anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子的構建及其治療哮喘小鼠的應用

汪蓉蓉， 張天寶， 曹旭妮

（華東理工大學生物工程學院, 生物反應器工程國家重點實驗室, 上海 200237）

支氣管哮喘是一種呼吸系統疾病，主要表現為呼吸困難、胸悶和咳嗽[1]。該疾病的主要特征有氣道高反應性(AHR)、氣道炎癥和氣道重塑[1-2]。氣道重塑是指由于炎癥引起的氣道內壁結構的改變，包括上皮纖維化，黏液腺肥大，以及肌成纖維細胞和平滑肌增生[3-6]。目前已有研究表明表皮生長因子受體（EGFR）信號通路異常能引起氣道過度增殖、黏液過度分泌以及肺纖維化[7-9]。此外，在過敏性哮喘中，白介素-4 受體（IL-4R）信號通路激活后，能夠引起慢性炎癥和組織重塑[10]。因此，同時靶向EGFR和IL-4R 的雙靶向生物化合物可能為哮喘患者提供一種有效的治療方式。

蛋白納米粒子與合成聚合物相比，具有生物相容性、生物降解性和低毒性等優點[11-12]。鐵蛋白重鏈亞基（FTH1）廣泛存在于生物體內，是由24 個亞基組成的直徑為12 nm 的中空納米粒子，并且有3 個不同的界面：內部、外部和亞基間相互作用的表面。目前有不少文獻報道可以將功能活性肽修飾到FTH1 的這些界面處，使其實現蛋白的功能化，從而實現腫瘤的靶向成像和治療[13-17]，但鮮有關于以鐵蛋白為基礎的雙靶向納米粒子構建和其在哮喘及其他臨床疾病治療方面的報道。

本實驗早期研究表明將抗EGFR 的單鏈抗體（anti-EGFR scFv）修飾到FTH1 的N 端構建的納米粒子對于哮喘小鼠具有一定的治療效果[18-19]。在此基礎上，本文進一步通過基因工程的方法，分別將anti-EGFR scFv 和AP1（能與IL-4R特異性結合的多肽[10]）修飾到不同的FTH1 的N 端，以構建anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 雙靶向納米粒子。通過對構建的納米粒子進行一系列表征，說明這種體外混合復性技術能有效實現鐵蛋白納米粒子的雙功能化。同時，通過評價該納米粒子用于雞卵白蛋白（OVA）激發的哮喘模型小鼠的治療效果，進一步為雙靶點治療哮喘提供一種蛋白類納米粒子的構建思路。這些研究工作有助于解決以鐵蛋白為基礎的雙靶向納米粒子的構建問題，也為今后應用于哮喘的治療提供了一定的實驗基礎。

1 實驗部分

1.1 原料和試劑

1.1.1 菌株與質粒 大腸桿菌 （Escherichia coli,E.coli） DH5α、E.coli.BL21(DE3)均購自天根生化科技（北京）有限公司。anti-EGFR scFv-FTH1/pET-28a(+)等質粒均為實驗室保存。

1.1.2 試劑 胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast extract）均購自英國OXOID 公司；硫酸卡那霉素（KANA），考馬斯亮藍（R-250），三羥甲基氨基甲烷（Tris），甘氨酸（Gly），丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，異丙基硫代半乳糖（IPTG），二硫蘇糖醇（DTT），四甲基乙二胺（EDTA），聚乙二醇（PEG），十二烷基磺酸鈉（SDS），過硫胺酸銨，曲拉通（TritonX-100），瓊脂糖均購自上海捷瑞生物工程有限公司；氯化鈉，甘油，尿素，氫氧化鈉均購自上海凌峰化學試劑有限公司；T4 連接酶（T4 Ligase）購自寶日生物技術（Takara 北京）有限公司；KOD-Plus 突變試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技有限公司；PAGE 膠原蛋白微量回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；OVA購自Sigma-Aldrich 公司；乙酰甲膽堿（Methacholine）購自國藥集團化學試劑有限公司；蘇木精伊紅染料（HE），糖原染色液（PAS）均購自上海碧云天生物技術有限公司；其余試劑均購自上海泰坦科技股份有限公司。以上試劑皆為分析純。

1.1.3 儀器 分析天平（德國Mettler Toledo EL104 型）；電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設備有限公司DK-8D 型）；純水儀（德國Millipore Academic 型）；恒溫振蕩器（太倉市科教器材廠HZ-9210K 型）；電泳儀（北京市六一儀器廠DYY-6C 型電泳儀）；凝膠成像儀（上海復日科技有限公司FR-980 生物電泳圖像分析系統）；PCR 擴增儀（美國Bio-rad MJ MiniTM梯度PCR 儀）；離心機（德國Sigma 3K15 型）；超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司JY92-IIN 型）；隔水式恒溫培養箱（上海精宏實驗設備有限公司GNP-9050 型）；多功能酶標儀（美國伯騰Biotek Synergy H1 型）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司SW-CJ-1FD 型）；壓縮式霧化器（歐姆龍(大連)有限公司NE-C28 型）；小動物肺功能-氣道阻力和肺順應性系統（美國Buxco RC system 型）；石蠟切片機及石蠟展片機（德國Leica RM2235 型）；透射電子顯微鏡（TEM，日本電子JEM-1400 型）。

1.1.4 實驗動物 SPF 級BALB/c 雌性小鼠（4～6 周齡），購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。動物實驗均嚴格按照規定開展（《上海市實驗動物護理與使用委員會指南》，許可證號SCXK-2017-0005 和SYXK-2017-0008)，并確保動物得到合乎倫理和人道的對待。

1.2 anti-EGFR scFv-FTH1 融合蛋白的表達與純化

實驗室已保存有pET-anti-EGFR scFv-FTH1 轉化的E.coli.BL21（DE3）細胞接種于LB 培養基中（含KANA 50 ng/μL）。過夜活化后，用IPTG 誘導目標蛋白的表達；對收集的沉淀部分進行反復洗滌，再進行變性可獲得純度較高的anti-EGFR scFv-FTH1蛋白變性溶液。具體實驗步驟見文獻[18]。

1.3 AP1-FTH1 融合基因的構建

通過查閱文獻[10]得到AP1 多肽的序列為NRKRLDRNGGPE-C。為將AP1 連接到FTH1 的N 端，根據FTH1 質粒序列設計了一對反向引物，直接將AP1 的基因序列連到FTH1 上，所用引物有AP1-FTH1(primer 1)：5’-ACCATTACGATCCAGACGTTTACGG CCCATGGTATATCTCCTTCT-3’和AP1-FTH1(primer 2)：5’-GGTCCGGAAGGTGGTGGTAGCGGTGAATTC ATGACGACCGCGTC-3’。

經反向PCR、DpnI 對模板質粒 DNA 進行消化及T4 DNA Ligase 連接酶連接目的基因和載體后，將自身環化產物轉化于E.coil.DH5α 感受態細胞。隨后，以PCR 引物5’-GACCACCATTACGATCCAGAC GT-3’和5’-ATGTAATTCAGCTCCGCCATCGC-3’進行菌落 PCR，篩選目標質粒。測序正確后保存目標質粒。

1.4 AP1-FTH1 融合蛋白的表達與純化

pET-AP1-FTH1 轉化E.coli.BL21（DE3）感受態細胞過夜培養后，無菌條件下用槍頭挑取平板上的單菌落，加入到含有50 μg/mL 硫酸卡那霉素的無菌LB液體培養基中，并于200 r/min、37 ℃恒溫搖床中過夜培養。經過夜培養后，次日對該菌進行擴培，于200 r/min、37 ℃恒溫搖床進行擴大培養，一段時間后測定菌液的OD 值，當菌液的OD 值達到0.4～0.6 時，向培養瓶中加入IPTG（終濃度為10 mmol/L），將培養瓶置于200 r/min、37 ℃恒溫搖床中，誘導表達3 h。隨后以8 000 r/min、20 min 的條件進行離心，收集沉淀，加入緩沖液 A（50 mmol/L Tris-OH，50 mmol/L NaCl，pH 7.9，0.22 μm 濾膜過濾），使菌液重懸。超聲波破碎儀破碎細胞（工作條件：功率300 W，工作1 s，間歇1 s，重復66 次），以8 000 r/min、15 min 的條件進行離心，分別收集上清和沉淀，得到的沉淀即AP1-FTH1 包涵體。將破碎后的AP1-FTH1 包涵體收集，向管中每次加入1 mL 緩沖液 B（50 mmol/L Tris-OH，50 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA，1% TritonX-100，pH 7.9，0.22 μm 濾膜過濾），并用1 mL 槍頭蘸取緩沖液 B 對少量包涵體進行研磨洗滌，直至所有的包涵體全部重懸于溶液中，振蕩洗滌后將該溶液以8 000 r/min 的轉速離心15 min，將收集得到的包涵體重復以上洗滌過程，最終使用SDS-PAGE 檢驗得到的包涵體的純度。

1.5 anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子的制備

分別向純度較高的anti-EGFR scFv-FTH1 和AP1-FTH1 包涵體中加入變性液緩沖液 C（8 mmol/L Urea， 50 mmol/L Tris-OH，10 mmol/L DTT，1 mmol/L EDTA，pH 7.9，0.22 μm 濾膜過濾），使包涵體變性，并分別將裝有變性蛋白的離心管置于28 ℃恒溫搖床中過夜，次日取出后，利用0.22 μm 過濾器對離心管中的溶液進行過濾，除去其中的雜質，最后過濾后的溶液即為變性蛋白。隨后將AP1-FTH1 和anti-EGFR scFv-FTH1 這兩種變性蛋白以6∶4 的物質的量之比進行混合，得到蛋白總質量為5 mg，用緩沖液 C 將混合后的蛋白稀釋至體積為50 mL，并裝入透析袋中；置于1 L 的復性緩沖液中進行透析，透析液始終處于4 ℃條件下，每12 h 更換一次下一濃度的復性緩沖液，每次更換的復性緩沖液配方及步驟如下：

步驟1：50 mmol/L Tris-OH 溶液, 50 mmol/L NaCl, 0.5 mmol/L EDTA, 0.1%（質量分數，下同）PEG,10%（質量分數，下同）甘油, 6 mol/L 尿素, 0.5 mmol/L CuSO4, pH 7.9；步驟2：50 mmol/L Tris-OH, 50 mmol/L NaCl, 0.5 mmol/L EDTA, 0.1%PEG, 10% 甘油, 4 mol/L尿素, 0.5 mmol/L CuSO4, pH 7.9；步驟3：50 mmol/L Tris-OH, 50 mmol/L NaCl, 0.5 mmol/L EDTA,0.1%PEG, 10% 甘油, 3 mol/L Urea, 0.5 mmol/L CuSO4,pH 7.9；步驟4：50 mmol/L Tris-OH, 50 mmol/L NaCl,0.5 mmol/L EDTA, 0.1%PEG, 10% 甘油, 2 mol/L 尿素,0.5 mmol/L CuSO4, pH 7.9；步驟5：50 mmol/L Tris-OH, 50 mmol/L NaCl, 0.5 mmol/L EDTA, 0.1%PEG,10% 甘油, 1 mol/L 尿素, 0.5 mmol/L CuSO4, pH 7.9；步驟 6：50 mmol/L Tris-OH, 50 mmol/L NaCl, 0.5 mmol/L EDTA, 0.1%PEG, 10% 甘油, pH 7.9；步驟7：50 mmol/L Tris-OH, 50 mmol/L NaCl, 10% 甘油, pH 7.9；步驟8：10 mmol/L PBS, 10% 甘油, pH 7.2。

以上復性結束后，吸出透析袋中的蛋白溶液，用0.22 μm 過濾器將蛋白過濾至干凈的離心管中以除去團聚蛋白，過濾得到的蛋白溶液即為目標蛋白納米粒子。并用截流分子量為50 kDa 的超濾管對復性后的蛋白溶液于2 500g的離心條件進行超濾濃縮，最后用考馬斯亮藍測定復性蛋白濃度，計算復性得率，并利用凝膠電泳分析復性蛋白的蛋白純度及折疊情況。

1.6 anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子的表征

1.6.1 納米粒子的折疊組裝及組分分析 采用Native-PAGE 對非變性生物大分子進行電泳分離純化，Native-PAGE 電泳結束后，用手術刀將目標蛋白條帶切割下來，將含目標蛋白的凝膠放入EP 管中，反復研磨成細小的凝膠碎片后，采用PAGE 膠蛋白微量回收試劑盒回收凝膠中目的蛋白，并對目的蛋白進行SDS-PAGE 電泳，進一步考察目的蛋白納米粒子的亞基組成情況。

1.6.2 TEM 檢測 取0.5 mg/mL 的蛋白樣品與1 g/L 磷鉬酸以體積比1∶1 進行混合，滴于銅網上，將樣品吸附于銅片20 min 后用TEM 觀察蛋白納米粒子復性折疊后是否具有中空籠狀的結構，并使用軟件Image J 2.1 對納米粒子的粒徑進行分析計算。

1.7 哮喘小鼠模型的建立及治療效果分析

1.7.1 OVA 哮喘小鼠模型的建立 致敏階段選用OVA 初始質量濃度為20 μg/mL，溶劑為1×PBS 的溶液，與等體積的免疫鋁劑Al(OH)3混合后溶液最終質量濃度為10 μg/mL，分別在第0，7，14 d 對每只小鼠進行腹腔注射給藥，每組小鼠有6 只，每只給藥劑量為2 μg。致敏階段結束后，自第21 d 開始至第27 d，連續7 d，每天將小鼠置于霧化箱內進行30 min 的霧化激發，霧化使用的OVA 質量濃度為10 mg/mL，霧化激發期間分別于第22，24，26 d 對小鼠進行給藥治療，并于霧化前1 h 對小鼠進行腹腔給藥，給藥的納米粒子為anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 （0.75 nmol），對照組注射anti-EGFR scFv-FTH1/FTH1 蛋白納米粒子（0.75 nmol）和地塞米松（DXM，2.55 × 10-6mol/kg），陰性對照組小鼠注射等劑量的PBS。

1.7.2 小鼠組織石蠟包埋及切片 第28 d 解剖小鼠取出兩片肺葉，并立即用φ=75%酒精清洗肺葉表面，然后將肺葉浸泡于40 g/L 多聚甲醛（PFA）溶液里，固定肺組織24 h后進行石蠟包埋及組織切片，具體過程為：PFA 固定結束后，通過逐步提高酒精濃度進行脫水，組織在每個梯度酒精（φ分別為70%，85%，95%，100%）中脫水1 h 后，置于無水酒精與二甲苯的混合溶液（體積比1∶1）中浸泡1 h，然后轉移至二甲苯中浸泡1 h；將預先在65 ℃的恒溫箱內融化好的石蠟與二甲苯配制成體積比為1∶1 的混合溶液，然后將經二甲苯浸泡后的組織置于其中。浸蠟2 h 后，再將組織放入65 ℃的恒溫箱內的蠟液中浸蠟3 h，此步驟重復2 次。浸蠟結束后，用鑷子將組織材料塊夾入裝有蠟液的包埋盒中，并置于4 ℃冰箱中，冷卻后切片。

1.7.3 HE（小鼠肺組織蘇木素伊紅染料）染色 將制備好的切片在60 ℃烘2 h 后，對其進行切片脫蠟與水化。步驟如下：二甲苯5 min 2 次，100%乙醇5 min 2 次，95%乙醇3 min 2 次，85%乙醇3 min 1 次，80%乙醇3 min 1 次，75%乙醇3 min 1 次，放入蒸餾水中3 min。切片脫蠟后水平放置于桌面，在切片上面的肺組織附近滴加幾滴蘇木素染色液，至完全覆蓋肺組織，染色5 min 后快速棄去染液，使用酸性乙醇分化幾秒鐘，再用水沖刷，之后再滴加幾滴伊紅染液，染色1 min 后快速棄去，再用水清洗。切片隨后再依次浸入80%乙醇5 min 1 次、85%乙醇5 min 1 次，95%乙醇10 min 1 次，100%乙醇10 min 2 次，二甲苯10 min 2 次進行脫水、透明。最后，倒去載玻片上透明劑，并用濾紙吸干，立即蓋上蓋玻片進行封片備用。HE 染色情況可通過顯微鏡進行觀察和拍照，并對肺組織的炎細胞浸潤情況按照0～3 進行打分，打分標準參考文獻[20]。

1.7.4 PAS（小鼠肺組織糖原染料）染色 將脫蠟、水化的切片水平放置于桌面，在切片上面的肺組織附近滴加幾滴過碘酸反應液，反應6 min 后快速棄去反應液，水洗后用濾紙除去水分，在切片上面的肺組織附近滴加幾滴雪芙反應液，至完全覆蓋肺組織，在暗處反應15 min 后馬上用自來水清洗15 min，吸干水分，滴加幾滴蘇木素染核1.5 min，棄去染液后使用酸性乙醇分化幾秒，再用水沖洗至能觀察到組織顯藍色為止。之后進行切片脫水、透明、封片，實驗操作同1.7.3 節。最后在顯微鏡下對著色情況拍照分析，并使用軟件Image J 對組織中黏液所占的面積比例進行計算[21]。

1.7.5 小鼠肺部呼吸道阻抗情況檢測 小鼠末次給藥后24 h，依次根據小鼠體重計算出每只小鼠所需給的麻醉藥劑量（戊巴比妥鈉：90 mg/kg），待小鼠完全昏迷后，將小鼠四肢及牙齒固定于桌面，解剖小鼠頸部，暴露出氣管，鈍性分離氣管周圍肌肉組織后，手術線從氣管底部穿過，用剪刀將其氣管從一側剪一個小口，進行氣管插管并固定，再將小鼠放入密閉的體描箱中；打開肺功能儀器的呼吸機，頻率為每分鐘120 次，使小鼠正常呼吸；記錄呼吸道壓力、流速和潮氣量等數值，等各項數值穩定后，使用激發劑乙酰甲膽堿激發氣道高反應性，此時收集3 min 的數據，記錄呼吸道壓力變動，測定肺阻力(RL)等肺功能參數。激發劑質量濃度按0、6.25、12.5、25、50 mg/mL順序依次呈梯度上升。

2 結果與討論

2.1 anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子的制備與表征

anti-EGFR scFv-FTH1/pET-28a(+)質粒為實驗室已保存質粒，主要以包涵體的形式進行表達[18]。AP1-FTH1/pET-28a(+)重組質粒圖譜如圖1（a）所示，它是采用點突變技術將AP1 短肽基因插入FTH1基因的5’端。圖1（b）是采用反向PCR 獲得的AP1-FTH1 基因的電泳圖。該產物進行純化、環化后轉化到E.coli.DH5α，最后通過測序確認成功構建目標質粒。AP1-FTH1 蛋白亞基的表達則是將AP1-FTH1/pET-28a(+)質粒轉化到E.coli.BL21(DE3)中進行誘導表達。SDS-PAGE 的結果顯示了AP1-FTH1的蛋白表達情況，如圖2 所示。在25.0～35.0 kDa存在一條明顯的主帶，與所預計的AP1-FTH1 大小相符合，說明AP1-FTH1 成功誘導表達。同時，進一步分析破碎細胞的上清未見該條帶，但是由破碎細胞的沉淀部分可以明顯地觀察到該條帶，說明AP1-FTH1 主要以包涵體的形式進行表達。

圖1 AP1-FTH1/pET-28a(+)的構建及AP1-FTH1 蛋白的表達Fig.1 Construction of AP1-FTH1/pET-28a(+) and the expression of AP1-FTH1

圖2 SDS-PAGE 分析AP1-FTH1 在E.coli. BL21(DE3)中的誘導表達Fig.2 Induced expression of AP1-FTH1 in E.coli. BL21(DE3)using SDS-PAGE analysis

本文再回收的純度較高的anti-EGFR scFv-FTH1 蛋白和AP-FTH1 蛋白，變性后經體外的混合復性制備得到了anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 蛋白納米粒子，圖3（a）示出的泳道2～3 為該納米粒子的Native-PAGE 凝膠電泳圖。由圖3（a）可見與泳道1 的去鐵鐵蛋白（APO，440 kDa）相似，在APO 略高的位置上可見唯一一條明顯的蛋白條帶，說明兩種變性蛋白亞基經復性后正確折疊并組裝成分子量比較大的蛋白納米粒子，它與商品化的APO 相似，都是具有特殊結構的多聚體。實驗中還發現AP1-FTH1 亞基也能在復性過程中折疊組裝成類似的納米粒子（如圖3（b）泳道1），但anti-EGFR scFv-FTH1 亞基不能折疊組裝成納米粒子（如圖3（b）泳道3）[18]。

圖3 電泳分析anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子組裝及組成Fig.3 Electrophoretic analysis of assembly and composition of anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 nanoparticles

為進一步說明anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1蛋白納米粒子是由上述兩種蛋白亞基相互作用形成的穩定納米粒子結構，本文采用SDS-PAGE 進一步分析了割膠純化后的蛋白納米粒子的組成，結果如圖3（c）所示。 將純化后的anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 蛋白納米粒子（泳道3～4）與亞基蛋白（泳道5～6）進行對比，可以觀察到該蛋白納米粒子含有兩條條帶，且位置一致，它們的分子量大小也分別與anti-EGFR scFv-FTH1 蛋白和AP1-FTH1蛋白相一致。這說明經過割膠回收純化后的單條帶anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 蛋白納米粒子是由上述這2 種蛋白亞基組成。同樣地，割膠純化的AP1-FTH1（泳道1～2）在SDS-PAGE 上僅呈現一條蛋白條帶，位置與AP1-FTH1 蛋白（泳道5）一致。這說明所構建的anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 蛋白納米粒子非anti-EGFR scFv-FTH1 蛋白與AP1-FTH1 蛋白的物理混合。

2.2 TEM 檢測

為進一步確認所制備的蛋白納米粒子具有鐵蛋白特征的中空結構，采用磷鎢酸對anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子負染后再進行透射電鏡的拍攝，結果如圖4 所示?？梢奱nti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子具有鐵蛋白結構特征，為內部中空的籠狀結構；隨后進一步統計計算納米粒子的粒徑平均尺寸為（13.2 ± 1.3）nm，分布較為狹窄。

圖4 anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子的TEM結果Fig.4 TEM analysis of anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 nanoparticles

2.3 anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子對哮喘小鼠治療效果的評價

本實驗室早期的研究結果表明以EGFR 為單靶點的鐵蛋白納米粒子對治療哮喘具有較好的效果[18]。本文進一步考察了以EGFR 和IL-4R 為靶點的治療效果，通過建立OVA 誘導的哮喘小鼠模型，并以抑制氣道炎性浸潤、減少氣道黏液的分泌，以及降低氣道高反應的效果評價雙靶向納米粒子的治療效果。

2.3.1 HE 染色評價納米粒子對OVA 哮喘模型小鼠氣道炎性浸潤的調控 氣道炎性浸潤的程度是通過肺組織的HE 染色來實現的。對比圖5（a）和5（b），可明顯地觀察到OVA 誘導的哮喘小鼠模型在氣道的周圍炎性浸潤十分嚴重，說明該動物模型構建成功。進一步對比發現，陽性藥物地塞米松、單靶向anti-EGFR scFv-FTH1/FTH1 納米粒子及雙靶向anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子均對炎性浸潤有非常好的抑制效果（如圖5（c）、5（d）和5（e）所示）。

圖5 HE 染色分析不同納米粒子對OVA 誘導的哮喘小鼠的炎性浸潤的影響（n=6）Fig.5 Effect of different nanoparticles on inflammatory infiltration in OVA-induced asthmatic mice (n=6) using HE staining analysis

圖6 所示為各實驗組HE 染色后的炎性細胞浸潤評分結果。這一結果與之前報道的anti-EGFR scFv-FTH1/FTH1納米粒子對哮喘小鼠的炎性癥狀有明顯的抑制效果相一致[18]。再對比anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子與anti-EGFR scFv-FTH1/FTH1 納米粒子對哮喘小鼠的炎性浸潤的抑制作用，雖然無明顯差異，但均能達到陽性藥物的治療效果，即無明顯的炎性浸潤可被觀察到。

圖6 HE 染色后肺部炎性細胞浸潤評分結果Fig.6 Lung inflammation score of each group after HE staining

2.3.2 PAS 染色評價納米粒子對哮喘OVA 模型氣道黏液分泌的調控 哮喘早期發病中常見氣道上皮細胞黏液化生進而引起呼吸困難。本研究對肺部組織進行PAS 染色觀察氣道杯狀細胞增生和黏液的分泌情況，這種染色技術能有效幫助觀察氣道的上皮細胞組織形態，還可以將分泌的黏液染色呈現紅色以幫助判斷氣道黏液的分泌情況。如圖7 和圖8 所示，對比非造模對照小鼠，OVA 誘導建立的哮喘小鼠，其氣道不僅顯示了高度的炎性浸潤，同時可觀察到氣道內杯狀細胞的增生以及黏液分泌明顯增多的情況（如圖7（b）中的箭頭所示），且其黏液所占比例遠高于非造模對照小鼠（P＜0.001）（如圖8 所示）。之前報道的anti-EGFR scFv-FTH1/FTH1 納米粒子能有效抑制杯狀細胞的增生以及黏液的過度分泌[18]，如圖7（d）所示未見明顯的杯狀細胞的增生以及黏液分泌。同時，通過對比圖7（c）和7（d），可以進一步發現anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子與anti-EGFR scFv-FTH1/FTH1 納米粒子對抑制氣道高黏液分泌具有相當的治療效果；對比陽性藥物地塞米松治療組，anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 蛋白納米粒子對哮喘小鼠的杯狀細胞增生以及黏液的過度分泌也具有非常好的抑制作用，亦未見明顯的杯狀細胞增生以及黏液分泌。這些實驗說明雙靶向的納米粒子能有效緩解小鼠的氣道杯狀細胞增生以及高黏液分泌的哮喘癥狀。

圖7 PAS 染色分析不同納米粒子抑制OVA 誘導哮喘小鼠模型的杯狀細胞增生及氣道黏液分泌的情況 （n=6）Fig.7 Different nanoparticles inhibiting goblet cell hyperplasia and airway mucus secretion in OVA-induced asthma mouse model (n=6) using PAS straining analysis

圖8 PAS 染色后陽性面積率（陽性染色面積與上皮面積之比）顯示氣道黏液分泌情況Fig.8 Positive area rate (Ratio of positively stained area to epithelial area) showed airway mucus secretion after PAS staining

2.3.3 小鼠肺功能實驗評價納米粒子對哮喘小鼠氣道高反應性的抑制 氣道高反應性指氣道對各種刺激因子出現過強或過早的收縮反應。如果這種刺激在正常人呈無反應狀態或反應程度較輕，而對于哮喘患者卻會引起明顯的支氣管狹窄，表現為受外界刺激氣道就會收縮引起咳嗽、喘息、呼吸困難。因此，通常它是哮喘疾病的重要病理指標之一。通過研究我們發現，OVA 誘導的哮喘小鼠動物模型可觀察到這種氣道高反應性。如圖9 所示，哮喘小鼠陽性組（OVA+PBS）在乙酰甲膽堿的刺激下氣道阻力明顯增高。觀察當乙酰甲膽堿刺激藥物的質量濃度達到50 mg/mL 時的治療情況，哮喘小鼠經anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子治療后，氣道阻力明顯降低，與陽性治療組（OVA+DXM）相當（P＞ 0.05），并且anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子治療效果明顯好于anti-EGFR scFv-FTH1/FTH1納米粒子（P＜0.05），說明雙靶向的anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 蛋白納米粒子在緩解哮喘小鼠的氣道高反應方面有明顯治療效果，且優于單靶向納米粒子。

圖9 不同納米粒子對 OVA 誘導哮喘小鼠的氣道高反應性的影響Fig.9 Effects of different nanoparticles on airway hyperresponsiveness in OVA-induced asthmatic mice

3 討 論

如前所述，哮喘是一種由多種細胞，包括多種炎性細胞、上皮細胞、平滑肌細胞等及其細胞組分參與的以慢性炎癥為特征的異質性疾病，這種慢性炎癥與上皮細胞異常增生、氣道黏液高分泌、氣道高反應性等密切相關。隨著病程的發展，還可產生氣道不可逆性縮窄和氣道重塑問題。根據免疫反應引起的氣道炎癥來看，可以分為Th2 型炎癥型哮喘和非Th2 型哮喘。其中，Th2 型炎癥型哮喘的特征是Th2 型細胞因子，如白細胞介素(IL)-4、IL-5 和IL-13 表達上調，導致氣道炎癥。早期的治療以控制炎癥為主，大量的研究表明抑制IL-4 和IL-13 的受體IL-4R 能有效控制哮喘患者的炎癥，目前已有該靶點的單抗藥物進入臨床研究[22]。另一方面，EGFR 也參與哮喘的發生和發展，特別作為促生長因子，該信號通路的異常能引起氣道上皮細胞異常增生、黏液過度分泌、平滑肌細胞的異常增生等，也會導致氣道狹窄、氣道重塑的問題[7-9]。此外，研究表明抑制EGFR 對控制氣道炎癥也有著積極的作用[18]。由此可見，在哮喘疾病的發生和發展過程中，考慮針對不同細胞、不同的作用靶點及機制進行綜合治療，將會獲得更好的治療效果。為此，本研究構建了anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 蛋白納米粒子并分別作用于EGFR 和IL-4R 兩個靶點，結果表明在控制氣道高反應性方面其效果優于單靶向的anti-EGFR scFv-FTH1/FTH1 蛋白納米粒子。今后，我們還將進一步研究雙靶點治療的協同作用效果和機制。

4 結束語

（1）采用“混合復性技術”成功制備了anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 雙靶向納米粒子。割膠回收實驗結果顯示該納米顆粒含有anti-EGFR scFv-FTH1和AP1-FTH1 2 種亞基。TEM 結果表明這些納米粒子具有小尺寸（（13.2 ± 1.3）nm）和窄尺寸分布的中空籠狀結構。

（2）anti-EGFR scFv-FTH1/AP1-FTH1 納米粒子對于治療OVA造模哮喘小鼠有較好的療效。HE 染色結果表明該納米粒子能有效減少支氣管氣道周圍炎性細胞浸潤；糖原PAS 染色結果表明該納米粒子能顯著降低肺組織黏液分泌與杯狀細胞的增生；氣道高反應性結果表明該納米粒子能緩解哮喘小鼠的氣道高反應性且治療效果優于單靶向納米粒子anti-EGFR scFv-FTH1/FTH1。

（3）本文為構建以EGFR和IL-4R 為靶點的雙靶向納米粒子治療哮喘提供了研究基礎，為地塞米松治療失敗的晚期哮喘患者提供新的治療手段。