腫瘤浸潤淋巴細胞、CD8、PD-L1 和CTLA-4在乳腺癌新輔助治療效果中的預測價值

蔡仕彬，江姜樂，劉鵬鵬，周毅，鄭琎，陳述政

腫瘤微環境（TME）和鄰近免疫系統的相互作用決定了乳腺癌的發展轉移，其可以起到促進或抑制腫瘤生長、侵襲的作用。既往報道腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）水平可以預測三陰性乳腺癌新輔助化療的反應性[1]。然而TILs 可能僅提供有關免疫激活狀態的粗略信息，探索能夠進一步改善風險預測的其他潛在生物標志物具有重要意義。CD8+T淋巴細胞是TILs的主要組成部分，程序性細胞死亡配體1（PD-L1）和細胞毒T 淋巴細胞相關抗原4（CTLA-4）是關鍵性的免疫抑制分子，促進腫瘤細胞免疫逃逸。本研究旨在評估CD8、PD-L1、CTLA-4 聯合TILs 在人類表皮生長因子受體2（HER2）陽性或三陰性乳腺癌（TNBC）新輔助治療療效反應的預測價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2015 年1 月至2020 年12 月在麗水市中心醫院行新輔助治療和手術治療的HER2 陽性或TNBC 乳腺癌患者43 例，均為女性，穿刺病理確診為浸潤性導管癌。排除Ⅳ期乳腺癌、炎性乳腺癌和妊娠相關性乳腺癌。所有患者均接受表柔比星聯合環磷酰胺4 周期序貫多西他賽4 周期（EC-T）或多西他賽聯合卡鉑6 周期（TCb）方案新輔助化療，HER2 陽性患者接受曲妥珠單抗（H）或曲妥珠單抗聯合帕妥珠單抗（H+P）新輔助靶向治療。根據Miller&Payne（MP）分級評估系統評估乳房原發灶的新輔助治療療效，乳房病理完全緩解（bpCR）的定義是乳房腫瘤未見浸潤性癌成分，即MP 分級為5 級。NAC 治療后，所有患者均接受外科手術。收集患者治療記錄，包括臨床病理信息、治療和隨訪結果。本研究經麗水市中心醫院醫學倫理委員會批準。所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 CD8、PD-L1 及CTLA-4 表達檢測應用免疫組織化學法（IHC）檢測CD8、PD-L1、CTLA-4在腫瘤組織內的表達。常規石蠟包埋組織，4m 切片，經脫蠟、水合、抗原修復、連續封閉后，將切片與一抗單克隆抗體一起4 ℃孵育過夜?？笴D8 單克隆抗體購自安必平（MRQ-39，IHC-RO24），抗PD-L1 單克隆購自Abcam（ab205921，28-8），抗CTLA-4 單克隆抗體購自Santa Cruz Bio（sc-376016，F-8）。第2 天經常規沖洗后與二抗抗體（Dako，K5007）37 ℃孵育30 min，DAB 顯色。最后，用蘇木精復染，脫水并封片保存。

1.2.2 TILs、CD8、PD-L1 及CTLA-4 表達的結果判讀 根據國際腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）工作組推薦評估方法[2]，以半定量連續變量評分的方式在蘇木精-伊紅染色玻片上報告TILs 占據基質區域面積的百分比。在200 倍鏡下計數腫瘤內CD8+免疫細胞的數量，不包括腫瘤邊界的免疫細胞。應用ROC 曲線法計算TILs 和CD8+表達的截斷值。腫瘤細胞膜染色或免疫細胞有顆粒狀細胞質或膜染色被視為PDL1 陽性。PD-L1（CPS）定義為PD-L1 陽性腫瘤細胞和免疫細胞（淋巴細胞和巨噬細胞）的數量總和相對于所有重要腫瘤細胞數量的比值。CTLA-4 膜染色細胞被視為CTLA-4 陽性。CTLA-4 定義為CTLA-4陽性腫瘤浸潤淋巴細胞占全部腫瘤浸潤淋巴細胞的百分比；所有病理及免疫組化均由兩名資深病理科醫師評估。

1.3 統計方法 采用SPSS 26.0 統計軟件進行分析，計數資料采用檢驗或校正檢驗，P ＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 43 例乳腺癌患者的臨床病理特征 43 例乳腺癌患者年齡25～67歲，中位年齡51.9歲，其中HER2陽性乳腺癌占72.1%，TNBC 占27.9%。經6 ～8 個療程新輔助治療，44.2%的患者達到bpCR，見表1。TILs 的截斷值為57%，TILs≥57%確定為TILs 高表達，TILs ＜57%確定為TILs 低表達。CD8 表達的截斷值為163，CD8≥163 確定為CD8 高表達，CD8＜163 確定為CD8 低表達。PD-L1（CPS）≥1 確定為高表達，PD-L1（CPS）=0 確定為低表達。CTLA-4≥1%確定為高表達，CTLA-4=0 確定為低表達。TILs、CD8、PD-L1、CTLA-4表達高低結果見圖1。2.2 不同免疫標志物與乳房bpCR的關系 CD8 高表達組與低表達組、PD-L1 高表達組與低表達組bpCR 差異均有統計學意義（均P ＜0.05），TILs 和CTLA-4 高表達組與低表達組bpCR 差異均無統計學意義（均P ＞0.05），見表2。

圖1 不同免疫標志物的表達情況

表1 43 例接受新輔助治療的乳腺癌患者臨床病理特征

表2 不同免疫標志物在pCR 與non-pCR 中的表達差異 例（%）

CD8 高表達T 細胞在HER2 陽性乳腺癌中占61.3%（19/31），而在TNBC 中占75.0%（9/12）。PDL1高表達在HER2 陽性乳腺癌中占25.6%（8/31），在TNBC 中占75.0%（9/12）。在HER2 陽性乳腺癌中，5例CD8 高表達且PD-L1 高表達的乳腺癌患者經新輔助治療后MP分級均為5 級，全部獲得乳房病理完全緩解。而在TNBC 中，僅50.0%（4/8）CD8 高表達且PD-L1 高表達患者的新輔助治療療效評估為MP 分級5 級，見圖2。

圖2 不同免疫標志物表達強度與乳房病理緩解MP 分級的相關性

3 討論

腫瘤學家Schreiber 于2002 年提出了腫瘤免疫編輯學說[3]。癌細胞可以重塑免疫細胞的生物學特性，逃脫免疫監視，使得腫瘤細胞逃逸并發生轉移。在乳腺腫瘤微環境中，各種免疫細胞（包括淋巴細胞）浸潤到腫瘤基質中。高水平的TILs 和CD8+TILs可以預測乳腺癌新輔助化療反應，尤其在HER2 陽性和TNBC中，與較好的臨床預后相關[1，4-6]；相反，在激素受體陽性、HER2 陰性乳腺癌中TILs 是不良的生存預后因素[1]。Kaewkangsadan 等[7]應用免疫組化評估33 例局部晚期乳腺癌新輔助化療前后腫瘤免疫細胞和免疫分子的表達水平，研究發現瘤內和間質TILs、CD4+、CD8+高表達均與bpCR 相關。TNBC 新輔助化療后殘留腫瘤組織中較高的TILs與無復發生存和總生存改善顯著相關[8]。本研究中，TILs 高表達組bpCR 率亦高于低表達組，但是由于本研究病例數較少，差異無統計學意義（P ＞0.05）。CD8 高表達患者新輔助治療的bpCR率高于CD8 低表達組，這表明CD8+TILs亞群可以作為乳腺癌新輔助治療療效的潛在預測指標，尤其是在HER2 陽性乳腺癌中，CD8+TILs 與NAC 后的病理反應級別存在相關性。

乳腺癌中PD-L1 的表達水平與腫瘤大小、腫瘤高分化、淋巴結轉移、ER 陰性、PR 陰性、HER2 陽性等不良預后相關的臨床病理因素普遍相關，然而其與預后的關系卻在不同的研究中有所差異[9-10]。Wimberly 等[11]提出PD-L1 表達和TILs 能共同預測新輔助化療的治療反應。Abdelrahman 等[9]研究了50 例接受新輔助化療的早期（T1、T2）TNBC 患者腫瘤免疫微環境與臨床病理反應的相關性，結果顯示pCR 與高表達TILs、缺失Foxp3+和PD-L1 相關（均P＜0.05）。另有研究發現新輔助化療后未達到bpCR的TNBC 患者殘留腫瘤組織中PD-L1 表達升高[10]。在本研究中，PD-L1 高表達組和低表達組經新輔助化療后bpCR 率差異有統計學意義（＜0.05）。在HER2 陽性乳腺癌中，CD8 高表達且PD-L1 高表達的乳腺癌患者經新輔助治療后更易獲得bpCR，而在TNBC 中CD8 高表達或PD-L1 高表達與新輔助治療療效無明顯相關性。

綜上所述，乳腺癌患者的免疫狀態可以預測新輔助治療療效，CD8 高表達且PD-L1 高表達的乳腺癌患者經新輔助治療后更易獲得bpCR。因此，對乳腺癌患者免疫微環境進行更深入的研究將有助于改善乳腺癌生存。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明蔡仕彬：實驗操作、論文撰寫；江姜樂、劉鵬鵬、周毅、鄭琎：數據整理、統計學分析；陳述政：研究指導、論文修改、經費支持