查閱讀框是否中斷,用BioEdit軟件對序列進行校對、剪切,并統計序列的堿基位點情況;將序列導入到BOLD system v4在線系統,使用IDENTIFICATION程序查看物種鑒定結果;若在BOLD中無法獲得分類信息,則采用NCBI中的Blast程序再次比對查詢;將從BOLD和NCBI中獲得的物種信息進行整合,并結合挑選樣本時的形態分類情況以確定獲得的序列即為目的基因片段。

1.3.2MOTU界定

上述數據庫鑒定可將所有序列清晰確定到目水平(與形態分類一致),因此后續分子分類將針對涉及的昆蟲各目分別展開。先將修剪好的序列采用Mothur (Schlossetal., 2009)處理成單倍型,隨后采用jMOTU (Jonesetal., 2011)、ABGD (Puillandreetal., 2012)、bPTP (Zhangetal., 2013)、GMYC (Fujisawa and Barraclough, 2013) 4種方法對6個目昆蟲序列分別進行物種界定,劃分出MOTU。

(1)jMOTU 分析。分歧閾值設置為1～20 bp,聚集參數為97%。

(2)ABGD分析。種內差異先驗值P(prior intraspecific divergence)最小值為0.001,最大值為0.1,最小相對gap寬度值X(minimum relative gap width)=0.5～1,Steps=5,Nb bins=20,基于K2P模型(Kimura, 1980)計算遺傳距離。

(3)bPTP分析。首先,采用IQ-TREE(Nguyenetal., 2015)以最大似然法及默認模型構建有外群的ML系統發生樹;隨后,基于ML樹并設置默認參數(MCMC代數為100 000,Burn-in值為0.1,seed值為123)進行物種界定結果分析。

(4)GMYC分析?；谝陨蠘嫿ǖ腗L樹采用r8s軟件構建超度量樹(ultrametric tree),繼而通過R軟件“SPLITS”包(Monaghanetal., 2009)中單閾值(single-threshold)GMYC模型進行物種界定分析。

基于以上方法分別獲得MOTU后,采用R “clues”包的Hubert &Arabie調整蘭德指數(Hubert and Arabie’s adjusted Rand index)(Millgan and Cooper, 1986; Changetal., 2010)對4種方法的劃分結果進行兩兩比較分析,評估不同界定結果的穩定性,并結合所構建的ML樹情況,選擇一致性最高的分類結果確定為最終的MOTU或物種界定結果用于后續分析(Wangetal., 2019; Lietal., 2022)。

1.3.3遺傳距離

根據上述確定的MOTU結果,按不同昆蟲目將序列導入MEGA中,進行序列堿基含量分析;并根據物種界定所得MOTU劃分情況將序列分成不同的“group”。當某MOTU中包含兩條或以上序列時,根據兩兩平均距離(p-distance模型)計算種內遺傳距離。隨后,分別計算6個昆蟲目的種內平均遺傳距離。

2 結果與分析

2.1 序列情況及物種鑒定

本研究共計擴增479個昆蟲樣本,并成功獲得475條COI序列,擴增成功率達99.2%。經與BOLD和NCBI在線物種數據庫比對,結果顯示:樣本序列物種目級信息與形態學初步分類結果一致,475條序列分屬于6個昆蟲目(鱗翅目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目、半翅目、直翅目);其中雙翅目最多,152條(占32.4%);其次為膜翅目和鱗翅目,均超過100條;鞘翅目、半翅目和直翅目均不到40條。物種數據庫鑒定到科水平的COI序列共計205條,其中數量占優勢的雙翅目鑒定到科共70條(46.1%),屬于14科;其次為鱗翅目69條(58.5%),屬于15科;膜翅目46條(36.5%),屬于7科;最少為直翅目,僅5條,屬2科(表2)。

表2 不同目昆蟲物種鑒定

堿基組成計算結果顯示:6個目昆蟲的序列堿基含量均具有明顯的AT偏向性。其中,半翅目、鱗翅目、膜翅目和雙翅目等4個目的A+T含量均比G+C含量高出2倍多,膜翅目A+T含量最高,達72.6%,直翅目最少為64.3%(表3)。

表3 不同目昆蟲COI序列堿基組成信息

2.2 物種界定

所獲序列經比對修剪后433條序列(占90.4%)用于物種界定分析。各昆蟲目序列數從高到低依次為雙翅目、鱗翅目、膜翅目、鞘翅目、半翅目和直翅目。采用jMOTU、ABGD、bPTP和GMYC這4種方法進行界定共得到288個MOTU,其中鱗翅目獲得的MOTU最多,半翅目、鞘翅目和膜翅目獲得MOTU均超過樣本量的60%,雙翅目和直翅目的MOTU不到樣本量的50%(表4)。

表4 各目昆蟲物種界定及種內遺傳距離統計情況

具體而言,鞘翅目昆蟲用4種方法界定的結果完全一致。鱗翅目昆蟲除用GMYC方法界定結果少一個MOTU外,其余3種方法界定結果完全一致。半翅目昆蟲的jMOTU和GMYC方法界定結果完全一致,而ABGD和bPTP方法存在兩處差異,涉及5條序列。bPTP和GMYC對直翅目昆蟲的界定結果完全一致,但ABGD和jMOTU方法存在兩處差異,涉及5條序列。4種方法對雙翅目昆蟲的結果均不一致,存在6處差異,涉及28條序列。GMYC外的另外3種界定方法對膜翅目昆蟲界定結果均不一致,存在7處差異,涉及16條序列(圖1)。根據R “clues”包Hubert &Arabie調整蘭德指數對不同方法界定結果的穩定性評估情況,選取一致性最高的為最終結果。因此,鞘翅目昆蟲基于4種方法劃分為20個MOTUs;鱗翅目昆蟲基于ABGD、jMOTU、bPTP方法劃分為85個MOTUs;半翅目昆蟲基于jMOTU和GMYC方法劃分為21個MOTUs;直翅目昆蟲基于bPTP和GMYC方法劃分為8個MOTUs;雙翅目昆蟲基于GMYC的界定結果,劃分為74個MOTUs;膜翅目昆蟲基于jMOTU方法的界定結果劃分為80個MOTUs。

圖1 不同物種界定方法對不同目昆蟲的物種界定結果Fig.1 Species delimitation results from different methods for different insect orders注:圖中僅顯示4種方法劃分MOTU有差異的部分序列情況。Note:Figure only shows partial sequences for which species delimitations from the four methods differed.

2.3 遺傳距離

基于物種界定所得MOTU計算種內遺傳距離顯示,不同昆蟲類群的種內遺傳距離最小值差異很小,鱗翅目、膜翅目、鞘翅目、雙翅目均為0.17%;但最大值差異較大,從0.51%至2.69%(圖2,表4)。不同昆蟲類群的種內遺傳距離中,膜翅目種內遺傳距離均值及標準偏差最大(0.89%±0.87%,mean±SD),其次為雙翅目(0.73%±0.58%)、半翅目(0.71%±0.31%)和鞘翅目(0.60%±0.47%),鱗翅目的最小(0.28%±0.20%)(圖2)。

圖2 不同目昆蟲種內遺傳距離的平均值、最大值和最小值(a)、平均值±標準差(b)Fig.2 Average, maximum and minimum value (a) and mean±SD (b) of the intraspecific genetic distance of different insect orders

3 結論與討論

DNA條形碼通常被認為是一種經濟、簡便、可靠的分子鑒定工具,在后生動物類群中具有廣泛的適用性(Hebertetal., 2004a; Hebert and Gregory, 2005; Virgilioetal., 2010)。本研究對測得的COI條形碼序列與在線物種庫進行了比對鑒定,并基于劃分的MOTU進行種內遺傳距離分析。結果表明:不同的昆蟲類群的種內遺傳距離,雖然整體在一定范圍內(如小于3%),但呈現一定程度的差異。因此,雖然曾有研究提出10倍法則或3%的遺傳距離閾值作為物種水平差異診斷的標準(Hebertetal., 2003; Hebertetal., 2004b; Waugh, 2007),但是昆蟲分子分類不能簡單地依賴于某具體距離閾值。本研究計算了6個昆蟲目的種內遺傳距離,發現種內遺傳距離最小值小于1%,而且鱗翅目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目昆蟲的種內遺傳距離范圍具有相似性;雙翅目、膜翅目昆蟲的種內遺傳距離和種內平均遺傳距離最大值范圍均大于2%。這些均與Hebert等(2003)所認為的種內遺傳距離多小于1%的說法不完全一致。此外,Zhang &Bu (2022)對BOLD數據庫中64 414種昆蟲進行遺傳距離分析發現:大約四分之一的昆蟲物種存在較高的遺傳變異(>3%)。然而,新近的研究中,Sharkey等(2021)依然使用2%的遺傳距離閾值開展膜翅目昆蟲物種劃分。顯然,在對昆蟲進行分子分類研究中針對不同昆蟲類群的劃分方案還存在爭議。本研究也再次證明不同的昆蟲類群遺傳距離存在差異性,使用特定遺傳距離閾值進行物種劃分時需要慎重考慮。

其實,DNA條形碼用于昆蟲物種鑒定在實驗環節還受到取樣、DNA提取、PCR擴增和測序等因素的影響。其中,非常關鍵的環節是使用引物擴增目的基因片段。本研究以昆蟲線粒體COI條形碼擴增的常用引物LCO1490+HCO2198為主,以LCO1490+HCOout作為補充進行擴增,總體獲得了較高的成功率,達99.2%。不同目昆蟲表現出一定差異:鱗翅目、鞘翅目、雙翅目擴增成功率都達100%,而半翅目的擴增成功率只有96.8%。值得一提的是,對于雙翅目昆蟲使用引物LCO1490+HCOout將擴增成功率從61%提高到了98%。

同時,盡管BOLD和NCBI數據庫都包含有大量的COI數據,但本研究獲得的6個昆蟲目400余條COI序列與在線物種數據庫進行比對鑒定時,能注釋到科及屬、種水平的尚不足50%。Virgilio等(2010)對DNA條形碼在鱗翅目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目、直翅目、半翅目這6個目昆蟲中的性能比較研究中,也證實了在缺少數據庫資料作參考的情況下,會影響DNA條形碼的物種鑒定效率。Chesters &Zhu (2014)發現現有的物種數據庫仍然有較大的物種信息缺口,需要不斷完善。因此,昆蟲多樣性研究需要分類學者提供足夠的物種信息,才能在測序技術和分析效率等方面有大幅提升的同時,為更加高效地利用分子物種鑒定方法(如:DNA宏條形碼)提供基礎。

本研究對亞熱帶森林中數量居多的鱗翅目、雙翅目、膜翅目、鞘翅目、半翅目、直翅目這 6大目昆蟲進行了DNA條形碼研究,在目內科、屬、種等多個水平探討了DNA對不同昆蟲類群的檢測和界定效率,可以豐富本地昆蟲分子數據庫,為森林蟲害防治提供基礎數據;同時也為進一步探索基于DNA條形碼的分子分類學研究提供參考。但本研究仍然存在一定的采樣局限性(有的目樣本只有30余個),不同物種的個體數量也分布不均衡,然而不影響DNA條形碼在昆蟲多樣性研究工作中的物種鑒定有效性。后續的研究有必要擴大采樣量,并進行更深入的探討;同時應當在形態分類學的基礎上加大對DNA條形碼的研究,不斷豐富DNA條形碼數據庫,從而可以為利用更加高效的分子分類方法開展多樣性調查提供基礎。