糖析萃取/超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱質譜快速篩查蜂蜜中的化學風險物質

高 佳，劉夢穎，任貝貝，路 楊，陳福尊，王麗英*，康維鈞

（1.河北醫科大學 公共衛生學院，河北 石家莊 050017；2.河北省疾病預防控制中心，河北 石家莊 050021）

蜂蜜是一種純天然的滋養食品，富含果糖、葡萄糖、維生素、蛋白質、氨基酸、礦物質、脂類、生物酶等營養成分［1-2］。在養蜂過程中，農作物用藥和蜂農用藥可能導致農藥在蜂蜜中殘留甚至超標［3-4］，而且在預防和治療蜜蜂感染性疾病中也存在抗生素使用不當的問題［5］，同時蜜蜂在采蜜過程中可能采到有毒蜜源［6］，以上均可能導致人類食用蜂蜜后引起中毒。中國、日本、美國和歐盟等國家和地區均對蜂蜜中的農藥、抗生素等制定了最大殘留限量［7-8］，因此，建立一種簡單、快速、靈敏、準確的蜂蜜中多種風險物質的篩查方法對于保障人民舌尖上的安全非常重要。

針對蜂蜜的檢測方法主要包括高效液相色譜（HPLC）法［9］、液相色譜-串聯質譜（LC-MS/MS）法［3-5］、氣相色譜-串聯質譜（GC-MS/MS）法［10］等。隨著檢測儀器、技術的發展，樣品前處理技術也逐步簡化。糖析萃取是以糖為相分離劑引發親水有機溶劑與水相分離的前處理技術，在乙腈-水體系中，加入的單糖越多，上層富集的乙腈濃度越高，且糖易溶于水微溶于乙腈，因此糖主要富集在下層水相［11-12］，對儀器影響較??；同時乙腈作為萃取劑，可直接進樣，操作更簡便。GB 14963-2011《食品安全國家標準 蜂蜜》［13］中規定蜂蜜的果糖和葡萄糖含量應大于等于60 g/100 g，蜂蜜作為一種含糖量很高的食品，采用糖析萃取作為樣品前處理技術，不需再另外添加糖即可使乙腈-水體系產生相分離效果，減少雜質引入。

四極桿/軌道阱高分辨質譜是近年來食品檢測中使用較多的一種高分辨質譜技術［14-16］，可以實現樣品中目標物的高通量準確定性篩查。高分辨質譜技術已應用于蜂蜜中植物毒素及農藥殘留的檢測，如甘源等［17］建立了蜂蜜中 5 種雷公藤毒素的高分辨質譜定量分析方法，昝珂等［18］建立了蜂蜜中28個吡咯里西啶生物堿的快速檢測方法，呂冰等［19］建立了蜂蜜中7種新煙堿類農藥殘留的高分辨質譜檢測方法。但目前將高分辨質譜技術應用于蜂蜜中農殘、獸殘及植物毒源成分同時檢測的報道相對較少。

本研究以蜂蜜為研究基質，糖析萃取為前處理技術，通過超高效液相色譜-四極桿/軌道阱高分辨質譜技術（UPLC-Q/Orbitrap-HRMS），建立了68 種常見的農殘、獸殘及植物毒源成分風險物質的標準質譜數據庫，對一級質譜的分子離子精確質量數、保留時間、同位素豐度比進行初篩，并采用二級碎片離子解析對初篩的陽性化合物進一步確證，實現了蜂蜜中風險物質的快速篩查。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑及材料

Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Q-Exactive Plus 四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜系統及 Dionex Ultimate 3000 超高效液相色譜系統（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；JJ 600電子天平（0.01 g，常熟市雙杰測試儀器廠）；ME204E電子天平（0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）；Multi Reax試管振蕩器（德國Heidolph公司）；3-30K 高速冷凍離心機（美國 Sigma 公司）。

甲醇、乙腈（色譜純，美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；甲酸（色譜純，德國默克公司）；實驗用水均為屈臣氏蒸餾水。

阿維菌素類藥物混標（依普菌素、阿維菌素B1a、多拉菌素、伊維菌素B1a）、有機磷農藥混標（敵百蟲、甲基吡啶磷、敵敵畏、馬拉硫磷、烯蟲磷、蠅毒磷、倍硫磷、二嗪磷、辛硫磷）、氨基甲酸酯類殺蟲劑混標（抗蚜威-脫甲基、涕滅威砜、3-羥基克百威、抗蚜威、涕滅威、殘殺威、惡蟲威、克百威、甲萘威、乙硫苯威、滅除威、異丙威、3，4，5-混殺威、仲丁威、滅梭威、苯醚威、茚蟲威）均購自上海安譜科技有限公司；雷公藤甲素、雷公藤次堿、雷公藤紅素、雷公藤吉堿、雷公藤內酯甲、醚菊酯、噠螨靈、5-甲基糠醛、氟蟲腈及其代謝物（氟甲腈、氟蟲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜）、新煙堿殺蟲劑混標（環氧蟲啶、噻蟲胺、吡蟲啉、氯噻啉、啶蟲脒、噻蟲啉、哌蟲啶）均購自天津阿爾塔科技有限公司；磺胺硝苯、磺胺醋酰、磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺二甲唑、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺甲唑、周效磺胺、磺胺異唑、磺胺苯酰、磺胺苯吡唑、磺胺氯吡嗪、磺胺間二甲氧嘧啶、磺胺喹啉、氯霉素均購自德國 Dr.Ehrenstorfer 公司。

32份蜂蜜樣品購自超市和農貿市場。

1.2 溶液制備

標準儲備液：精確稱取化合物10 mg，用甲醇溶解配制成 1 000 mg/L 的儲備液，于-20 ℃儲存；混合標準中間液：準確吸取各類標準儲備液適量，用甲醇稀釋，配制成 10.0 mg/L 的混合標準中間液，于-20 ℃儲存；混合標準溶液：使用時用基質匹配溶液稀釋配制成 1.00 mg/L 的混合標準溶液，臨用現配。

1.3 樣品前處理

精確稱取蜂蜜樣品2 g（精確至0.01 g）置于15 mL具塞離心管中，加入 1.5 mL水，混勻；加入3.5 mL乙腈，渦旋10 min 使其混合均勻。8 000 r/min 離心 10 min，取1.5 mL上清液至2 mL離心管中，15 000 r/min 離心 10 min，取上清液供UPLC-Q/Orbitrap-HRMS 分析測定。

1.4 色譜條件

Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相由 0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）組成。梯度洗脫程序：0～2.5 min，95%～90% A，2.5～8.0 min，90%～5% A；8.0～12.0 min，5% A；12.0～14.0 min，5%～95% A；14.0～17.0 min，95% A。流速和柱溫分別設定為 0.3 mL/min 和40 ℃，樣品進樣量為5 μL。

1.5 質譜條件

離子源：加熱電噴霧離子源； 噴霧電壓 3.8 kV（正離子模式）、3.2 kV（負離子模式）；透鏡電壓：50.0 V；以氮氣為鞘氣和輔助氣，鞘氣壓力2.8×105Pa（40 psi），輔助氣壓力1.0×105Pa（15 psi）；離子傳輸管溫度 380 ℃；輔助氣加熱器溫度 350 ℃； 掃描模式：一級母離子全掃描和數據依賴的二級子離子掃描監測模式（Full MS/dd-MS2）；一級質譜掃描范圍m/z100～1 000，掃描分辨率70 000；二級掃描分辨率35 000；歸一化碰撞能為 20、40、60 eV。

68種風險物質的詳細信息見表1。

表1 68種風險物質的名稱、CAS 號、分子式、理論質量數、加合方式和保留時間Table 1 Compound name，CAS number，molecular formula，theoretical mass，adduct and retention time of 68 kinds of risk substance

(續表1)

1.6 結果判定

依據歐盟 2002/657/EC 準則［20］，使用高分辨質譜法對目標化合物進行定性分析時，有 1 個母離子和 1 個子離子，或 2 個子離子匹配，即可確定樣品中存在目標化合物。本研究對初篩陽性的樣品依據母離子與碎片離子進行判定，若母離子和碎片離子的測量精確質量數與理論精確質量數偏差小于5×10-6且碎片離子的相對豐度比滿足歐盟 2002/657/EC 準則要求，即可確定樣品中含有該化合物。

2 結果與討論

2.1 儀器條件選擇

2.1.1 色譜條件優化對目標化合物標準品進行質譜全掃描發現：大部分化合物在 ESI+模式下生成正離子；氯霉素、磺胺硝苯、氟甲腈、氟蟲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈砜、雷公藤紅素在ESI-模式下生成負離子。比較了正、負離子模式同時掃描時，水-甲醇、5 mmol/L 乙酸銨-甲醇和0.1%甲酸-甲醇3種流動相的效果。結果表明，部分化合物在水-甲醇流動相中生成的正離子的響應較低，但在水相中加入0.1%甲酸后正離子的響應明顯提高且對負離子響應影響不大，如磺胺氯吡嗪、磺胺氯噠嗪、磺胺苯酰、雷公藤次堿等正離子的響應提高，雷公藤紅素、磺胺苯酰等目標物的峰形得到明顯改善；而以5 mmol/L 乙酸銨為水相時，化合物保留時間的穩定性及分離效果無明顯提高，故本實驗選用0.1%甲酸-甲醇作為流動相。圖1為蜂蜜在正、負離子模式下的總離子流圖。

圖1 蜂蜜在正（A）、負（B）離子模式下的總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagrams of honey under positive（A） and negative（B） modes

2.1.2 質譜條件優化考慮到不同化合物的電離方式不同，本研究選擇正、負離子模式同時進行掃描，并根據68種化合物的分子量設定母離子的掃描范圍為m/z100～1 000。比較了正離子模式下目標化合物［M+H］+峰和［M+Na］+峰的響應，當［M+Na］+峰明顯高于［M+H］+峰時，選擇［M+Na］+峰為定量峰，否則選擇［M+H］+峰進行定量。

2.2 樣品前處理方法的選擇

蜂蜜較為粘稠，故先加水使其溶解再加乙腈進行提取。分別向2 g 蜂蜜中加入0.5、1.0、1.5、2.0 mL 水，充分振搖使其溶解。加入0.5 mL 水的蜂蜜粘稠不均勻，其余3 組為均勻液態，故2 g 蜂蜜至少需加入1.0 mL水進行溶解。

分別將4.0、3.5、3.0、2.5、2.0、1.5、1.0 mL 的水與2 g 蜂蜜充分混勻，再加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 乙腈充分混勻，使體系中水和乙腈的總體積為5.0 mL（即乙腈的體積分數 分 別 為20%、 30%、 40%、 50%、 60%、70%、80%），8 000 r/min 離心 10 min。結果表明，使用體積分數為20%、30%的乙腈-水時提取液不分層，其余5 組提取液分層且上層乙腈相澄清透明。

向陰性蜂蜜樣品中加入100 μL 1.00 mg/L的混合標準溶液，使用體積分數分別為40%、50%、60%、70%、80%的乙腈-水溶液按“1.3”進行處理，進樣分析。各化合物經不同體積分數的乙腈-水提取后的回收率如圖2所示。從圖中可看出使用70%乙腈-水溶液時，目標風險物質的加標回收效果最佳，故選擇70%乙腈-水進行樣品提取。

圖2 目標風險物質經不同體積分數的乙腈-水提取后的回收率Fig.2 Recoveries of target risk substances extracted with different volume fraction of acetonitrile-water

2.3 方法學考察

2.3.1 基質效應基質效應（ME）［21］指待測物質受基質影響，導致化合物響應值產生增強或抑制的現象。采用陰性蜂蜜的空白基質溶液和乙腈分別配制標準曲線，用基質匹配曲線的斜率與純溶劑曲線斜率的比值評估基質效應，ME在0.80～1.20之間時，基質效應可忽略；ME＞1.20為基質效應增強，ME＜0.80為基質效應抑制。68 種風險物質的 ME 值見表2，其中37種風險物質的基質效應介于 0.80～1.20 之間；9種風險物質的基質效應低于 0.80，介于0.452～0.799之間，雷公藤內酯甲、甲萘威、惡蟲威、涕滅威、烯蟲磷等化合物存在明顯的基質抑制現象；21種風險物質的基質效應介于1.204～1.688之間，氯霉素的基質效應為2.010，噻蟲啉、3-羥基克百威、甲基吡啶磷、啶蟲脒、氯霉素等化合物存在明顯的基質增強現象。因此本研究采用基質匹配標準曲線降低基質效應對定量結果的影響。

表2 68種風險物質的線性范圍、相關系數、檢出限、定量下限、回收率、相對標準偏差及基質效應Table 2 Linear ranges，correlation coefficients，LODs，LOQs，recoveries，RSDs and ME results of 68 risk substances

2.3.2 線性范圍、檢出限與定量下限用陰性蜂蜜的空白基質溶液配制一系列質量濃度的標準工作溶液進行檢測，目標風險物質在一定質量濃度范圍內線性良好，相關系數（r2）為 0.991 4～0.999 9；向空白樣品中添加低濃度水平的標準溶液，按“1.3”進行前處理后測定，分別以3倍、10 倍信噪比計算方法檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。測得 68 種農藥的 LOD 為 0.03～2.73 μg/kg，LOQ 為0.10～9.00μg/kg。68 種風險物質的線性范圍、檢出限和定量下限見表2。

2.3.3 回收率及相對標準偏差取蜂蜜陰性樣品添加不同水平（1.75、8.75、35.0、70.0 μg/kg）的68 種風險物質的混合標準溶液，每個水平重復6 次實驗，計算平均回收率和相對標準偏差（RSD）。方法的平均加標回收率為50.7% ～ 122%，RSD為 1.0% ～15%。

（續表2）

2.4 實際樣品測定

采用本方法對從市場采購的32 份蜂蜜樣品進行測定，在12 份樣品中檢出蠅毒磷，含量范圍為0.74～24.87 μg/kg，其余樣品均未檢出。蠅毒磷母離子的精確質量數為m/z363.021 74，測量精確質量數為m/z363.021 12，偏差為1.7×10-6，小于5×10-6，且其保留時間、同位素豐度比與標準品一致。采用 Full MS/dd-MS2采集蠅毒磷標準品和陽性樣品信號進行確證，在一級質譜圖中可見蠅毒磷的分子離子峰［M+H］+（m/z363.021 74），二級質譜圖中可見其特征碎片離子m/z226.992 52、306.958 74、211.015 47、114.961 45。樣品的二級質譜圖與標準品二級質譜圖匹配良好，可確認結果的準確性。蠅毒磷標準品及其陽性樣品的提取離子色譜圖、同位素豐度比、一級質譜圖及二級質譜圖見圖3。

圖3 蠅毒磷標準品（A）和陽性樣品（B）的提取離子色譜圖（1）、同位素豐度比（2）、一級質譜圖（3）及二級質譜圖（4）Fig.3 Extraction ion chromatograms（1），isotope abundance ratios（2），primary mass spectrograms（3） and secondary mass spectrograms（4） of coumaphos standard（A） and a positive sample（B）

3 結 論

本研究建立了蜂蜜中68 種化學風險物質的超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜分析方法。樣品經70%乙腈-水提取，糖析萃取后測定。方法操作簡單、快速、靈敏，檢出限為 0.03～2.73 μg/kg，定量下限為0.10～9.00 μg/kg，平均加標回收率為 50.7% ～ 122%，RSD 為1.0% ～15%。該方法通量高、速度快、定量準確，可用于蜂蜜中風險物質的快速篩查。