微囊藻毒素檢測用電化學生物傳感器的研究

古瑞琴,付會兵,黃 清,趙雨農,劉 歡

(1.華中科技大學集成電路學院,武漢光電國家研究中心,湖北光谷實驗室,湖北武漢 430074;2.鄭州煒盛電子科技有限公司,河南鄭州 450001)

0 引言

微囊藻毒素(MC)是在富營養化的水體環境中由微囊藻產生的具有生物活性的單環多肽類化合物,結構式如圖1(a)所示,結構中X、Y為高度可變氨基酸[1],可形成不同的異構體,目前已發現270多種[2],其中LR型微囊藻毒素(MC-LR)是眾多異構體中對人體和動物危害最大的藻類毒素之一[3-5]。MC-LR作為一種以動物肝臟為作用靶器官的藻類毒素,能夠抑制蛋白磷酸酶活性從而誘發癌癥等一系列病變,是世界各國廣泛存在且危害極大的一種藍藻毒素[6]。微囊藻毒素與腸、胃等消化道器官腫瘤也存在一定關聯[7]。

(a)微囊藻毒素結構式

鑒于微囊藻毒素的危害,國際衛生組織(WHO)建議將飲用水中的MC-LR的質量濃度控制在1.0 μg/L以內,GB 5749—2006《生活飲用水衛生標準》也規定飲用水中的MC-LR限值為1.0 μg/L。用于微囊藻毒素檢測的生物傳感器具有檢測速度快的優點,有助于實時保障飲用水的安全,得到了廣泛研究[8-9]。

檢測微囊藻毒素的電化學生物傳感器一般選取對微囊藻毒素具有特異性反應活性的材料修飾電極,利用一定條件下的電化學反應產生的電信號來判斷微囊藻毒素質量濃度。目前,基于重組蛋白修飾電極的電化學生物傳感器對微囊藻毒素的檢出限低至0.93 μg/L[10],具有檢測成本低和操作簡便的特點。

利用各類功能材料對電極進行修飾以進一步提高靈敏度,是電化學傳感器領域的研究熱點。其中,基于低維半導體材料修飾電極的電化學傳感器在重金屬離子[11-12]、蛋白生物大分子[13-14]的快速檢測中表現出了高靈敏度、高特異性的特點。低維半導體靈活可調的化學活性和導電特性使其成為一種優良的化學電極修飾材料。本文采用氧化錫膠體量子線修飾金電極,通過在氧化錫薄膜表面進一步包被MC-LR抗體,制備出對MC-LR抗原具有較高靈敏度和特異性的電化學生物傳感器。研究結果表明:氧化錫修飾提高了微囊藻毒素抗體在電極表面的富集能力,同時具有促進電荷傳輸的作用。

1 實驗

1.1 試劑與儀器

試劑:四氯化錫,油胺,甲苯、丙酮、乙醇、鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀、氯化鉀、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉,油酸;牛血清蛋白,微囊藻毒素MC-LR抗原,微囊藻毒素MC-LR單克隆抗體。

儀器:CHI660E型電化學工作站,透射電子顯微鏡,場發射掃描電子顯微鏡和傅里葉變換紅外光譜儀。

1.2 傳感器制備

1.2.1 電化學平面電極制備

在氧化鋁陶瓷襯底上絲網印刷金電極漿料,600 ℃燒結0.5 h后形成包括工作電極(WE)、對電極(CE)和參比電極(RE)的平面三電極體系。電極圖形如圖1(b)左圖所示,其中,氧化鋁陶瓷襯底尺寸為27 mm×9.6 mm×0.64 mm,工作電極直徑為3 mm。

1.2.2 二氧化錫量子線合成

向燒杯中按比例加入油酸、油胺、SnCl4·5H2O,超聲振蕩1 h使其完全溶解并混合均勻,然后向混合液中加入一定量乙醇混合均勻,轉入高壓反應釜中,在180 ℃條件下反應8 h,取出迅速用水冷卻,用甲苯與乙醇比為1:3的混合液清洗得到的產物,重復3次后使用一定量的甲苯溶解,得到質量濃度為20 mg/mL的膠體狀SnO2量子線溶液。

1.2.3 電極修飾

取上述溶液滴涂至工作電極表面,自然晾干,重復3次形成一定厚度的SnO2薄膜。再取10 μL質量濃度為30 ng/mL的微囊藻毒素MC-LR單克隆抗體溶液滴涂至SnO2薄膜上,于25 ℃條件下孵育1.5 h,然后用1 mL濃度為0.01 mol/L的pH值為7.4的磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉緩沖溶液(PBS)沖洗薄膜表面,自然晾干后即完成抗體包被。為了減少非特異性結合,在上述工作電極表面繼續滴涂10 μL質量濃度為5 μg/mL的牛血清蛋白(BSA)溶液,25 ℃封閉處理1 h,鈍化未結合抗體的SnO2表面活性位點,降低非特異吸附對測試結果的影響。最后,使用濃度為0.01 mol/L的pH值為7.4的PBS沖洗薄膜表面,得到如圖1(b)右圖所示的Au/SnO2/MC-LR-Antibody/BSA電化學生物傳感器,用于檢測MC-LR抗原(MC-LR-Antigen)。

1.3 傳感器性能測試

1.3.1 電化學性能測試

在傳感器三電極表面滴加一定量的鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀/氯化鉀([(Fe(CN)6)]3-/4-/KCl)的PBS溶液作為氧化還原介體溶液,進行電化學阻抗譜(EIS)測試,用于分析電極的電化學特性。

1.3.2 MC-LR抗原檢測性能測試

采用差分脈沖伏安(DPV)方法測試傳感器對MC-LR抗原的檢測性能。首先配制MC-LR抗原溶液,質量濃度分別為1 pg/mL、10 pg/mL、100 pg/mL、1 ng/mL、5 ng/mL和10 ng/mL。取上述不同質量濃度的MC-LR抗原溶液180 μL分別滴加至三電極表面,靜置5 min,然后用移液槍吸走待測液,并用1 mL濃度為0.01 mol/L的pH值為7.4的PBS溶液沖洗電極表面,洗掉未被牢固吸附的待測物;最后在電極表面滴加180 μL [(Fe(CN)6)]3-/4-/KCl的PBS溶液進行DPV測試,研究峰值電流隨MC-LR抗原質量濃度的變化規律。

1.3.3 抗干擾性能測試

重點考察傳感器對Hg2+、Pb2+、Cd2+等重金屬離子的抗干擾能力。分別將180 μL濃度為5 ng/mL的MC-LR抗原溶液、濃度為10-6mol/L的Hg2+、Pb2+和Cd2+標準溶液滴于三電極表面,靜置5 min后用移液槍吸走待測液,用PBS緩沖溶液沖洗電極表面后,滴加180 μL [(Fe(CN)6)]3-/4-/KCl的PBS溶液進行DPV測試。

2 結果與討論

2.1 微觀表征

合成產物的XRD圖譜如圖2(a)所示,通過與標準X射線衍射卡(JCPDS 41-1445)比較,在26°、34°、52°及65°的衍射峰分別對應SnO2的(110)、(101)、(211)和(112)晶面,為立方金紅石結構;圖2(b)所示的TEM圖也表明產物結晶性良好,形成平均線徑為3 nm左右的納米線。氧化錫的激子波爾半徑為2.7 nm,得到的SnO2線徑小于其激子波爾半徑的2倍,具有量子線材料特有的尺寸效應、量子限域效應等[15]。圖2(c)和圖2(d)分別是SnO2/MC-LR-Antibody薄膜在BSA封閉前后的SEM圖?？梢钥吹?電極表面SnO2量子線薄膜在完成微囊藻毒素抗體包被后,具有一定裂縫,與薄膜制備過程中溶劑揮發產生的應力有關;BSA封閉后,薄膜表面更為均勻平整,表明BSA封閉有填補薄膜裂縫的效果,有助于固液和固固界面的電荷轉移。

SnO2與MC-LR抗體的結合界面對傳感器性能有重要影響。SnO2量子線材料表面的長鏈油酸配體作為金屬配位基團(Sn-O)及親溶劑基團,使量子線以膠體形式穩定分散,可通過簡便的溶液法制備出高質量薄膜。同時,膠體納米材料表面的配體具有可置換性[16],在包被抗體蛋白質的過程中,可通過配體置換形成良好的偶聯,無需借助偶聯劑即可實現對抗體蛋白質的標記[13]。

本文采用傅里葉紅外光譜儀分析SnO2與MC-LR抗體以及抗體抗原之間的結合情況,分別測試了不同階段的電極樣品,結果如圖3所示。從圖3可以看出,SnO2量子線薄膜在波數為2 829～3 100 cm-1位置的C-H伸縮振動峰[17-18]和1 650 cm-1處的C=O羰基特征峰,源自SnO2薄膜表面的油酸和油胺配體[19-20]。繼續包被MC-LR抗體后,SnO2薄膜表面的官能團發生變化,2 829～3 100 cm-1處的C-H峰出現了偏移和一定程度的增強,可能是由于蛋白里C-H含量更高的原因。且1 650 cm-1處的C=O峰強度增強并且位置略微向短波方向移動,說明抗體蛋白與SnO2表面的配體結合導致表面基團發生變化,提示抗體蛋白通過配體置換與SnO2成功交聯。BSA封閉后,在波數為1 650 cm-1處出現了BSA的i帶酰胺特征峰,表明BSA穩定結合于電極表面。繼續滴加MC-LR抗原后的電極樣品,由于MC-LR抗原含有共軛雙鍵(C=C)及特征官能團胍基,因此在1 540 cm-1出現共軛雙鍵的伸縮振動峰[21]。上述結果表明,SnO2及各修飾材料在電極表面能夠很好的附著。

圖3 不同電極樣品的FTIR測試圖譜

2.2 電化學特性分析

在平面三電極表面滴加一定量的[(Fe(CN)6)]3-/4-/KCl溶液作為氧化還原介體溶液,分別進行DPV和EIS測試,用于分析電極的電化學特性。

首先對比測試了Au電極直接復合MC-LR抗體(Au/MC-LR)和先在Au電極上修飾SnO2后復合MC-LR抗體(Au/SnO2/MC-LR-Antibody)的電極在[(Fe(CN)6)]3-/4-/KCl溶液中的電化學阻抗譜和DPV曲線,由電化學阻抗譜和DPV曲線分別計算電極的Rct和DPV峰電流,結果如圖4所示。從圖4可以看出,修飾SnO2后,電極的Rct變小,電子導電能力增強,這可能和SnO2量子點的量子隧道效應有關。并且修飾SnO2后DPV曲線的峰電流增大,說明電極對離子的富集能力增強、電極活性增加。

(a)SnO2修飾前后的Rct的大小對比

電極的電子傳輸能力是影響傳感器檢測靈敏度的重要因素,所以采用電化學阻抗譜(EIS)測試表面逐層修飾不同材料后的電極樣品電化學特性,如圖5(a)所示,按照5(a)中插圖的等效電路分析電化學體系的電阻特性和電容特性,研究電極的電子傳輸能力。半圓部分代表Rct的大小,反映電極的電子傳輸能力,結果表明:隨著表面修飾材料依次增加,Rct先增大后減小;直線部分的斜率代表Cd的大小,反映雙電層對電化學反應的影響,不同樣品的EIS曲線直線部分基本保持平行,可能是由于電極所在液體環境離子濃度相對較低,所以Cd變化不大。

(a)依次修飾不同材料后的電化學阻抗圖(插圖部分為該電化學體系的等效電路)

圖5(b)進一步對比了根據EIS曲線提取的各電極樣品Rct的大小。金電極上修飾SnO2后,Rct顯著增大,表明電子傳輸能力下降,但在MC-LR抗體包被和BSA封閉之后,Rct有所降低,原因可能在于蛋白分子的高活性促進了Fe3+/Fe2+離子在電極表面的吸附,并在一定的電壓條件下發生電子轉移,因此抗體蛋白可促進電子傳輸,表現為Rct降低。

2.3 電極修飾工藝條件優化

影響化學修飾電極對MC-LR抗原檢測結果的因素很多,本文按照表1所示條件分別研究MC-LR抗體的質量濃度及其包被時間、封閉劑BSA的質量濃度及封閉時間對傳感器性能的影響,如圖6所示。采用電化學工作站測試傳感器在[(Fe(CN)6)]3-/4-/KCl的PBS溶液中的DPV曲線,通過DPV曲線中峰電流的大小判斷電極的最佳修飾條件。峰電流越大,電極的導電能力越好,通過優化電極修飾條件提升電極的導電能力。

表1 電極修飾優化參數

(a)不同抗體質量濃度的DPV曲線

圖6(a)是不同質量濃度抗體對應的電極樣品在180 μL [(Fe(CN)6)]3-/4-/KCl的PBS溶液進行DPV測試的結果,插圖是提取的DPV曲線的峰電流柱狀圖。從圖6(a)中可以看出,在其他工藝參數不變的前提下,隨著抗體質量濃度增加,DPV峰電流先增大后減小,當所修飾的抗體質量濃度為30 ng/mL時,峰電流最大。原因可能是隨著所修飾抗體質量濃度的增加,吸附在SnO2表面的抗體數量逐漸增加,抗體對Fe3+/Fe2+的吸附量逐漸增多,氧化還原反應產生的電流也逐漸增大;隨著抗體濃度的繼續增加并在電極表面造成過剩積聚,阻礙了吸附在電極表面的Fe3+/Fe2+產生的電信號在SnO2/Au導電層傳導,導致峰電流減小。

進一步研究抗體包被時間對電極DPV峰電流的影響,如圖6(b)所示,隨著包被時間的延長,峰電流也表現出先增大后減小的趨勢,在抗體質量濃度為30 ng/mL時,修飾時間為1.5 h時峰電流最大。這可能是因為在濃度梯度的作用下,MC-LR抗體逐漸與SnO2結合,當電極表面包被的抗體達到飽和之后,隨著修飾時間的延長,多余的抗體在電極積聚,不利于電荷傳輸。

圖6(c)是不同質量濃度BSA封閉條件下的DPV對比,從結果可以看出,在實驗范圍內,隨著BSA質量濃度的增大,峰值電流逐漸減小,說明BSA蛋白質有阻礙電極表面電荷傳輸的作用,在達到阻礙非特異性結合封閉效果的前提下,BSA的量可以盡量小,本文中BSA最優質量濃度為5 μg/mL。

進一步研究了BSA封閉時間的影響,從圖6(d)可以看出,在實驗范圍內,封閉時間對峰電流的影響無明顯規律,按照峰電流盡可能大、修飾時間盡可能短的原則,優選修飾時間為1 h。

通過上述單因素試驗,確定電極修飾最佳工藝條件為:MC-LR抗體質量濃度為30 ng/mL,修飾時間為1.5 h;BSA質量濃度為5 μg/mL,封閉時間為1 h。

2.4 傳感器對MC-LR的檢測性能

差分脈沖伏安法作為一種常用的電化學分析方法,可顯著降低背景電流的影響,保證檢測的高靈敏度和高分辨率,適用于低質量濃度生物化學分子的檢測。按照2.3優化的條件制備電化學生物傳感器,并分別對濃度范圍在1 pg/mL～10 ng/mL的6種質量濃度MC-LR抗原溶液進行DPV測試,結果如圖7(a)所示。

(a)修飾電極對不同質量濃度MC-LR抗原的DPV曲線

從圖7(a)中可以看出在不同質量濃度的MC-LR抗原溶液中,傳感器均有明顯的DPV氧化峰電流。在PBS溶液中,電極在0 V左右存在明顯的溶出峰,可能是SnO2在0 V左右發生氧化還原反應所致。隨著MC-LR質量濃度的升高,MC-LR抗體與抗原進行特異性結合的量增多,抗原與抗體結合發生氧化還原反應釋放的電荷增多,峰電流逐漸增大,峰電流I(單位:μA)與MC-LR抗原質量濃度C(單位:ng/mL)線性相關且滿足如下方程:

I=-17.7C-230.4

線性相關系數R2=0.97,如圖7(b)所示。采用3SDblank/slope方法計算其檢測下限(LOD)為0.33 pg/mL。

表2將本工作與不同方法檢測MC-LR毒素的研究報道進行了對比,可以看出本工作采用SnO2量子線偶聯MC-LR抗體進行MC-LR抗原檢測,具有檢測靈敏度高、檢測下限低的優點。自然界水體環境復雜,可能存在Hg2+、Pb2+、Cd2+等重金屬離子,因此研究該傳感器對這些干擾離子的響應情況很有必要。本文采用上述方法制備的電化學生物傳感器對Hg2+、Pb2+、Cd2+3種重金屬離子的標準溶液進行DPV測試,并對測試結果進行歸一化處理,如圖7(c)所示,可以看出傳感器對3種重金屬離子的歸一化響應值均小于0.2,說明這種基于SnO2量子線構建的電化學生物傳感器具有較強的抗重金屬干擾的能力。

表2 化學修飾電極用于微囊藻毒素MC-LR檢測的性能對比

3 結論

本文利用SnO2量子線的高比表面積和大量的懸掛鍵、吸附位點豐富的特點,構建全固態電化學生物傳感器。利用SnO2膠體量子線的配體中的羰基和羧基與MC-LR抗體的特性位點進行交聯達到穩定修飾的目的,BSA封閉劑進一步提高了傳感器對MC-LR抗原的特異性;MC-LR抗體與SnO2修飾層結合,形成離子接受和電子傳輸的功能層,提升了檢測效率,從而實現了對MC-LR抗原的高特異性和高靈敏度檢測。該傳感器具有制備方法簡單,使用方便的特點,可快速檢測水體中的MC-LR。這種基于量子線修飾的電化學生物傳感器具有檢測成本低、平臺拓展性強、檢測速度快、選擇性好等優點,具有廣闊的應用空間。