基于SNP標記的辣木群體遺傳分析

普天磊　韓學琴　羅會英　鄧紅山　鄒枚伶　金杰　夏志強　王文泉

關鍵詞：辣木；SNP；雜合度；群體結構；遺傳多樣性

中圖分類號：S792.99 文獻標識碼：A

辣木（Moringa oleifera Lam.）屬于辣木科辣木屬的多年生落葉喬木，又被稱為鼓槌樹，辣木原產于印度，是埃塞俄比亞、尼日利亞、菲律賓和蘇丹的重要農作物，在非洲、美洲等熱帶亞熱帶地區均有分布，在我國的云南、海南、福建、廣州等地均有種植[1]。辣木有13 個種，其葉片中約含有20%～30%的蛋白質，葉片、花、果實含有豐富的維生素A、維生素B、維生素C 和鈣、鎂等礦物質，種子含高油酸，可用作化妝品、烹飪和機械潤滑油，種子榨油后的剩余物可用于凈化污水、飼喂動物[2-4]。同時辣木含有豐富的皂苷、生物堿、黃酮、酚類等次生代謝產物，具有抗氧化、抗炎、細胞保護、神經保護、抗癌等藥理作用[5-6]。

SNP 標記相比較于RFLP、SSR 等傳統分子標記而言，可檢測單個堿基的插入、缺失、轉換和顛換，具有變異數量多，分布廣，遺傳穩定性高，檢測快、通量高的優點[7]?；赟NP 標記進行的遺傳分析在植物學領域應用較多，例如，高嵩等[8]利用SNP 芯片進行玉米遺傳多樣性、群體遺傳結構和類群間遺傳關系分析，選育并審定了玉米新品種；韓志剛等[9]基于SNP 標記對148 份馬鈴薯種質遺傳多樣性進行分析，認為馬鈴薯絕大部分栽培種遺傳相似性高，遺傳背景不夠豐富。目前，國內并沒有利用SNP 分子標記對辣木種群的遺傳學進行分析的報道。AFSM 技術為簡化基因組測序技術，該法分別利用EcoR I-Msp I 和EcoR I-Hpa II 兩種酶對基因組DNA 進行雙酶切，并在兩端加上區分不同樣本的標簽和接頭，樣品混合后進行雙端測序，測序后獲得的SNP 標記數量多，比傳統分子標記更好地代表全基因組的遺傳信息，具有成本低、準確性和穩定性高、易于操作的優點[10]。

雜合度分析有助于深入了解辣木的遺傳組成情況，確定繁育類型，合理規劃育種，傳統研究繁育類型的方法主要是基于對花器官的形態學分析，傳粉媒介的觀察以及溫室雜交試驗展開，主要通過表型性狀進行評估，易受環境、氣候、栽培措施等因素影響，不能準確地反映植物基因型[11-13]。辣木群體結構的研究對于辣木種質資源的挖掘、利用和保護具有重要的理論和實踐意義，遺傳多樣性及群體分化分析是遺傳學研究的核心內容，親本的遺傳關系很大程度決定子代種子的質量，親本間存在差異的遺傳信息會隨著雜交或自交過程傳遞給子代，使之在單核苷酸水平上呈現出來。目前辣木的繁育類型頗受爭議，還沒有學者基于SNP 對辣木的繁育類型進行研究，國內辣木育種工作進展緩慢，沒有自主產權的辣木品種，存在種子繁殖會發生性狀分離及種子管理不規范等問題，造成辣木優良品種缺乏、品種混亂的現象[14]，辣木親本和子代群體的遺傳分析對于確定辣木繁育類型、分析親緣關系及選育優良品種具有重要的意義。

本研究以96 份辣木為研究材料，結合基因組AFSM 高通量測序技術，與參考基因組進行比對后，進行基因型分析、雜合度分析、群體結構、遺傳多樣性、群體分化及連鎖不平衡分析，以揭示辣木親本與子代間的遺傳關系，為辣木繁育類型和種質親緣關系提供理論指導，以及為發掘控制辣木種質優良性狀的優異等位基因提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

選取來源于同一母本通過自然授粉得到的YMLM002 辣木種子94 粒，該種質是經過連續3a的跟蹤觀測篩選出的果用型優良單株材料，具有產量高、果型好、種子飽滿的特點[15]。辣木種子先用清水浸泡10 h，軟化種子硬殼，再用100 mg/L高錳酸鉀溶液浸泡0.5 h 消毒，清水洗凈后點播于穴盤中（紅土∶蛭石=1∶1），適時補充水分保證濕潤，待苗長至15 cm 左右，收集94 份子代樣品、1 份母株和1 份扦插苗樣品備用。

1.2 方法

1.2.1 辣木基因組DNA 提取及建庫 采用CTAB 法提取辣木樣品DNA，用Nano Drop ND-1000 對DNA 樣品濃度進行檢測，并調節樣品濃度至100 ng/μL，置于–20 ℃保存。采用AFSM 技術進行建庫，利用EcoR I-Msp I 和EcoR I-Hpa II兩種酶對96 份辣木DNA 樣品進行混合雙酶切，再將酶切產物連接加上用于區分不同樣品的接頭標簽，純化后進行PCR 擴增，樣品混合后再用高通量測序平臺Illumina 進行雙端測序，并計算GC含量和Q30 評估測序數據質量。

1.2.2 辣木群體基因型分析 利用Perl 腳本對原始測序數據進行過濾，使用Bowtie 軟件將過濾數據比對到辣木參考基因組ASM980114v1，再使用VCFtools 和BCFtools 軟件檢測并統計SNP 和Indel 位點信息。

1.2.3 辣木基因雜合度分析 使用AWK 語言分析96 份樣品的雜合位點，并計算個體內基因的雜合位點比率即為個體內雜合度；同時通過將子代數據分別與親本進行比對，找出差異位點，統計差異位點概率即為子代與親本比對雜合度，分別生成個體內雜合度及子代與親本比對雜合度統計圖。

1.2.4 群體結構分析、遺傳多樣性及群體分化分析 利用Plink 對變異位點進行過濾，過濾掉最小等位基因頻率低于0.05 及基因型缺失率小于5%的位點，哈迪–溫伯格檢驗顯著性P>0.0001，保留高質量的變異位點，再使用ADMIXTURE 軟件進行群體結構分析，將亞群數K 值范圍設置為1～10，根據得到的交叉驗證錯誤率（cross-validationerror， CV error）值選擇合適的亞群數K 值，以個體占亞群的遺傳成分系數確定個體歸屬的類群，用R 軟件繪制群體遺傳結構矩陣圖。采用GCTA 軟件對過濾得到的高質量文件進行主成分分析，并用R 軟件繪圖；采用VCFtools 軟件計算辣木群體的遺傳多樣性指數（π）及群體分化指數（Fst）。

1.2.5 連鎖不平衡分析 使用LDBlockShow 軟件，計算不同標記距離下的D值，并生成單體型塊圖以展示位點間的連鎖不平衡程度。

2 結果與分析

2.1 辣木群體基因型分析

96 份辣木樣品基因組DNA 經過AFSM技術建庫、測序，將數據過濾并比對至辣木參考基因組ASM980114v1，參考基因組信息來源于NCBI 數據庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/taxonomy/3735/），基因組大小為253.9 Mb，測序得到1.8 G 數據文件，346 615 757 條reads，測序長度為150 bp，平均GC 值為50.53%，平均Q30 為94.49%。采用VCFtools 和BCFtools 軟件處理樣品基因組數據后，得到1 187 831 個SNP 和150 861 個Indel位點，以及11 158 個多等位基因位點，4930 個多等位基因SNP 位點。SNP 同類型堿基之間的突變為轉換，不同類型堿基之間的突變為顛換，SNPs發生轉換概率與顛換概率的比值為2.08，單一序列發生轉換次數為804 031，單一序列發生顛換次數為383 471（圖1）。

SNPs 發生堿基轉換和顛換概率隨著位點的增大呈現先逐漸增加后緩慢降低的趨勢（圖1）。辣木不同類型的突變位點中，堿基轉換的變異數量顯著大于顛換的數量，其中堿基G/A 和C/T 的替換都較高，分別為243 672 和241 616 次；堿基A/G和T/C 的替換次之，分別為161 258 和158 648 次，堿基插入/缺失發生的次數隨著堿基插入/缺失長度的增加而呈現出迅速下降的趨勢。

2.2 辣木自然結實子代基因雜合度分析

采用1 187 831 個SNP 位點和150 861 個Indel位點分析96 份辣木樣品的雜合度（圖2）。辣木同源染色體上的SNP 位點為同一類型堿基，則該SNP 位點稱為純合SNP 位點，若為不同類型堿基，則為SNP 雜合位點。由圖2A 可知，辣木個體內雜合度在10.79%～0.36%之間，個體內平均雜合度為4.89%，其中，母株雜合度為5.65%，扦插苗雜合度為5.34%。由圖2B 可知，子代與親本比對雜合度在21.22%～35.33%之間，子代與親本的比對平均雜合度為24.85%。由此可知，導致辣木子代雜合的基因中，約有4.89%的基因為自身雜合基因，19.96%為外來遺傳物質導致雜合的基因，基本表明辣木通過自花和異花2 種授粉方式繁衍后代。

2.3 辣木群體結構分析

采用Plink 對變異位點進行過濾后，得到141 323 個SNP 位點，再通過軟件利用所有SNP和Indels 分子標記對96 份辣木樣品進行群體遺傳結構分析，由圖3A 可知，當K 值為3 時，隨著K 值的增大，CV error 逐漸增大。由于K 值為2和3 時，CV error 值均較小且較為接近，分別為0.401 和0.404，但當K 值為2，即將96 份樣品分為2 個亞群時，各亞群的個體呈現分布不集中的現象，故將96 份辣木樣品分為3 個亞群（subgroup1-3）。根據個體在3 個亞群的Q 值，將個體歸類到Q 值占比最大的亞群（圖3B），發現3個亞群中分別有47、31、18 份材料，其中母株和扦插苗屬于亞群1，亞群2、亞群3 均為子代樣品。

主成分分析發現（圖3C），亞群1 和亞群2在PC1 軸上有分布差距，而亞群3 與亞群1、2在PC2 軸上有一定的分布差距。大部分亞群可以聚類在一起，表明聚類結果與群體結構的劃分具有一致性。同時，上述結果（辣木親本與子代樣本聚類為3 個亞群）再次論證了雜合度分析結果，即在生殖遺傳的過程中，辣木并非以自花授粉的方式繁衍后代，在一定程度上接受了外來的花粉，導致后代在不包含母株的另外2 個群體中有分布。

由圖4 可知，群體進化樹的聚類結果與群體結構的劃分相一致，各亞群大致能聚在一起，且樣品間有一定的交叉。相比較而言，亞群1 的分枝長度較短，有4 個個體分散在亞群2 中；亞群2 的分布總體集中，有7 個個體與亞群3 有交叉；同時，亞群3 有3 個個體與亞群1 有交叉。

2.4 辣木群體遺傳多樣性及分化分析

3 個亞群的π 值差距較小且均較低，平均π值也較低，為0.0010，表明96 個辣木群體的遺傳多樣性水平低。各亞群的Fst 在0.0049～0.0110 之間，其中亞群1 和亞群2 間的Fst 值最小，亞群2和亞群3 間的Fst 值最大，各亞群間的Fst 值均小于0.05，表明各樣本之間存在較弱的遺傳分化（當Fst 等于0 或1 時，分別表明亞群間沒有分化或完全分化；當Fst 為0～0.05 時，表明亞群間的分化較弱；當Fst 為0.05～0.15 時，表明亞群間為中度分化；當Fst 為0.15～0.25 時，表明亞群間的分化較強[16]），各亞群間的親緣關系相對較近。

2.5 連鎖不平衡分析

結合多態性核心SNP 位點在辣木基因組上對應位置分析，發現共有136 個Scaffold，主要Scaffold 統計情況見表1（SNP 數量前十的Scaffold）。其中，Scaffold 1 的SNP 數目最多，為62 225個，Scaffold 122 的SNP 數目最少，為288 個。通過LDBlockShow 軟件對Scaffold 1 在6.748～6.749 Mb 區域內的變異信息進行連鎖不平衡分析，發現6 748 044～6 748 185 位點之間具有強連鎖不平衡關系，而6 748 040 與6 748 041、6 748 041與6 748 044 等位點間的連鎖關系弱（圖5）。

3 討論

AFSM 技術采用EcoR I-Hpa II 和EcoR I-MspI 兩組雙酶切體系簡化基因組DNA 的復雜度，目前已發展得較為成熟，已用于檢測巴西木薯、澳洲堅果、麻瘋樹等植物的SNP、Indel 及甲基化位點[17-19]，該技術DNA 處理步驟和數據分析步驟相對簡單，效率高，測定的位點穩定，無需進行超聲剪切或熒光標記，試驗成本低，適用于大量非模型物種的基因分型。本研究利用該技術得到1 187 831 個SNP 和150 861 個Indel 位點，可實現辣木親本及子代遺傳分析的目的。

國內外相關學者從不同的角度對辣木的繁育系統進行研究，呂亞等[20]發現狹瓣辣木在開花第一天就有花粉活力和微弱的柱頭可授性，且開花之初柱頭高于雄蕊，之后逐漸低于雄蕊。MULUVI等[21]利用AFLP 分子標記研究肯尼亞種源辣木的繁育系統，表明該種源辣木種子是自交和異交的混合產物。起國海[22]研究辣木對干熱河谷傳粉網絡的影響，并表明辣木單花能提供5～30 μL，含糖量高達60.5%的花蜜報酬物，屬于昆蟲傳粉植物，主要傳粉者為蜂類。本研究中辣木個體內平均雜合度4.89%，子代與親本的比對平均雜合度為24.85%，表明辣木繁殖方式為自交與異交同時存在。因此，在進行辣木雜種優勢利用時，需要關注相關個體間的隨機化分布和最小距離，以最大限度地增加差異品種/系間的雜交受精，并盡量減少品種內部的自交。

植物的繁育系統、選擇、遺傳漂移、突變和遷移是影響植物群體遺傳結構的進化因子[23]，本研究利用ADMIXTURE 軟件對辣木的群體結構進行分析，將96 個辣木群體劃分成3 個亞群，該結果與聚類分析和主成分分析的結果類似，3 種群體結構分析方法相互補充印證，表明辣木群體的遺傳結構劃分可靠。在群體結構劃分中，大部分亞群可以聚類在一起，其中，1 亞群有親本及子代樣品，而2、3 亞群均為子代樣品，該結果表明辣木自然結實子代群體除了攜帶親本的遺傳信息外，還攜帶有外來的遺傳信息，即辣木繁衍后代的方式不僅為自花授粉，而且還存在異花授粉。子代樣品在3 個亞群中均有分布，可能是由于親本植株種植于保存有不同辣木種質的資源圃內，不同來源材料的花粉傳播至親本植株所導致的。

群體的π 值和Fst 值是衡量群體遺傳分化程度的重要參數，RAJALAKSHMI 等[24]使用ISSR、SRAP 標記研究印度種源辣木的遺傳多樣性，表明辣木的平均遺傳分化系數為0.15，總遺傳多樣性指數為0.17。本研究發現辣木群體的π 值為0.0010，Fst 值在0.0049～0.0110 之間，表明本研究所用辣木群體遺傳分化弱，遺傳多樣性較低，該現象應該是由于選取的辣木群體是親本與子代親緣關系較近造成的。同時，也表明引起子代雜合的外來基因與親本的基因型差異不大，這可能是由于本研究文采用的是栽培種辣木資源，經歷了多次的人工選擇育種，資源間豐度低造成的，后續可引進印度、非洲種源的優良辣木種質，以豐富資源圃內的辣木種質[25]。

當2 個距離較近的等位基因在同一單體型上同時出現的頻率高于隨機出現的頻率時，表明它們處于連鎖不平衡狀態。在定位克隆中，通過連鎖可檢測到產生連鎖信號的變異，在關聯分析中，利用鄰近位點形成的強連鎖不平衡，有助于找到與性狀相關的位點[26-27]。本文對辣木的SNP 位點進行了連鎖不平衡分析，并在單體型塊圖上發現了連鎖不平衡關系強的基因區域，可為研究多個處于連鎖不平衡的位點與重要性狀的關聯性提供參考依據。