肉蓯蓉治療腎陽虛有效部位篩選

蘇國明 ，張超 ，華悅 ，程世贊 ，廉婧 ，聶紫璇 ，史輯， ，賈天柱，

1.遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600； 2.遼寧省中藥炮制技術產業創新中心，遼寧 大連 116600

肉蓯蓉為列當科植物肉蓯蓉Cistanche deserticolaY.C.Ma的干燥帶鱗葉肉質莖，始載于《神農本草經》，被列為上品，其性溫，味甘、咸，歸腎、大腸經，有補腎陽、益精血、潤腸便功效?？捎糜谀I陽不足、精血虧虛所致陽痿、不孕、腰膝酸軟、筋骨無力、腸燥便秘等病癥[1]。肉蓯蓉含多種類型化學物質，已從肉蓯蓉屬植物中分離鑒定出的成分包括苯乙醇苷類、環烯醚萜類、木脂素類、寡糖、多糖等，具有神經保護、免疫調節、抗衰老等藥理作用[2-5]。

肉蓯蓉的苯乙醇苷類成分為補腎陽、提高免疫功能、抗老年癡呆癥的活性成分[6]。肉蓯蓉總苷能顯著提高亞急性衰老小鼠超氧化物歧化酶（SOD）活性，并明顯降低小鼠腦、肝臟中脂質過氧化物含量，具有抗氧化及延緩腎臟衰老、提高精子質量等作用[7-8]。肉蓯蓉總苷可明顯降低正常小鼠水迷宮實驗到達終點的時間[9]。肉蓯蓉總苷對癡呆小鼠也具有明顯改善記憶功能的作用[10]。肉蓯蓉總苷能提高模型小鼠淋巴細胞轉化能力、腹腔巨噬細胞吞噬功能、NK細胞活性、并可明顯增強D-半乳糖致衰老小鼠的免疫功能[11]。肉蓯蓉多糖具有顯著的免疫活性作用，能夠促進小鼠胸腺淋巴細胞增殖[12]。

腎陽虛證為中醫臨床常見證候，是多種病理、生理變化共同導致的功能紊亂狀態[13]?，F代醫學研究認為，腎陽虛證與神經內分泌免疫網絡密切相關，由于介導網絡平衡功能的相關物質基因表達出現異常，導致神經內分泌免疫網絡功能失衡，可用溫補、滋補、填補方法改善腎陽，增強患者的免疫力[14]。腎陽虛調控樞紐定位在下丘腦，下丘腦-垂體-腎上腺軸/甲狀腺軸/性腺軸功能障礙和功能低下是腎陽虛證的基礎。下丘腦-垂體-腎上腺軸（HPA軸）是維持人體基本生命活動的重要內分泌功能軸之一，腎陽虛證常伴隨著下丘腦-垂體-靶腺軸的功能低下，體現在相應腎上腺、甲狀腺及性腺內分泌的激素類生物學指標仍然是評價腎陽虛證的重要指標[15]。甲狀腺是人體內最大的內分泌腺，主要受下丘腦與垂體調節，下丘腦釋放促甲狀腺素釋放激素（TRH），調節腺垂體分泌促甲狀腺激素（TSH），TSH進一步引起甲狀腺激素釋放[16]，血液甲狀腺激素濃度變化通過負反饋調節下丘腦TRH和垂體TSH的分泌，構成下丘腦-垂體-甲狀腺軸（HPT軸）的自發性控制環路。三碘甲狀腺原氨酸（T3）是診斷甲狀腺功能亢進癥的特異性指標，甲狀腺素（T4）是甲狀腺分泌最豐富的激素，腎陽虛患者臨床通常表現為甲狀腺功能降低[17]，因此反映其功能下降的指標是腎陽虛證較為特異的生理指標[18]。本研究通過灌胃給予丙基硫氧嘧啶復制大鼠腎陽虛模型，比較肉蓯蓉不同提取部位總多糖、總寡糖、總苷對HPA軸及HPT軸相關指標的調節作用，篩選肉蓯蓉補腎壯陽的有效部位，為后續肉蓯蓉酒蒸前后化學成分變化規律及藥效變化的作用機制研究提供依據。

1 儀器、試藥與動物

酶標儀（型號3530911931），賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；自動洗板機（型號HBS-4009），南京德鐵實驗設備有限公司；恒溫振蕩器（型號SHA-C），浙江明德儀器有限公司；精密電子天平（型號FA1004B），瑞士梅特勒-托利多公司；電子體溫計（型號MC-347），歐姆龍健康醫療（中國）有限公司；通用臺式高速冷凍離心機（型號Sigma 3k15），湘儀離心機儀器有限公司；醫用離心機（型號TDZ5-WS），曦瑪離心機（揚州）有限公司；水浴鍋（型號HH-S2），鄭州長城科工貿有限公司；電熱套（型號PTHW），北京亞歐德鵬科技有限公司；自動包埋機（型號BM450A），湖北伯納醫療科技有限公司；切片機（型號DQ-100），德國Leica；顯微鏡（型號CX31RTSF），日本Olympus。

肉蓯蓉藥材于2019年5月采自內蒙古阿拉善，批號20190508-1，經遼寧中醫藥大學藥學院李峰教授鑒定為列當科植物肉蓯蓉CistanchedeserticolaY.C.Ma的干燥帶鱗葉肉質莖，標本保存于遼寧省中藥炮制技術產業創新中心。丙基硫氧嘧啶（批號1102C021），北京索萊寶科技有限公司；桂附地黃丸（批號202104053），九芝堂股份有限公司；T3（批號211026）、T4（批號211026）、TSH（批號211026）、環磷酸腺苷（cAMP，批號211026）、環磷酸鳥苷（cGMP，批號211026）、皮質醇（Cor，批號211026）、促腎上腺皮質激素（ACTH，批號211026）、睪酮（T，批號211026）、雌二醇（E2，批號211026）ELISA試劑盒，上?？婆d生物科技有限公司。

SPF級SD雄性大鼠48只，體質量180～220g，遼寧長生生物技術有限公司提供，許可證號SCXK（遼）2020-0001。飼養環境濕度50%～80%，溫度18～22 ℃。動物實驗遵循遼寧中醫藥大學有關實驗動物管理和使用規定。

2 方法與結果

2.1 肉蓯蓉有效部位制備

取肉蓯蓉藥材1 kg，分別以10、8、8倍量水回流提取3次，每次1 h，合并濾液，適當濃縮后加乙醇至體積分數為40%，4 ℃靜置過夜，3 000 r/min 離心15 min，反復3次，收集沉淀，即為粗多糖，以Sevage法除蛋白，重復3次，冷凍干燥，得總多糖138.1 g。離心所得上清液，減壓濃縮至無醇味，上預處理好的D101大孔吸附樹脂柱，收集水洗脫部位和40%乙醇洗脫部位，濃縮，減壓干燥，得到總寡糖部分106.6 g和總苷部分79.6 g。計算總多糖、總寡糖、總苷得率分別為13.81%、10.46%、7.86%。

2.2 造模、給藥及取材

將48只大鼠隨機分為6組，分別為空白組、模型組、陽性藥組、肉蓯蓉總多糖組（多糖組）、肉蓯蓉總寡糖組（寡糖組）和肉蓯蓉總苷組（總苷組），每組8只?？瞻捉M使用純水灌胃，其余各組大鼠每日灌胃丙基硫氧嘧啶（10 mg/kg）連續15 d，制備腎陽虛模型。各給藥組按體表面積和人與動物臨床劑量倍數直接換算法及肉蓯蓉各部位得率計算，將肉蓯蓉總多糖、總寡糖、總苷分別溶于水中，配制成濃度分別為總多糖14.5 mg/mL、總寡糖11 mg/mL、總苷8.2 mg/mL的溶液。從第16日開始，多糖組（145 mg/kg）、寡糖組（110 mg/kg）、總苷組（82 mg/kg）分別予相應藥液灌胃，陽性藥組予原藥材0.936 g/kg桂附地黃丸混懸液（桂附地黃丸于研缽中研碎，溶于純水中），灌胃體積均為10 mL/kg，空白組和模型組予等量生理鹽水灌胃，每日1次，連續15 d。末次給藥后禁食不禁水，24 h后各組大鼠用20%烏拉坦溶液0.6 mL/100 g腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，采血管靜置30 min后，3 500 r/min離心15 min，分離血清，-20 ℃保存。大鼠斷頭取腦，冰上分離下丘腦，-80 ℃冰箱保存。

2.3 肉蓯蓉不同提取部位對大鼠一般情況的影響

觀察各組大鼠造模前后及給藥后的一般狀態，包括體質量、進食量、活動情況、精神狀態、排便及肛溫變化。給藥第15日各組大鼠均禁食，自由飲水，記錄末次給藥24 h后大鼠體質量和肛溫。

與空白組比較，模型組大鼠表現為反應遲鈍、畏冷蜷縮、飲食減少、小便頻數、大便稀溏等，各給藥組大鼠上述癥狀均有所改善。模型組大鼠體質量增長速度明顯慢于空白組。陽性藥組大鼠體質量在21 d后逐漸趨于穩定，其余各給藥組大鼠體質量持續增加。與空白組比較，其余各組大鼠肛溫在造模期間均明顯降低，各給藥組給藥后大鼠肛溫均不同程度升高。與模型組比較，總苷組和寡糖組大鼠肛溫有上升趨勢，其中總苷組回升較為明顯。見圖1。

圖1 各組大鼠平均體質量、肛溫變化趨勢（每組8只）

2.4 肉蓯蓉不同提取部位對臟器指數的影響

末次給藥后，各組大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射20%烏拉坦溶液0.6 mL/100 g麻醉，腹主動脈取血后，摘取大鼠完整的腎臟、脾臟、睪丸、腎上腺，去掉筋膜及脂肪組織，用濾紙吸干臟器表面血污，分別稱定質量，計算脾臟、胸腺、睪丸、腎上腺的臟器指數。臟器指數（%）=臟器質量÷體質量×100%。

與空白組比較，模型組大鼠腎臟指數、脾臟指數、腎上腺指數均顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01），睪丸指數呈上升趨勢；與模型組比較，寡糖組大鼠腎臟指數呈上升趨勢，陽性藥組、多糖組、總苷組大鼠脾臟指數均呈上升趨勢，各給藥組大鼠腎上腺指數呈上升趨勢，睪丸指數呈下降趨勢，陽性藥組大鼠睪丸指數顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠腎臟、脾臟、睪丸、腎上腺指數比較（±s，%，每組8只）

表1 各組大鼠腎臟、脾臟、睪丸、腎上腺指數比較（±s，%，每組8只）

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

腎上腺指數0.006 1±0.001 4 0.004 7±0.000 9*0.005 2±0.001 3 0.005 6±0.001 0 0.005 1±0.000 6 0.005 5±0.000 9組別空白組模型組陽性藥組多糖組寡糖組總苷組劑量/（g/kg）0.936 0.145 0.110 0.082腎臟指數0.319 3±0.026 7 0.271 3±0.012 4**0.256 7±0.017 3 0.276 8±0.027 4 0.282 6±0.020 4 0.263 7±0.027 9脾臟指數0.177 3±0.020 7 0.140 3±0.018 7**0.155 2±0.020 5 0.158 2±0.017 6 0.135 8±0.012 1 0.143 6±0.010 3睪丸指數0.545 1±0.046 5 0.579 0±0.035 8 0.521 2±0.071 0#0.541 8±0.054 0 0.564 6±0.038 1 0.568 5±0.026 1

2.5 肉蓯蓉不同提取部位對甲狀腺激素水平的影響

取凍存血清樣品放至室溫，檢測血清T3、T4、TSH含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

與空白組比較，模型組大鼠血清T3、TSH含量顯著升高，血清T4含量下降（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組血清T3含量顯著降低（P＜0.01）；陽性藥組、多糖組大鼠血清TSH含量呈下降趨勢，寡糖組、總苷組血清TSH含量顯著下降（P＜0.01）；陽性藥組、寡糖組及總苷組大鼠血清T4含量上升（P＜0.05，P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清T3、T4、TSH含量比較（±s，每組8只）

表2 各組大鼠血清T3、T4、TSH含量比較（±s，每組8只）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組陽性藥組多糖組寡糖組總苷組T4/（mU/L）241.75±20.79 239.42±26.42*253.99± 7.46##232.61±16.41 251.28±28.08#256.41± 5.21##劑量/（g/kg）0.936 0.145 0.110 0.082 T3/（ng/mL）6.74±0.67 7.26±0.93*6.44±0.40##6.50±0.28##6.39±0.23##6.51±0.39##TSH/（ng/mL）13.40±0.84 14.18±0.62*13.71±0.32 14.11±1.09 13.10±1.59##13.03±0.63##

2.6 肉蓯蓉不同提取部位對下丘腦-垂體-腎上腺軸相關指標的影響

取凍存血清樣品放至室溫，檢測血清T、E2、ACTH、Cor含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

與空白組比較，模型組大鼠血清T含量顯著降低（P＜0.05），血清E2含量呈下降趨勢，血清Cor含量呈上升趨勢。與模型組比較，陽性藥組和寡糖組大鼠血清T含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；各給藥組大鼠血清E2含量均呈上升趨勢；陽性藥組、寡糖組和總苷組大鼠血清ACTH含量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）；陽性藥組和總苷組大鼠血清Cor含量顯著降低（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠血清T、E2、ACTH、Cor含量比較（±s，每組8只）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別空白組模型組陽性藥組多糖組寡糖組總苷組Cor/（ng/mL）106.73±2.55 108.62±2.34 116.81±2.32##106.81±2.67 108.43±1.63 76.25±2.30##劑量/（g/kg）E2/0.936 0.145 0.110 0.082 T/（ng/mL）120.62±4.24 113.58±5.56*120.70±5.60#116.53±4.31 122.33±3.44##112.67±4.43（pg/mL）50.18±1.49 49.48±2.52 51.89±2.79 50.11±1.56 51.43±2.28 51.64±1.64 ACTH/（pg/mL）91.96±1.61 91.23±1.55 98.78±2.91##90.92±1.86 94.44±1.35#94.88±1.95#

2.7 肉蓯蓉不同提取部位對環磷酸腺苷、環磷酸鳥苷含量和cAMP/cGMP比值的影響

檢測各組大鼠血清cAMP、cGMP含量，嚴格按試劑盒說明書操作，并計算cAMP/cGMP比值。

與空白組比較，模型組大鼠cAMP含量無顯著變化，cGMP含量顯著升高（P＜0.01），cAMP/cGMP比值呈降低趨勢；與模型組比較，陽性藥組cAMP含量顯著升高，寡糖組cAMP含量顯著降低，多糖組、寡糖組、總苷組cGMP 含量均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，陽性藥組和多糖組cAMP/cGMP比值顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表4。

表4 各組大鼠血清cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值比較（±s，每組8只）

表4 各組大鼠血清cAMP、cGMP含量及cAMP/cGMP比值比較（±s，每組8只）

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別cAMP/cGMP 劑量/（g/kg）cAMP cGMP空白組模型組陽性藥組多糖組寡糖組總苷組0.062±0.005 0.057±0.004 0.064±0.002#0.068±0.002##0.057±0.002 0.061±0.003 0.936 0.145 0.110 0.082 0.78±0.03 0.80±0.04 0.88±0.03#0.84±0.03 0.68±0.03##0.79±0.04 12.55±0.54 13.93±0.61**13.68±0.09 12.25±0.15##12.01±0.68##12.89±0.35#

2.8 肉蓯蓉不同提取部位對下丘腦激素mRNA表達的影響

采用RT-PCR檢測大鼠下丘腦TRH、促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）mRNA表達。每組大鼠取下丘腦組織4～5個，用TRIZOL試劑盒提取總RNA，進行基因組DNA去除反應、反轉錄反應，合成cDNA。取反轉錄產物2 μL，加入18 μL擴增反應體系（上下游引物各0.4 μL，反轉錄試劑10 μL，DEPC水補足），進行PCR。反應條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 min，40個循環。大鼠基因引物購自艾科瑞生物工程有限公司，引物序列見表5。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

表5 各基因PCR引物序列

與空白組比較，模型組大鼠下丘腦TRH、CRH mRNA表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，總苷組大鼠下丘腦TRH、CRH mRNA表達顯著上調（P＜0.05），總寡糖組與總多糖組CRH mRNA表達呈上調趨勢。見表6。

表6 各組大鼠下丘腦TRH、CRH mRNA表達比較（±s）

表6 各組大鼠下丘腦TRH、CRH mRNA表達比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

CRH 1.00±0.31 0.78±0.19*1.06±0.14 0.77±0.07 0.83±0.14 0.89±0.18#組別空白組模型組陽性藥組多糖組寡糖組總苷組劑量/（g/kg）只數0.936 0.145 0.110 0.082 8 8 8 8 8 8 TRH 1.00±0.27 0.82±0.17*1.84±0.14 0.95±0.18 0.96±0.12 1.04±0.09#

2.9 肉蓯蓉不同提取部位對腎組織形態的影響

取大鼠右腎組織，用10%多聚甲醛固定過夜、脫水、石蠟包埋，切片（厚度4 μm），HE染色后，晾干封片，于光鏡下觀察腎組織形態，見圖2。

圖2 各組大鼠腎組織形態（HE染色，×200）

空白組大鼠腎小管結構清晰，細胞排列整齊；模型組腎間質充血，腎小球腫脹，可見炎性細胞浸潤，腎小球囊腔內出現紅染，腎小管上皮細胞變性、壞死；與模型組比較，各給藥組腎小管損傷明顯改善，其中總苷組腎小球腫脹不明顯，囊腔內界限清晰，且腎小管腫脹減輕，改善水腫能力最為明顯。

3 討論

肉蓯蓉為常用補陽藥，治療腎陽不足、精血虧虛、陽痿不孕、腰膝酸軟、筋骨無力等癥，且補而不峻。腎陽虛可見畏寒肢冷、夜尿頻多、舌淡苔白、脈沉遲無力等虛寒征象[19]。下丘腦-垂體-靶腺軸不同環節和不同程度的功能失調是腎陽虛的主要病理基礎[20]，關鍵環節是下丘腦損傷和功能紊亂。內分泌功能紊亂、激素水平異常是引起腎陽虛的重要因素，大腦垂體分泌的TSH和ACTH調節甲狀腺和腎上腺功能，促進T3、T4和Cor合成釋放[21]。HPA軸下丘腦室旁核分泌CRH，與ACTH細胞膜上的CRH-R1結合，促進腺垂體分泌ACTH及腎上腺合成和分泌Cor。HPT軸下丘腦釋放TRH刺激腺垂體細胞分泌TSH，TSH又可促進T3和T4的合成及分泌，參與機體生長發育、基礎代謝等多種功能活動。改善腎功能和下丘腦-垂體-靶腺軸相關激素紊亂[22]對腎陽虛大鼠癥狀體征、相關激素水平的調節、腎功能的改善均有較好效果。

肉蓯蓉主要含苯乙醇苷類、環烯醚萜苷類、多糖、寡糖等成分，其中苯乙醇苷類成分，如松果菊苷、毛蕊花糖苷為2020年版《中華人民共和國藥典》規定的肉蓯蓉指標性成分，此外還有異毛蕊花糖苷、肉蓯蓉苷F、2-乙酰毛蕊化糖苷等苯乙醇苷類成分；苯乙醇苷類成分具有抗疲勞、抗衰老[23]、抗老年癡呆、抗神經退行性疾病等，以及改善生殖功能、抗骨質疏松、保護缺血和保護肝臟等藥理作用[24]。環烯醚萜苷類主要有梓醇、益母草苷、6-去氧梓醇、8-表脫氧馬錢子酸、京尼平苷酸等，具有內分泌調節、免疫調節、抗炎、抗腫瘤、調節性腺軸激素水平[25]、保護肝臟活性等方面的藥理作用。

本實驗采用灌胃給予丙基硫氧嘧啶致大鼠腎陽虛模型，正常大鼠皮毛柔順干爽、有光澤且行動較為活潑，造模后大鼠體毛顏色黯淡，且較為稀疏，反應遲鈍，畏冷蜷縮，飲食減少，抱團少動。模型組大鼠體質量、肛溫明顯下降，腎臟、脾臟、腎上腺指數明顯下降，睪丸指數上升，出現明顯的腎陽虛癥狀。模型組大鼠血清T4含量下降，T3、TSH含量上升，cAMP含量無明顯變化、cGMP 含量顯著升高。下丘腦TRH、CRH mRNA表達顯著降低。各給藥組對TSH有回調作用，總苷組對TSH回調效果顯著；寡糖組和總苷組下丘腦CRH mRNA表達水平上升，總苷組上升最為明顯；多糖組、寡糖組和總苷組TRH mRNA表達水平均升高，總苷組升高最為明顯。表明肉蓯蓉對腎陽虛大鼠的HPT軸穩態有很好的調節作用。

HPA 軸相關指標測定顯示，模型組大鼠血清ACTH、T、E2含量下降，Cor含量上升?？傑战M、多糖組和總寡糖組T、E2含量升高，寡糖組和總苷組ACTH含量上升，多糖組和總苷組Cor含量下降。其中總苷組對T、E2、T4、ACTH和Cor的調節作用最明顯，表明肉蓯蓉總苷對HPA軸功能穩態有很好的調節作用。

綜上，肉蓯蓉的總苷類成分、總多糖和總寡糖均可有效改善脾臟、睪丸、腎上腺臟器指數，以及HPA軸和HPT軸相關指標，其中總苷組表現最佳。后續將對總苷成分和總多糖物質在炮制過程中的變化規律進行深入研究。