cycle基因對噻嗪酮、噻蟲嗪防治白背飛虱效果影響探索研究

康 奎,張 杰,萬思景,龔 俊,張道偉

(遵義師范學院生物與農業科技學院/貴州省赤水河流域動物資源保護與應用研究重點實驗室,遵義 563002)

白背飛虱Sogatellafurcifera屬半翅目飛虱科,是危害水稻且所涉范圍較大的遷飛性害蟲之一,同時也是我國和東南亞水稻產區的主要害蟲之一。白背飛虱的成蟲和若蟲經常群集于水稻叢的下部刺吸水稻汁液,或雌蟲用產卵器刺破葉鞘和葉片(金劍雪, 2011),白背飛虱也能夠進行病毒的傳播,如南方水稻黑條矮縮病毒(劉丹鳳, 2016)。長期以來,對于白背飛虱的防治手段都是利用化學藥物來進行防治,但是長時間的使用化學農藥,不僅會導致害蟲產生一定的抗藥性,而且對于環境也有著嚴重的破壞和污染。

化學殺蟲劑的應用通常被認為是一種廉價和容易獲得的抑制害蟲數量的方法,在過去的50年里,它一直是害蟲防治的主要形式(Liangetal., 2015)?，F在大部分的研究都偏向尋找適合的生物藥劑來進行防治白背飛虱,但由于其應用成本較高且防治效果比化學藥劑見效慢,所以目前大部分的地區依舊使用的是化學農藥(汪勇等, 2017)。在我國對于農藥的使用有較為嚴重的浪費現象并且農藥的有效利用率很低,僅為20%,所浪費的農藥會對環境造成一定的破壞和污染(屠豫欽等, 2003)。為了降低對生態環境的危害,農藥的高效利用就顯得尤為重要,如何高效的使用農藥,降低環境污染及白背飛虱產生抗藥性的速率仍然是一項長期研究目標。研究表明,殺蟲劑氯氰菊酯在斜紋夜蛾3齡幼蟲中暴露于3種不同光周期的毒性有不同的結果,在不同的時間,不同的光周期,谷胱甘肽S-轉移酶(GST)活性發生了顯著變化。在此期間,特定的解毒酶的活性會波動,對于特定的殺蟲劑,導致50%死亡率的濃度在不同的光周期中會發生顯著變化(Karthi and Shivakumar, 2016)。

生物鐘是生物體生命活動的內在節律性,它會影響著動物許多的生理活動和行為,能夠表現出一定的節律性,動物中存在著許多的節律基因。晝夜節律所產生的每日節律能夠調節許多的生命功能,在果蠅中也證明了晝夜節律系統在調節異種生物毒性方面具有保守作用(Michelleetal., 2010)。根據研究果蠅突變體發現,clock基因能在脂肪體中影響淀粉向蛋白質轉變的過程,從而使昆蟲更具有饑餓感,進一步影響到昆蟲的取食行為(Chatterjeeetal., 2010),在果蠅的味覺器官中cycle和period基因也通過影響味覺受體神經元的表達來影響它的取食行為(Xuetal., 2008)。在褐飛虱Nilaparvatalugens中干涉Nlcycle節律基因能夠影響其對吡蟲啉農藥的抗性(Kangetal., 2017)。在沙漠蝗蟲Schistocercagregaria中,利用RNAi的方法也發現period和timeless基因不僅能夠影響雄蟲精子的運輸與釋放,還能夠影響雌蟲卵巢內卵的發育(Tobbacketal., 2011; Tobbacketal., 2012)。

本研究擬結合昆蟲生物節律,在一天不同時間點探索噻蟲嗪、噻嗪酮對白背飛虱的防治效率,并利用RNAi方法探索白背飛虱節律基因Sfcycle在兩種農藥防控中的作用,研究結果可為農藥的高效使用提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用白背飛虱來采自于遵義市,昆蟲飼養溫室中混合飼養,飼養溫室溫度為28±1℃,相對濕度為80%±10%,光周期為L∶D=16 h∶8 h。噻蟲嗪(30%懸浮劑)購至山東華陽農藥化工集團有限公司,噻嗪酮(50%懸浮劑)購至上海悅聯生物科技有限公司,配置溶劑為水。

1.2 農藥室內致死效率檢測

配制田間推薦使用的濃度為0.27 g/L噻蟲嗪、5 mL/L噻嗪酮,利用稻莖浸漬法(宋江波, 2017),將準備好的水稻莖在0.27 g/L噻蟲嗪或5 mL/L噻嗪酮藥液中浸漬30 s,晾干,用棉花包住水稻根部使其處于濕潤狀態,置于培養管中。將成蟲第1天的白背飛虱用吸蟲器移入培養管中,每個培養管放置20頭試蟲,管口處用紗布罩住,每個時間點3個重復組,以水處理為對照。處理組及對照組都置于相同條件下的昆蟲飼養溫室中觀察,每隔3 h統計死亡率,統計12 h。采用校正死亡率計算,公式如下:

校正死亡率(%)=(處理死亡率-對照死亡率)/(1-對照死亡率)×100

1.3 白背飛虱Sfcycle序列的克隆

在網上數據庫NCBI(http://www.ncbi.nlm. nih.gov/)上搜索昆蟲cycle基因,選擇褐飛虱、果蠅、蚜蟲等與白背飛虱相近或模式昆蟲物種,利用本地Blast在白背飛虱轉錄組數據中查找序列。設計全長引物克隆并測序后,在NCBI進行Blastx驗證克隆序列,獲得其部分序列。設計引物見表1。

表1 本實驗所用引物

1.4 節律基因Sfcycle的RNA干涉

根據擴增得到的序列,避開定量區域,設計dsRNA引物(見表1)。dsRNA合成使用Promega T7 RiboMAXTMExpress RNAi System試劑盒進行。所合成的dsRNA分別進行凝膠電泳檢測其完整性和微量核酸蛋白測定儀測定其濃度。按照Kang等方法進行RNA干涉,注射量為150 ng/頭,注射同等量的dsGFP作為對照。注射后將白背飛虱放于新鮮水稻上,并放回溫室繼續飼養,在干涉24 h、48 h、72 h后取樣,每管3頭,共取9管,檢測其干涉效率。同一批注射的白背飛虱使用1.2方法進行農藥致死效率檢測。

1.5 定量PCR檢測

白背飛虱蟲體或組織樣品總RNA的提取采用Trizol試劑(Invitrogen公司)。將所提取的總RNA用凝膠成像系統分析其完整性,RNA濃度的測定在NanoDrop 2000核酸蛋白分析儀上進行,并通過OD260/OD280驗證純度。然后使用PrimeScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa)將1 μg Total RNA反轉錄成cDNA。

使用PCR多孔板按下列組分配置定量PCR反應體系(10 μL反應體系):SYBR premix Ex Taq,5 μL;cDNA模板,1 μL;PCR Forward Primer(F),0.2 μL;PCR Reverse Primer(R),0.2 μL;ddH2O,3.6 μL;共10 μL。每個處理進行3次生物學重復,引物序列如表1所示,q-PCR反應程序如下:95℃預變性10 s;95℃變性5 s;58℃退火15 s;72℃延伸20 s;共40個循環。使用β-Actin基因作為內參。數據使用2-ΔΔCt法進行運算,用白背飛虱注射dsGFP組的Ct值為對照組。

1.6 數據分析

用Excel軟件對數據進行整理,并使用SPSS 17.0軟件對所統計的具體數據進行統計分析,使用One-Way ANOVA法進行差異顯著性檢驗(P<0.05為差異顯著,用*表示;P<0.01為差異極顯著,用**表示),數據表示為平均值±標準誤。處理后的數據采用GraphPad Prism 6軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同時間點白背飛虱對兩種農藥的敏感性檢測

利用0.27 g/L噻蟲嗪、5 ml/L噻嗪酮處理白背飛虱在72 h內的死亡率如圖1。噻蟲嗪、噻嗪酮處理的白背飛虱統計至72 h時,在7∶00時校正死亡率均較低,分別為54%、13.9%,16∶00時校正死亡率均較高,分別為89.8%、44.9%。

圖1 0.27 g/L噻蟲嗪(A)、5 mL/L噻嗪酮(B)在不同時間點對白背飛虱的致死率檢測Fig.1 Adjusted mortality rates of WBPH exposed to thiamethoxam (0.27 g/L) (A) and uprofezin (5 mL/L) (B) at different time points注:數據為平均值±標準誤,不同字母表示差異顯著(P<0.05,t檢驗)。Note: Data were shown as the means±SE. Different letters over the points indicated a significant difference (P<0.05, t-test).

2.2 白背飛虱節律基因Sfcycle的克隆及表達分析

通過對Sfcycle基因的克隆獲得其全長為5 042 bp。熒光定量PCR檢測結果顯示Sfcycle基因在各組織中均有表達,且發現其在卵巢中的表達量最低,中腸表達量最高。4齡和5齡若蟲期在蛻皮前Sfcycle表達量較之蛻皮后高,成蟲期表達量相對穩定(圖2)。

圖2 Sfcycle基因在不同組織和發育齡期中的表達量Fig.2 Relative mRNA expression of Sfcycle in different tissues of one-day-old brachypterous females and different development stage注:Ov, 卵巢; Mg, 中腸; Ep, 表皮; Fb, 脂肪體; He, 頭。數據為平均值±標準誤,不同字母表示差異顯著(P<0.05, Tukey’s 檢驗)。Note: Ov, Ovary; Mg, Midgut; Ep, Epidermis; Fb, Fat body; He, Head. Data were shown as the means±SE. Different letters over the points indicated a significant difference (P<0.05, Tukey’s test).

2.3 Sfcycle基因干涉效果檢測

與注射dsGFP相比在注射了150 ng的dsSfcycle后,SfcyclemRNA的相對表達水平在3個檢測時間點與dsGFP相比均有顯著性下調(圖3-A)。干涉24 h后分別在7∶00和16∶00檢測SfCYP4DE1和SfCYP353D1v2的基因表達量,結果發現與對照相比,2個P450基因的表達量在2個檢測時間點均顯著降低。

圖3 白背飛虱節律基因Sfcycle干涉效率(A)及其對P450基因的影響(B, C)Fig.3 Efficiency of RNA interference (A) and affects of the expression levels of P450 genes (B, C)注:數據為平均值±標準誤,柱上星號表示差異極顯著(P<0.01, t檢驗)。Note: Data were shown as the means±SE. Asterisk over the points indicated a significant difference (P<0.01, t-test).

2.4 干涉后噻蟲嗪、噻嗪酮在一天不同時間處理白背飛虱后死亡率統計情況

為了更好的驗證節律基因是否影響白背飛虱對噻蟲嗪、噻嗪酮的耐性,利用RNAi方法處理白背飛虱,并分別在7∶00和16∶00利用噻蟲嗪、噻嗪酮處理白背飛虱。在干涉節律基因后,利用噻蟲嗪、噻嗪酮處理白背飛虱的死亡率并沒有顯著差異,對照組注射了dsGFP之后的兩個時間點仍有顯著差異。這表明Sfcycle基因的表達量影響著白背飛虱對噻蟲嗪、噻嗪酮的耐性,即影響了噻蟲嗪、噻嗪酮對白背飛虱的防治效果(圖4)。

圖4 干涉Sfcycle后0.27 g/L噻蟲嗪(A)、5 mL/L噻嗪酮(B)在不同時間點對白背飛虱的致死率檢測Fig.4 Adjusted mortality rates of WBPH exposed to thiamethoxam (0.27 g/L) (A) and uprofezin (5 mL/L) (B) at different time points injection of dsGFP and dsSfcycle注:數據為平均值±標準誤,柱上星號表示差異顯著(*P<0.05,**P<0.01,t檢驗),ns表示沒有顯著性差異。Note: Data were shown as the means±SE. Asterisk over the points indicated a significant difference (*P<0.05, **P<0.01, t-test). ns indicated no significant difference.

3 結論與討論

生物鐘存在于所有的生物體中,包括細菌、植物和動物。迄今,已經有多個時鐘基因以及時鐘相關基因被鑒定,這一些時鐘基因會和它們的相應產物組成兩個互相依賴的轉錄/翻譯反饋環路,從而來調節行為和生理的晝夜節律(周先舉等, 2005)。生物的節律也會受到光和溫度的影響,在24 h之內會呈現有規律的變化,它們通常在不同的組織中會有不同的下游基因來調控組織內基因的節律(Cerianietal., 2002)。據報道,殺蟲劑,如有機磷和有機氯等,對各種害蟲昆蟲的作用也會隨著一天中不同的時間而變化(Hoovenetal., 2009)。如,埃及伊蚊Aedesaegypti和家蠶Bombyxmori在同一天的不同時間內對綠菊酯的抗性不同(Yangetal., 2010),褐飛虱在ZT20和ZT16這兩個時間點對吡蟲啉的抗性也不同(Kangetal., 2017),本研究也發現,兩種不同農藥在一天不同時間內對白背飛虱的致死效率也有顯著性的差異。

抗性代謝相關的酶的表達具有一定的節律現象,這在多個昆蟲中均有報道。例如,許多已經確定或即將確定功能的基因如細胞色素P450蛋白,細胞色素P450氧化還原伴侶,酯酶,谷胱甘肽-s轉移酶。據報道,尿苷5′-二磷酸葡萄糖基轉移酶(GSTs)或尿苷5′ -二磷酸葡萄糖基轉移酶有節律地表達(Claridge-Changetal., 2001; McDonald and Rosbash, 2001; Cerianietal., 2002; Linetal., 2002; Uedaetal., 2002)。在果蠅中至少有5個與農藥代謝相關P450基因CYP4E2、CYP6A2、CYP6G1、CYP6W1、CYP12A4的表達具有節律(Hoovenetal., 2009),褐飛虱的CYP6AY1、CYP6ER1、CYP6AX1等(Kangetal., 2017)。在岡比亞按蚊Anophelesgambiae中,通過組學的測定發現至少有2 000以上的基因具有節律性表達,而這其中就包括了與擬除蟲菊酯和DDT代謝能力相關基因,包括CYP6M2、CYP6P3、CYP6Z1和GSTE2,這些基因的表達最高值在一天不同的時間,都是受節律調控的(Balmertetal., 2014)。殺蟲劑氯氰菊酯在斜紋夜蛾Spodopteralitura3齡幼蟲中暴露于3種不同光周期的毒性有不同的結果,在不同的時間、不同的光周期,谷胱甘肽S-轉移酶(GST)活性發生了顯著變化(Wangetal., 2020)。褐飛虱體內節律基因Nlcycle的表達情況影響了其抗藥性基因的表達,最終表現出其對農藥吡蟲啉的抗性降低(Kangetal., 2017)。本研究在降低了Sfcycle基因表達后,顯著影響了參與白背飛虱對殺蟲劑響應的2個細胞色素P450基因SfCYP4DE1和SfCYP353D1v2(賈澤艷等, 2020)的表達,通過對其進行農藥浸染的水稻處理后,白背飛虱的死亡率顯著性的增加。

由于在農藥方面存在高度的適應性,導致就算使用特效的化學農藥也不能夠實現稻飛虱可持續治理的目標(Pangetal., 2015)。本試驗將白背飛虱在一天之內對噻蟲嗪、噻嗪酮的敏感性做了分析,以求達到高效率的使用化學農藥防治,實驗結果可以用來改善農藥的使用和提高田間農藥使用效率。