健脾益心方對心肌梗死大鼠炎癥及心室重塑的影響

向密，路迎冬，張洋，辛來運，崔向寧

中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053

心肌梗死（myocardial infarction，MI）是由冠狀動脈缺血缺氧導致的心肌組織損傷或缺血性壞死，其發病率和病死率高，病情進展迅速，預后差[1]。心肌重構由MI后一系列病理改變引起或加重，病理表現為心肌肥厚和纖維化，導致心功能障礙、心力衰竭、惡性心律失常，甚至心源性死亡[2-4]。盡管多種技術廣泛應用于臨床治療，但仍缺乏更有效的方法[5]。

研究發現，炎癥反應參與心肌損傷的發展變化，炎癥細胞可通過細胞表型轉化、分泌細胞因子和生長因子等影響心臟炎癥、梗死面積和心肌纖維化，加重心肌損傷，導致心室重塑，損害心功能[6]。中藥可通過多成分、多靶點、多途徑綜合干預，一定程度上控制炎癥反應和心室肥大，抑制急性MI后心室重塑[7]。心脾失調是病理產物“痰”“瘀”產生的直接病因，作為后天之本的脾是MI及MI后心力衰竭發病的重要臟腑。故推測可用祛濕化飲法治療MI，擬健脾益心方。該方由益氣補虛之保元湯[8]與健脾利濕之苓桂術甘湯[9]化裁，有益氣健脾、利水行瘀功效，可顯著改善心力衰竭患者臨床癥狀、活動耐量及生活質量，改善心功能，減輕炎癥[10]。本研究通過左冠狀動脈前降支結扎法建立MI大鼠模型，并予健脾益心方干預，觀察其對大鼠炎癥及心室重塑的影響，明確該方治療MI 的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠27只，體質量200～220 g，北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物生產許可證號SCXK（京）2020-0004。飼養于中國中醫科學院廣安門醫院實驗動物中心SPF級實驗環境，溫度20～25 ℃，濕度40%～60%，自然光照循環，自由攝食飲水。實驗過程按照《實驗動物管理和使用規定》進行，并經中國中醫科學院廣安門醫院動物倫理委員會審批（IACUC-GAMH-2022-041）。

1.2 藥物

健脾益心方（黃芪30 g，人參10 g，桂枝10 g，茯苓30 g，麩炒白術15 g，澤瀉30 g，丹參20 g，大腹皮15 g，葶藶子15 g，當歸15 g），飲片由中國中醫科學院廣安門醫院中藥房提供，均符合《中華人民共和國藥典》規定。按用量取上述中藥飲片，加入蒸餾水浸泡30 min，煎煮30 min，過濾，殘渣加蒸餾水，繼續煎煮30 min，過濾，合并2次濾液，濃縮成含原藥材1.9 g/mL藥液，分裝后置于4 ℃冰箱保存備用。

1.3 主要試劑與儀器

HE 染色試劑盒，貨號G1120，北京索萊寶；Masson染色試劑盒，貨號BA4079B，珠海貝索生物；4%多聚甲醛，貨號P1110，北京索萊寶；TUNEL染色試劑盒，貨號11684795910，瑞士Roche；RIPA 裂解液，貨號R0010，北京索萊寶；BCA蛋白定量試劑盒，貨號PC0020，北京索萊寶；ECL 發光液，貨號1705062，美國Bio-Rad；凝膠制備試劑盒，貨號161-0183，美國Bio-Rad；10×TBST緩沖液，貨號T1081，北京索萊寶；5×蛋白上樣緩沖液，貨號P1040，北京索萊寶；5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液，貨號T1070，北京索萊 寶； Bcl-2 抗 體， 貨 號26593-1-AP， 美 國Proteintech；Bax 抗體，貨號WL01637，沈陽萬類生物；細胞色素c（Cytc）抗體，貨號11940S，美國CST；Cleaved Caspase-3 抗體，貨號9664S，美國CST；NOD 樣受體蛋白3（NLRP3）抗體，貨號R30750，美國NSJBIO；凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）抗體，貨號DF6304，美國Affinity Biosciences；Caspase-1抗體，貨號sc-392736，美國Santa Cruz；核因子（NF）-κB p50抗體，貨號ab32360，英國Abcam；白細胞介素（IL）-6抗體，貨號ab9324，英國Abcam；IL-1β抗體，貨號AF5103，美國Affinity Biosciences；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，貨號bs-40295GHRP，北京博奧森；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG，貨號A0216，上海碧云天。

ALC-V8S 小動物呼吸機，上海奧爾科特；Vevo2100超高分辨率動物專用超聲成像系統，加拿大Visual Sonics；CKX53 熒光顯微鏡，日本Olympus；Mini-PROTEAN 凝膠電泳系統，美國Bio-Rad；DocTMXR+凝膠成像系統，美國Bio-Rad；BY-R20高速離心機，北京白洋醫療器械有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統，美國Millipore；Spark?多功能酶標儀，上海Tecan；EG1150 包埋機，德國Leica；SM2010R病理切片機，德國Leica。

2 實驗方法

2.1 造模、分組及給藥

隨機選取18只大鼠，采用左冠狀動脈前降支結扎法制備MI模型[11-13]。大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉，氣管插管，側開胸暴露心臟，用5-0手術縫合線在左冠狀動脈前降支距左心耳邊緣下2～3 mm處結扎，穩定后可見心臟表面變白。關胸，縫合皮膚。次日檢測大鼠術后24 h心電圖，根據病理性Q波判斷造模是否成功。另取9只作為假手術組，操作相同，但縫合線僅穿過左冠狀動脈，不結扎。術后將存活且造模成功的大鼠隨機分為模型組和健脾益心方組，每組9只。

造模成功后開始給藥，按人與大鼠換算系數計算給藥劑量，健脾益心方組予健脾益心方藥液19.95 g/kg灌胃，灌胃體積10.5 mL/kg，每日1次，連續4周。假手術組和模型組予等體積生理鹽水灌胃。

2.2 超聲心動圖檢測

給藥結束后，通過無創超聲心動圖評估大鼠心臟結構和功能。稱量大鼠體質量，腹腔注射戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，于乳頭肌水平記錄左室長軸二維超聲心動圖，測量左室射血分數（LVEF）、左室短軸縮短率（LVFS）、左室舒張末期前壁厚度（LVAWd）、左室收縮末期前壁厚度（LVAWs）、左室舒張末期內徑（LVIDd）、左室收縮末期內徑（LVIDs）、左室舒張末期容積（LVEDV）和左室收縮末期容積（LVESV）。以上參數均測量3 個心動周期，取平均值作為最終結果。

2.3 標本采集

超聲心動圖檢測后，于大鼠腹部縱向切口，逐層打開腹腔，輕輕撥開腹腔臟器后進行腹主動脈取血。采血后迅速打開大鼠胸腔，取出心臟，去除其他附著物，用冷生理鹽水沖洗干凈，稱量心臟質量，計算心臟質量比（心臟質量/體質量），評估心臟肥大情況。在最大橫徑處橫切成2部分，心底部分用4%多聚甲醛固定，用于組織病理形態觀察和免疫組化檢測，心尖部分置于-80 ℃保存，用于Western blot檢測。

2.4 心肌組織病理觀察

心肌組織經4%多聚甲醛固定過夜后，脫水透明，石蠟包埋，切成4 μm切片，分別行HE 和Masson 染色，光學顯微鏡下觀察心肌組織病理變化，用Image J軟件計算心肌纖維化面積比（陽性染色面積÷總面積×100%），評估心肌纖維化嚴重程度。

2.5 TUNEL染色

心肌組織石蠟切片先用二甲苯浸洗5 min×2次，梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）分別浸泡3 min，PBS漂洗3次，加Proteinase K工作液處理，待玻片干后，加TUNEL 反應液50 μL，PBS 漂洗3 次，熒光顯微鏡下觀察，采用Image J軟件分析心肌細胞凋亡率（凋亡細胞數÷總細胞數×100%）。

2.6 Western blot檢測

取心肌組織，加入RIPA裂解液提取蛋白，BCA法進行定量分析。以20 μg蛋白上樣，經10%凝膠電泳分離，將蛋白轉移至PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加Cytc一抗（1∶1 000）、Cleaved Caspase-3一抗（1∶1 000）、Bax 一抗（1∶700）、Bcl-2 一抗（1∶500）、NLRP3一抗（1∶500）、ASC一抗（1∶1 000）、Caspase-1一抗（1∶500）、IL-1β一抗（1∶1 000）、IL-6一抗（1∶1 000）和NF-κB p50一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜。次日將膜與二抗（1∶10 000）在室溫孵育1 h。ECL法曝光，凝膠成像系統成像，使用Image J軟件進行分析，以GAPDH或β-tubulin為內參，計算目的蛋白相對灰度值。

2.7 免疫組化染色

石蠟切片加熱煮沸3 min熱修復抗原，置于60 ℃烤片2 h，脫蠟后，二甲苯和乙醇水合，PBS和雙蒸餾水沖洗，滴加Bax 一抗（1∶60）和Bcl-2 一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜，加二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，中性樹膠封片，鏡下觀察并拍照。每張切片隨機取3個視野，采用Image J軟件分析陽性染色面積，計算陽性面積比。

3 統計學方法

采用GraphPad Prism 8.0統計軟件進行分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 健脾益心方對模型大鼠心臟結構和功能的影響

與假手術組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS、LVAWd、 LVAWs 顯 著 減 少（P＜0.01）， LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV 顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，健脾益心方組大鼠LVEF、LVFS、LVAWd、LVAWs 顯著增加，LVIDs、LVESV 顯著減少（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠心臟結構和功能指標比較（±s）

表1 各組大鼠心臟結構和功能指標比較（±s）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

LVESV/μL 41.4± 23.8 266.2±115.1**107.9± 70.8##組別假手術組模型組健脾益心方組只數9 9 9 LVEF/%75.8±12.0 29.3± 5.6**61.1±15.5##LVFS/%46.7±11.8 14.4± 2.9**35.0±12.5##LVAWd/mm 2.3±1.1 1.2±0.3**2.2±0.4##LVAWs/mm 3.4±0.5 1.2±0.3**2.9±0.7##LVIDd/mm 5.8±0.6 8.1±1.6**6.9±1.1 LVIDs/mm 3.1±0.8 7.0±1.5**4.6±1.4##LVEDV/μL 170.5± 38.8 371.7±143.0**256.1± 97.0

4.2 健脾益心方對模型大鼠心臟肥大的影響

與假手術組比較，模型組心臟外觀及心臟質量比均表明心臟肥大（P＜0.01）；與模型組比較，健脾益心方組大鼠心臟肥大明顯減輕（P＜0.05）。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠心臟形態

表2 各組大鼠心臟質量比比較（±s，mg/g）

表2 各組大鼠心臟質量比比較（±s，mg/g）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

心臟質量比3.58±0.14 4.36±0.55**3.85±0.44#組別假手術組模型組健脾益心方組只數9 9 9

4.3 健脾益心方對模型大鼠心肌組織病理形態的影響

假手術組大鼠心肌細胞形態正常，心肌纖維排列整齊、結構完整；與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織梗死邊緣區細胞排列不規則甚至壞死，有明顯炎性細胞浸潤，心肌纖維化面積顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，健脾益心方組大鼠心肌組織病理損傷明顯減輕，心肌纖維化面積顯著減少（P＜0.05）。見圖2、表3。

圖2 各組大鼠心肌組織形態（×200）

表3 各組大鼠心肌組織纖維化面積比比較（±s，%）

表3 各組大鼠心肌組織纖維化面積比比較（±s，%）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

纖維化面積比0.83±0.20 8.65±1.16**6.03±1.09#組別假手術組模型組健脾益心方組只數3 3 3

4.4 健脾益心方對模型大鼠心肌細胞凋亡的影響

TUNEL染色藍色為細胞核，綠色為凋亡細胞。與假手術組比較，模型組大鼠心肌細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，健脾益心方組大鼠心肌細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。見圖3、表4。

圖3 各組大鼠心肌細胞凋亡陽性表達（TUNEL染色，×200）

表4 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較（±s，%）

表4 各組大鼠心肌細胞凋亡率比較（±s，%）

注：與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

凋亡率11.01± 8.63 54.61±22.61**22.45± 7.97##組別假手術組模型組健脾益心方組只數3 3 3

4.5 健脾益心方對模型大鼠心肌組織凋亡相關蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織Bax、Cytc、Cleaved Caspase-3蛋白表達顯著升高，Bcl-2 蛋白表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，健脾益心方組大鼠心肌組織Bax、Cytc、Cleaved Caspase-3 蛋白顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。見圖4、表5。

圖4 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Cytc、Cleaved Caspase-3蛋白免疫印跡

表5 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Cytc、Cleaved Caspase-3蛋白表達比較（±s，相對灰度值）

表5 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Cytc、Cleaved Caspase-3蛋白表達比較（±s，相對灰度值）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別假手術組模型組健脾益心方組Cleaved Caspase-3 0.29±0.04 0.76±0.04**0.28±0.05##只數5 5 5 Bax 1.92±0.29 2.78±0.38**1.85±0.25##Bcl-2 0.14±0.02 0.08±0.02*0.19±0.04##Cytc 0.02±0.01 0.04±0.01*0.02±0.01#

免疫組化結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織Bax 表達顯著升高，Bcl-2 表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，健脾益心方組大鼠心肌組織Bax 表達顯著降低，Bcl-2 表達顯著升高（P＜0.05）。見圖5、表6。

圖5 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2陽性表達（免疫組化染色，×200）

表6 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2表達比較（±s，%）

表6 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2表達比較（±s，%）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05

Bcl-2 1.03±0.18 0.67±0.07*1.03±0.12#組別假手術組模型組健脾益心方組只數3 3 3 Bax 0.94±0.23 3.95±0.39**2.54±0.64#

4.6 健脾益心方對模型大鼠心肌組織炎癥相關蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB p50 蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，健脾益心方組大鼠上述蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。見圖6、表7。

圖6 各組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB p50蛋白免疫印跡

表7 各組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB p50蛋白表達比較（±s，相對灰度值）

表7 各組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB p50蛋白表達比較（±s，相對灰度值）

注：與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

NF-κB p50 0.42±0.06 1.15±0.20**0.65±0.21#組別假手術組模型組健脾益心方組只數4 4 4 NLRP3 0.06±0.02 0.34±0.09**0.11±0.03##Caspase-1 0.07±0.01 0.11±0.02*0.05±0.01##ASC 0.28±0.10 0.70±0.17**0.23±0.06##IL-1β 0.03±0.02 0.13±0.03**0.04±0.02##IL-6 0.15±0.03 0.25±0.04*0.08±0.03##

5 討論

根據臨床癥狀，MI可歸屬中醫學“胸痹”“真心痛”等范疇，為本虛標實之證，心之氣血陰陽虧虛，致血瘀、氣滯、寒凝、痰濁等痹阻心脈，其中氣虛痰瘀為主要病機?！靶钠⑾嚓P”理論為從脾治療心系疾病奠定理論基礎[14-16]，脾胃調節免疫炎癥的功能被越來越多學者接受?！八募酒⑼皇苄啊薄捌橹l”強調脾氣可抵抗外邪入侵[17]。因此，脾可能通過調節炎癥反應實現對MI后心室重塑的保護作用。健脾益心方中黃芪、人參、麩炒白術、茯苓益氣健脾，白術、茯苓兼以運化水濕，丹參、當歸活血通脈，桂枝溫心陽、扶脾陽以助運化，澤瀉、大腹皮、葶藶子祛濕利水。諸藥合用，調理中焦以助上焦，使脾氣得運，痰飲得化，心脈氣血調和。

MI后出現心臟結構異常，心功能下降，在超聲心動圖上主要表現為心臟舒縮功能（LVEF、LVFS）和心室壁厚度（LVAWd、LVAWs）下降，以及心室內徑（LVIDd、LVIDs）和容積（LVEDV、LVESV）增加。本實驗通過超聲心動圖評價大鼠心臟功能及形態變化，結果顯示，與假手術組比較，模型組大鼠LVEF、LVFS、 LVAWd、 LVAWs 均 顯 著 減 少， LVIDd、LVIDs、LVEDV、LVESV顯著增加，提示冠狀動脈結扎導致左心室收縮及舒張功能障礙，左室壁變薄，左心室擴張；與模型組比較，健脾益心方組大鼠LVEF、LVFS、LVAWd、LVAWs 明顯增加，LVIDs、LVESV明顯減少，提示健脾益心方能有效改善大鼠心臟結構及功能障礙。

課題組前期采用液相色譜-質譜法鑒定出健脾益心方中7個化合物，包括2-異丙基-8-甲基菲-3,4-二酮、丹參新醌d、富馬堿、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、丹參酮ⅡA。研究表明，山柰酚通過抑制STING/NF-κB通路[18]、調節miR-15b/Bcl-2/TLR4[19]等介導炎癥，對心臟/心肌細胞損傷發揮保護作用。木犀草素是一種黃酮類化合物，可通過減少心肌缺血面積、抑制心肌細胞凋亡和減輕炎癥改善心肌缺血[20]，還可減輕阿霉素誘導的心臟毒性[21]。β-谷甾醇可能通過抑制炎癥反應和氧化應激減輕心臟壞死和細胞凋亡[22]。

細胞凋亡是一種基因調控的細胞死亡形式，參與心肌損傷病理演變過程，導致梗死灶擴張[23]、心室重塑[24]、心功能障礙，甚至心力衰竭[25-26]。抑制心肌細胞凋亡可緩解缺血缺氧引起的心肌損傷[27]。Bcl-2、Bax、Cytc及Cleaved Caspase-3在細胞凋亡中發揮重要作用：線粒體外膜破裂導致Cytc從膜間隙釋放到細胞質[28]，與凋亡蛋白酶激活因子和Caspase-9形成凋亡小體，觸發Caspase-3 激活，最終導致細胞凋亡[29-30]。Bcl-2可阻斷Cytc和凋亡誘導因子釋放[31]。Bax能增加線粒體外膜通透性，促進凋亡因子釋放[32]。本研究TUNEL染色與蛋白檢測結果顯示，模型大鼠心肌組織損傷明顯，心肌細胞凋亡率顯著升高，健脾益心方可抑制心肌細胞凋亡，調控凋亡相關蛋白表達至接近正常水平。NLRP3炎癥小體由ASC、NLRP3和Caspase-1蛋白組成，在應激狀態下可被激活[27，33]。NLRP3炎癥小體通過調節IL-1β、IL-6、IL-18等促炎因子釋放發揮炎癥作用，不僅促進細胞凋亡的發生，而且加重心肌細胞功能障礙，引發心室重塑和心力衰竭[34-35]。NF-κB是炎癥因子表達的主要轉錄因子，在充血性心力衰竭和心肌肥厚等多種心臟疾病中被激活[36]。NF-κB p50為NF-κB成員之一，具有DNA結合、二聚化及核轉位等功能，生理條件下，NF-κB多以p50-p65異源二聚體形式與其抑制因子IκB結合并保持靜息狀態[37]。研究表明，NF-κB通路在NLRP3炎癥小體的調控中發揮重要作用[38-39]。IL-1β 作為關鍵的促炎因子，主要由Caspase-1 激活，活化后的IL-1β 可啟動NF-κB 通路，進而促進IL-6、腫瘤壞死因子-α等炎癥因子表達[40]。腫瘤壞死因子-α表達增加不僅促進IL-1β分泌，而且可激活細胞內Caspase信號通路，參與不可逆的凋亡途徑[40]。本研究中模型組大鼠心肌組織NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB p50蛋白表達顯著升高，經健脾益心方干預后，心肌組織NLRP3、Caspase-1、ASC、IL-1β、IL-6、NF-κB p50蛋白表達顯著降低，表明其可通過抑制炎癥相關蛋白表達，改善模型大鼠心肌組織炎癥反應，進而改善心肌結構。

綜上，健脾益心方可減輕MI大鼠心肌損傷，改善心臟結構與功能，抑制心室重塑。其心肌保護作用可能是通過下調炎癥反應，從而抑制心肌細胞凋亡實現。本研究僅對炎癥反應及細胞凋亡的部分機制進行探索，今后將進一步優化實驗條件，對多種炎癥因子在心肌損傷中的協同、拮抗或其他作用機制及健脾益心方的干預靶點進行深入研究。