南天竹和火焰南天竹葉色表型與色素含量變化研究

蔡鴻宇，劉國華，邱國金，郭聰聰，高宇，顧恒，王良桂*

（1.江蘇農林職業技術學院，江蘇 句容 212400；2.南京林業大學 林學院，江蘇 南京 210037；3.國有金湖縣林場，江蘇 淮安 211616）

南天竹（Nandina domesticaThunb.）為小檗科南天竹屬常綠灌木，原產于中國，是一種集觀賞、藥用、生態等多種價值于一身的樹種［1-2］。其根、莖、葉、果均可入藥，具有清熱除濕、通經活絡等功效［3］。南天竹植株優美，果實鮮艷，尤其是其葉片，幼葉及秋冬呈鮮紅色，并且對環境有著很強的適應性。經過多年的栽培馴化，已經形成許多栽培品種，其中最常見的是火焰南天竹?；鹧婺咸熘瘢∟.domestica‘Firepower’）屬于園藝新品種，其葉片橢圓且長［4］。在江蘇地區4月中旬開始萌芽，新葉嫩紅，氣溫30℃以上逐漸轉綠。在12月份溫度下降到5℃以下，并且晝夜溫差在10℃以上，其葉片開始變紅。目前，南天竹和火焰南天竹已廣泛應用于園林綠化中。

近年來，相關學者對南天竹屬的不同品種進行了大量研究，主要集中在播種育苗、扦插繁殖、組培快繁等方面［5］。王生等［6］在南天竹種子催芽方式的研究中發現，經過低溫沙藏處理后的種子，其發芽率最高，可達83%，且種子萌發快而整齊。任雪玲［7］對美國‘白果’南天竹多年生硬枝及當年生嫩枝進行了扦插試驗，結果發現嫩枝扦插生根率高于硬枝扦插，且接穗蘸一定濃度的ABT生根粉生根率更佳。付歡歡等［8］研究了不同培養基和植物激素組合對火焰南天竹再生能力影響，以及不同蔗糖濃度配比和不同生長素濃度對火焰南天竹生根的影響。截至目前，還未見有關于南天竹葉色變化相關的研究。

植物葉色變化是一個十分復雜的過程。對多種彩葉植物進行研究發現，植物葉片顏色的變化是由其體內色素的種類和含量引起的［9］。葉綠素、類胡蘿卜素、花青素這三種色素是導致葉色變化的主要色素［10］。當葉片中三類色素的含量發生顯著變化時，各色素的比例也會隨之改變，進而決定葉片的顏色［11-12］?；谇捌趯δ咸熘窈突鹧婺咸熘裎锖蛴^測的結果，本研究通過對一年內每個月的葉片進行采集進行葉色表型和相關色素（葉綠素、類胡蘿卜素和花青素）含量的測定，分析了葉色變化的原因，為南天竹和火焰南天竹葉色變異機理提供了參考，也為今后南天竹和火焰南天竹葉色的遺傳改良研究提供了方向。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為生長在江蘇農林職業技術學院彩葉苗木良種科研基地內（32°01′N， 119°24′E）的2年生的南天竹和火焰南天竹。2018年5月至2019年4月期間，分別于每月15日上午10點采集生長良好的嫩葉，每次取樣部位一致。用純水將附著在葉片上的灰塵清洗干凈，去掉中脈，裝入無菌無酶的離心管內，立即放入液氮中速凍10 min，隨后轉移到-80℃冰箱內保存。

1.2 相關指標測定

1.2.1 葉色測定

分別對不同時期的葉片使用英國皇家園藝學會比色卡和分光測色儀測定葉色變化［13-14］。使用分光測色儀時，將葉片外部遠離中脈的部分對上通光孔，通過儀器測定數據并記錄。

1.2.2 葉綠素、類胡蘿卜素以及花青素含量的測定

色素含量采用張和陳的方法進行測定［15-16］。用95%的乙醇對研磨好的葉片進行浸泡，浸泡時間為24 h，黑暗中進行，使用分光光度計在470 mm、649 mm和665 nm波長下定量，進行葉綠素和類胡蘿卜素的測定。而花青素采用試劑盒進行測定（植物花青素試劑盒，南京建成生物工程研究所有限公司）。

1.3 數據分析

葉色測定及相關色素含量測定均進行3次生物學重復。使用Microsoft Excel 2010進行實驗數據的統計。使用IBM SPSS Statistics 26進行方差分析。

2 方法結果與分析

2.1 不同時期葉色表型變化

使用比色卡分別測定了南天竹和火焰南天竹的葉色。由表1可知，不同月份的南天竹和火焰南天竹葉片呈現不同的葉色。其中，南天竹在3～9月均呈現綠色，在10月至翌年2月則呈現不同深度的紅色，尤其是11月至翌年1月的顏色最鮮艷。而火焰南天竹1年內幾乎保持在黃綠色，在11月至翌年2月葉色發生變化，葉色變紅且色澤比南天竹更加明麗。

表1 比色卡測定南天竹和火焰南天竹葉色表型變化Tab. 1 The change of leaf color of N.domestica Thunb. and N.domestica ‘Firepower’ was determined by colorimetric card

使用分光測色儀分別測定了南天竹和火焰南天竹的葉色。由表2可知，南天竹和火焰南天竹葉片在不同月份表現出不同的葉色。其中，南天竹在3～9月葉片亮度幾乎保持一致，10月至翌年2月亮度下降，同期葉色變紅。根據比色卡測試的結果（表1）與分光測色儀測定的結果（表2），南天竹與火焰南天竹的葉色變化期基本上保持一致，但南天竹的葉色變化更加豐富，火焰南天竹的葉色變化更鮮艷。

表2 分光測色儀測定南天竹和火焰南天竹葉色表型變化Tab.2 The change of leaf color phenotype of N.domestica Thunb. and N.domestica ‘Firepower’ were determined by spectrophotometer

2.2 不同時期葉片色素含量變化

2.2.1 葉綠素含量變化

由表3和圖1可知，6月份南天竹葉片中葉綠素含量最高，達到5.5229 mg/g，12月份的南天竹葉片中葉綠素含量最低，為2.0849 mg/g。而火焰南天竹葉片中葉綠素含量在3月份最高，為3.4159 mg/g，2月份含量最低，為0.8237 mg/g。同時，南天竹和火焰南天竹在5月至翌年3月葉片中葉綠素的含量變化呈現相同的趨勢。此外，在3～5月期間，南天竹葉片呈現一直上升的趨勢，而火焰南天竹則是先下降再上升。

圖1 南天竹和火焰南天竹葉片葉綠素含量Fig. 1 Content of chlorophyll in leaves of N.domestica Thunb. and N.domestica ‘Firepower’

2.2.2 類胡蘿卜素含量變化

由表4和圖2可知，1月份南天竹葉片中類胡蘿卜素含量最高，達到1.7772 mg/g，5月份的南天竹葉片中類胡蘿卜素含量最低，為0.982 mg/g。而火焰南天竹葉片中類胡蘿卜素含量在3月份最高，為1.4074 mg/g，7月份含量最低，為0.5591 mg/g。同時，南天竹和火焰南天竹葉片在三個時間段內類胡蘿卜素的含量變化呈現相同的變化趨勢，分別為5～11月、1～2月以及3～4月。此外，在另外三個時間段則表現出不同的變化趨勢，2～3月和3～5月，南天竹葉片類胡蘿卜素含量呈向下降的趨勢，而火焰南天竹則呈現上升的趨勢；2～3月則正好相反，南天竹葉片類胡蘿卜素含量呈向上升的趨勢，而火焰南天竹則呈現下降的趨勢。

表4 不同時期南天竹和火焰南天竹葉片類胡蘿卜素含量Tab. 4 Contents of carotenoids in leaves of N.domestica Thunb. and N.domestica ‘Firepower’ at different periods

2.2.3 花青素含量變化

由表5和圖3可知，11月份南天竹葉片中花青素含量最高，達到1.1870 mg/g，5月份的南天竹葉片中花青素含量最低，為0.1570 mg/g。而火焰南天竹葉片中花青素含量在2月份最高，為1.6103 mg/g，4月份含量最低，為0.1100 mg/g。同時，南天竹和火焰南天竹在8月至翌年4月葉片中花青素的含量變化呈現相同的趨勢。此外，在4～8月期間，南天竹葉片呈現先上升后下降的趨勢，而火焰南天竹葉片中花青素含量變化不大且差異不顯著。

圖3 南天竹和火焰南天竹葉片花青素含量Fig. 3 Anthocyanin content in leaves of N.domestica Thunb.and N.domestica ‘Firepower’

表5 不同時期南天竹和火焰南天竹葉片花青素含量Tab. 5 Anthocyanin content in leaves of N.domestica Thunb.and N.domestica ‘Firepower’ in different periods

3 討論與結論

彩葉植物廣泛存在于自然界中，具有獨特的觀賞價值，可以提高城市綠化的觀賞性［17-18］。對于南天竹和火焰南天竹而言，葉片顏色是其最重要的觀賞性狀。根據觀察可知，南天竹葉片在10月-翌年2月表現出不同程度的紅色，其余時間則呈現綠色。而火焰南天竹葉片大部分時間保持在黃綠色，只是在11月-翌年2月葉色發生變化，但其葉色變紅且色澤比南天竹更加明麗。

影響植物葉片顏色變化的色素主要包括葉綠素、類胡蘿卜素和花青素［19-20］。葉綠素產生于植物的葉綠體中，是葉片重要的光合色素［21］。植物葉片呈現綠色，主要是由于葉綠素含量高，與葉綠素的合成和降解有關。本研究中，南天竹和火焰南天竹在5月至翌年3月葉片中葉綠素的含量變化呈現相同的趨勢，且6月南天竹葉片中葉綠素含量最高，火焰南天竹葉片中葉綠素含量在 3月最高，和葉色表型變化的數據相符。徐展宏等［22］對不同葉色的青錢柳［Cyclocarya paliurus（Batal.） Il jinsk.］色素研究中發現，綠葉的葉綠素含量要顯著高于紅葉，我們的結果與之相符。

類胡蘿卜素是一類重要的脂溶性色素，廣泛存在于植物中。作為次生代謝物，類胡蘿卜素賦予了植物花、葉及果實鮮艷的色彩［23］。本研究中，南天竹和火焰南天竹葉片類胡蘿卜素含量在一年中的變化不大。其中1月南天竹葉片中類胡蘿卜素含量最高，5月的南天竹葉片中類胡蘿卜素含量最低。而火焰南天竹葉片中類胡蘿卜素含量在 3月最高，7月含量最低。值得注意的是，在2～4月之間，南天竹葉片中類胡蘿卜素的含量呈現下降趨勢，而火焰南天竹則是先上升后下降，而且3～4月急劇下降，可能的原因是類胡蘿卜素含量的下降，對火焰南天竹維持葉綠體功能以及葉綠素水平發揮了反向調控作用，間接促使葉片變綠，這與紫葉茶（Camellia sinensisL.）中的研究結果相似［24］。

花青素是植物中常見的一種水溶性色素，具有廣泛的功能。由于存在于植物的葉、花及果實中，使得植物呈現出紅色、紫色和藍色等多種多樣的顏色［25-27］。葉片顏色不同，其花青素含量有所差異，而紅葉和紫葉植物中花青素是主要的呈色物質［28］。本研究發現，11月南天竹葉片中花青素含量最高，而火焰南天竹葉片中花青素含量在2月最高，可能是由于葉片的光合器官尚未發育完全，不能充分利用光能而導致自身產生較多的超氧化物，從而把營養物質轉化成一些具有抗氧化能力的化合物，從而使葉片變紅［29-30］。

近年來，諸多學者對一些植物葉色變化的分子機制進行了報道。如在菊花（Chrysanthemum morifoliumcultivars ‘Chunxiao’ 和 ‘Green anna’）葉片中短暫過表達的研究中發現，CmNAC73是葉綠素生物合成的正調控因子，它直接與葉綠素合成相關基因HEMA1和CRD1的啟動子結合，調控菊花葉色的改變［31］。在對銀杏（Ginkgo bilobaL.）突變體的轉錄組測序中發現，GbZDS和GbLCYE基因的上調促進了葉片中類胡蘿卜素的積累［32］。另外一項關于梨（Pyrus bretschneideriRehder）的研究報道稱PbWRKY75可通過激活DFR、UFGT或MYB的啟動子來調控梨中花青素的積累，使葉色逐漸變深［33］。本研究中2種南天竹葉色變化的過程中可能受到一些關鍵基因的調控，從而使得其在一年中表現出不同的葉色。

溫度是影響植物葉片顏色的外界因素之一。多項研究發現環境溫度發生變化時會影響花青素的積累，導致植物葉色也隨之改變。通過高效液相色譜法分析白花紫露草（Tradescantia reflexaVell.）突變體和野生型葉片中的花青素含量，發現低溫條件下葉片中花青素的含量高［34］。本研究中發現，低溫環境下南天竹和火焰南天竹的葉色更紅，可能的原因是低溫誘導了調控花青素合成途徑上關鍵基因的表達，使葉片中花青素含量上升，從而使葉片變紅，而關于其葉片變化的機制是后續研究的方向。目前南天竹和火焰南天竹不同時期的葉片測序工作正在進行，我們期望從分子層面深入解析2種南天竹葉色變化的分子機制。

綜上所述，南天竹和火焰南天竹生長發育過程中葉色變化的現象涉及多種色素代謝途徑。在南天竹和火焰南天竹葉片發育的初期，由于外界溫度低，誘導葉片大量合成花青素，使其呈現紅色。隨著環境溫度的不斷升高，葉片中葉綠素和類胡蘿卜素的含量慢慢產生并積累到一定程度，從而導致葉片顏色逐漸由紅色慢慢轉變成綠色。本研究為南天竹和火焰南天竹葉色變化的機理提供了新的見解，也為其在園林應用方面提供了一定的指導。