基于蛋白指紋圖譜的陽澄湖大閘蟹真偽鑒別研究

張雅涵， 張有勇， 袁丹， 徐敏， 曹葉中

（1.蘇州市知識產權保護中心，江蘇 蘇州 215100； 2.蘇州市食品檢驗檢測中心，江蘇 蘇州 215100）

陽澄湖大閘蟹蟹鰲的肌肉組織含有豐富的蛋白，具有品種精良、體大膘肥、青殼白肚、金爪黃毛、肉質膏膩等特點。陽澄湖大閘蟹的鮮味來自于蟹身體內豐富的游離氨基酸，蟹肉中含有較多呈甜味的氨基酸，如丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸等，這些散發著鮮味的游離氨基酸在大閘蟹的肌肉、肝胰臟、性腺等可食部位都有廣泛分布，因此大閘蟹吃起來鮮甜美味[1]。陽澄湖屬東亞季風氣候區，分為西湖、中湖和東湖，湖水域具有水淺、土質硬、光照充足、淤泥少等特點，地理位置靠近?？?，是螃蟹徊游繁殖的理想地區。因為陽澄湖養殖水域與其他養殖水域的差異，陽澄湖大閘蟹的氨基酸含量高于其他養殖水域的螃蟹，陽澄湖大閘蟹的蟹膏、蟹黃等可食部位含量也高于非陽澄湖大閘蟹，因此蛋白含量的差異可以作為陽澄湖大閘蟹區別于其他蟹類的指標之一[2-3]。

每到大閘蟹上市前，不法商家常假借“陽澄湖”名義，非法銷售其他品種大閘蟹[1-2]。當前假冒陽澄湖大閘蟹的花樣繁多，除外地養殖后運至陽澄湖泡上1 個月的方式外，更有不法分子為了追求與陽澄湖大閘蟹品相一致，采用工業草酸浸泡等方式對冒牌品種進行“洗白”[4-5]。此類方式不僅對陽澄湖大閘蟹品牌造成損害，也對當地養殖效益產生相當大的不利影響，且經過工業試劑處理后的大閘蟹對消費者健康產生嚴重影響。為此，養殖戶及當地政府采取了一些品種保護措施，如采用防偽戒指等。然而偽造“防偽戒指”的事件時有發生，消費者已很難通過防偽戒指來辨識陽澄湖大閘蟹的真假。對于普通消費者而言，從體貌形態已很難鑒別陽澄湖大閘蟹的真偽，形形色色的防偽戒指也讓陽澄湖大閘蟹的辨識變得更加困難，如何采取更加科學有效的方式來鑒別陽澄湖大閘蟹的真偽，更好地保護當地品牌產業及廣大消費者的切身利益成為業內及當地政府亟待解決的難題。

國內外尚無研究大閘蟹蛋白質組學的報道，也未出臺大閘蟹蛋白質組學標準檢測方法。目前，大閘蟹品種鑒別主要通過感官及經驗判斷，該方法準確度差，影響因素多，且目前許多不法商家采用后期在陽澄湖當地培養一段時間而將其命名為陽澄湖大閘蟹的方法，使質檢人員及消費者難以辨別。用二維凝膠電泳可以對螃蟹肌肉組織蛋白提取液實現蛋白質組學分離分析，但其前期處理復雜，且螃蟹肌肉組織蛋白種類復雜，凝膠電泳的靈敏度及分辨能力較低，因此該方法不足以實現不同品種螃蟹的鑒定?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜( matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDITOF MS) 作為一種高效、精確的分析方法，可以使不易氣化、電離的樣品分子實現離子化，已經越來越多地被科研人員應用于蛋白質組學分析[6-9]。MALDI-TOF 質譜通過反映與組成有關的分子離子峰，提供了蛋白質分子的相對分子質量數據[10-11]。當前基于MALDI-TOF MS 蛋白質指紋圖譜分析的方式已成功應用于臨床微生物的物種鑒定，具有鑒定結果準確度高、操作簡便、效率高等特點。國內也有很多研究將MALDI-TOF MS應用于肉類品種、風味特點、保存效果等[12-14]，如左惠心等[12]將MALDI-TOF MS 應用于牦牛與黃牛肌肉組織差異蛋白的生物信息分析。融智生物科技有限公司基于MALDI-TOF MS開發出豬肉品質鑒定技術，采用蛋白質組分子指紋圖譜并結合深度學習算法實現了對病死豬肉和正常屠宰豬肉的種類鑒定[15-16]。

為了解決大閘蟹品種難以鑒定的問題，通過自主建立的方法提取不同大閘蟹蟹螯肌肉組織蛋白，將純化后的提取液進行MALDI-TOF MS 生物質譜分析以獲得其蛋白指紋圖譜，并基于大數據及神經網絡算法分析指紋圖譜，解決大閘蟹品種品質難以鑒定的問題?？蔀榛贛ALDI-TOF MS的陽澄湖大閘蟹的溯源性分析提供技術依據，對促進蘇州涉水企業品牌健康發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以江蘇省蘇州市人民政府《關于劃定蘇州陽澄湖大閘蟹原產地域范圍的請示》提出的地域范圍為準，本試驗樣本取自江蘇省蘇州市自然形成的陽澄湖水域。陽澄湖大閘蟹還需滿足從苗種放養到成蟹養殖6 個月的養殖期，規格要求：母蟹125 g（2.5 兩）以上，公蟹150 g（3 兩）以上。陽澄湖大閘蟹樣本采集為目錄商家提供的陽澄湖大湖范圍圈養蟹（大閘蟹棲息的水草放置于陽澄湖湖中，投喂飼料以玉米粒、螺螄、小魚等為主）；非陽澄湖大閘蟹為市場購買，連續數月收集非陽澄湖大閘蟹，作為可疑樣本數據比對。將待測樣本標記并凍存于-80 ℃冰箱備用。

首先，父母應重視家庭教育對個體健康人格培養的作用。家庭環境的質量通常被認為是決定青少年行為的重要因素。弗洛伊德特別強調，一個人的性格是由幼年的經驗所決定的，精神分析學派認為家庭教育對人格的影響是潛移默化的，許多學生的問題，主要來自于他所身處的原生家庭，更確切地說，是家庭的問題引發了學生的心理或行為障礙。

2.2.4分類模型建立及驗證 采集2 批樣本進行測試，第1 批次采集樣本數226 只，其中陽澄湖大閘蟹180 只，非陽澄湖大閘蟹46 只；第2 批次采集樣本129只，其中陽澄湖大閘蟹51只，非陽澄湖大閘蟹78 只。將2 個批次355 只樣本中選擇陽澄湖和非陽澄湖大閘蟹各90 只作為測試集，利用支持向量機（SVM）建立鑒別模型并進行非線性預測（圖8），紅色為陽澄湖大閘蟹分布情況，藍色為非陽澄湖大閘蟹分布情況，以全部樣本為驗證集對模型進行驗證，鑒別準確率為69%，說明蛋白指紋圖譜可以用于陽澄湖大閘蟹真偽鑒別。

1.2 試驗方法

2.2.3陽澄湖大閘蟹及非陽澄湖大閘蟹蛋白圖譜

于EP管內充分研磨，加1 mL 0.1% TFA，渦旋混勻后，超聲處理10 min，除去提取液中脂類、組織碎片等雜質?；贛ALDI-TOF MS的蟹鰲肌肉組織蛋白質譜分析條件探索：采用梯度稀釋的方法獲得適合MALDI-TOF MS 分析的最佳蛋白含量，選擇0.1% TFA 進行蛋白提?。ㄈ?0 μL 上清液，加180 μL 0.1% TFA，渦旋混勻），SA(芥子酸)作為基質液，優化MALDI-TOF MS儀器參數，以獲得寬譜范圍內最佳質譜圖。MALDI-TOF MS 圖譜采集數據過程：取2 μL 樣品稀釋液，加18 μL SA 基質混勻，滴加2 μL 于靶點正中，按照樣品液與基質液1∶9 比例混勻，在質譜儀靶板正中點樣滴加2 μL待測樣本，低溫靜置待干燥后進行儀器分析。質譜檢測m/z（質荷比，mass-to-charge ratio）范圍為2 000~60 000，分析確定聚焦范圍、激光能量等相關質譜分析參數進行掃描和采集數據。

2.2.2陽澄湖大閘蟹及非陽澄湖大閘蟹蛋白圖譜m/z 聚焦范圍確定 通過分析不同品種大閘蟹MALDI-TOF MS 譜圖規律發現，陽澄湖大閘蟹蟹鰲肌肉組織在m/z 2 000~24 000 區間質譜峰更豐富，表明該品種大閘蟹蟹鰲肌肉組織中的多肽的種類分布更豐富；在m/z 小于10 000 范圍內，陽澄湖蟹與非陽澄湖蟹蛋白的種類和蛋白圖譜強度出峰強度高（圖5）。蛋白譜圖顯示，陽澄湖大閘蟹在m/z 2 000~10 000之間出峰強度高，說明蛋白在低m/z區聚集。此外，在m/z大于24 000時，不同品種大閘蟹蟹鰲肌肉組織蛋白指紋圖譜分布情況及不同蛋白相對豐度差異明顯。綜合分析發現，陽澄湖大閘蟹蟹鰲肌肉組織與非陽澄湖大閘蟹之間在多肽區域差異較為顯著，故針對質譜圖中m/z 2 000~24 000 區間進行深入分析，并結合Chem Pattern 化學計量學軟件對大閘蟹MALDI-TOF MS 蛋白質指紋圖譜進行統計分析，探索陽澄湖大閘蟹與其他品種、其他生長環境的蟹類肌肉組織蛋白在質譜圖上差異。質譜分析發現，在 m/z 2 000～10 000 范圍內出峰較多（圖6A和C），說明蟹肉組織中多肽類物質種類豐富，而當m/z＞10 000 時出峰相對較少（圖6B和D），故選擇m/z=2 000～10 000 區間進一步分析不同來源湖蟹間指紋圖譜差異。

聚焦激光能量確定 激光強度可以影響質譜峰的強度以及分辨率，能量越高，峰強度越高，但相應的分辨率會下降。利用MALDI-TOF MS技術的高靈敏度、高分辨率、寬檢測范圍的特點，在全m/z范圍內對陽澄湖養殖區域的大閘蟹蟹組織進行蛋白質組學的檢測。分析發現，在激光強度9 μJ 條件下，將陽澄湖養殖區域內的大閘蟹與非陽澄湖大閘蟹進行比對，圖譜的信號強度較高、出峰較多且分辨率（resolution，R)較高，便于分析，結果如圖7 所示。表明激光能量為9 μJ 時質譜圖出峰強度及分辨率較好，因此選擇該激光能量作為下一步數據模型分析的采集參數。

圖1 蟹鰲肌肉組織Fig. 1 Tissue of the claw muscle

1.2.3MALDI-TOF MS 數據的采集 為獲得最佳質譜效果圖，質譜檢測m/z 范圍為2 000~60 000，設定m/z 10 000，選用脈沖能量9 μJ 作為激光強度進行掃描并采集數據[17]。結合機器學習算法對不同生活環境的大閘蟹組織蛋白指紋圖譜進行深度分析。

1.2.4數據處理方法 通過Chem Pattern 化學計量學軟件對大閘蟹MALDI-TOF MS蛋白質指紋圖譜進行統計分析；通過支持向量機（support vector machine，SVM）進行非線性預測；將數據導入SPSS分析軟件進行分析，利用配對樣本t檢驗，檢驗陽澄湖大閘蟹與非陽澄湖大閘蟹之間的蛋白質含量是否具有顯著性的統計學差異。

2 結果與分析

2.1 陽澄湖與非陽澄湖大閘蟹的外觀差異

陽澄湖大閘蟹（圖2）背部潔凈且富有光澤的青灰色、呈半透明；蟹腹部潔白如玉不沾泥；蟹爪尖上有煙絲般的金黃色須毛；其中雄蟹絨毛細密而柔軟、不帶泥土屑，兩螯8 條腿上有1 層金黃色的絨毛，長達3~4 cm。雖然各類大閘蟹外觀相似，但是相較于其他湖蟹，陽澄湖大閘蟹的蛋白質、脂肪、維生素等營養元素的含量極高，蟹肉中還含有豐富的氨基酸，其中丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、脯氨酸等呈甜味的氨基酸[1]，讓陽澄湖大閘蟹肉質鮮嫩清甜，在口感、味道等方面明顯不同于非陽澄湖大閘蟹。

2) RuntimeService：提供啟動流程、查詢流程實例和設置獲取流程實例變量等功能。此外,提供對流程部署、流程定義和流程實例的存取服務。

圖2 不同大閘蟹的外觀Fig. 2 Appearance of different hairy crabs

三維解剖圖和冠狀位圖像（圖3）顯示，相較于非陽澄湖大閘蟹，陽澄湖大閘蟹蟹鰲組織更多，尤其是兩螯8 腿部分，且蟹黃更加飽滿。陽澄湖大閘蟹與其他湖蟹存在明顯差別，非陽澄湖的蟹黃體積明顯小于陽澄湖大閘蟹，主要是因為陽澄湖大閘蟹洄游生殖的習性與眾不同。陽澄湖作為距離入?？谳^近的湖泊之一，由于出水港口較多，湖水活性好，水體整體澄清，透明度高，使得陽澄湖大閘蟹具有清背、白肚、金爪、黃毛的特征。陽澄湖周邊環境全部是生態綠地，工業污染少，水體清澄透明，是蘇州的飲用水源地，湖水質量有保障；陽澄湖湖底淤泥少且沙質土壤堅硬，平坦的湖底為大閘蟹提供了廣闊的爬行空間，充足的運動量使得大閘蟹肉質緊致結實，蟹兩螯8 腿肉感強，強勁有力。陽澄湖大閘蟹的步足力量大，能在呈45°角傾斜的光滑玻璃上站立與爬行，而非陽澄湖的多數湖水呈弱酸性，對蟹殼具有一定的腐蝕性，在此環境中長大的蟹需要厚實且堅硬的蟹殼來抵擋湖水的侵蝕，蟹肉缺少甘甜的味道。

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設計了橋梁高速施工中大跨徑連續施工技術，首先通過正向分析法，對大跨徑橋梁進行正向分析，對橋梁評價指標進行實時獲取。然后建立橋梁高速施工控制策略并進行控制計算，明確控制參數結果。最后實行施工監測，保證施工數據和理論數據相一致，實現橋梁大跨徑連續高速施工。實驗證明，設計的大跨徑連續施工技術施工精確度和施工效率更高，具有推廣價值。

圖3 不同大閘蟹三維解剖圖與冠狀位圖像Fig. 3 3D anatomy and coronal image of different hairy crabs

2.2 蟹蛋白質譜分析鑒定不同大閘蟹品種

2.2.1大閘蟹蛋白圖譜特征分析 將純化后的樣品液進行MALDI-TOF MS生物質譜分析以獲得其分子指紋圖譜，分別采集蟹鰲組織關鍵取樣點，比較各組不同來源蛋白質譜中差異性蛋白質的表達，呈現在質譜圖中即數十個甚至上百個不同強度的質譜峰（圖4）。同一物種在不同環境中表型會存在顯著差異，其核心在于外界環境對物種的生存及代謝產生影響。試驗結果顯示，不同品種大閘蟹蟹鰲肌肉組織均存在比較豐富的多肽及蛋白質種類。比對不同品種大閘蟹蟹鰲肌肉組織質譜圖發現，由于生長環境不同，陽澄湖大閘蟹蟹鰲肌肉組織蛋白指紋圖譜相較于非陽澄湖大閘蟹存在顯著性差異。

圖4 MALDI-TOF MS采集的不同大閘蟹質譜Fig. 4 Mass spectra of different hairy crabs collected by MALDI-TOF MS

1.2.2蟹鰲肌肉組織蛋白質的提取取新鮮的蟹鰲肌肉組織(A、B、C、D，圖1），樣本混合后進行研磨，準確稱取250 mg 研磨好的樣品，加入1.0 mL 0.1% TFA，超聲提取20 min；12 000 r·min-1離心10 min；吸取上清液20 μL于新EP管，加入180 μL 0.1% TFA，渦旋混勻；取2.0 μL 樣品稀釋液，加入18 μL SA基質液，渦旋混勻，取2.0 μL點樣。樣點自然干燥后，于2 h內進行MALDI-TOF MS測定。

圖5 不同大閘蟹MALDI-TOF MS質譜差異對比Fig. 5 Comparison of mass spectra differences of different hairy crabs collected by MALDI-TOF MS

圖6 不同m/z條件下大閘蟹質譜對比Fig. 6 Comparison of mass spectra of hairy crabs under different m/z

1.2.1大閘蟹蛋白質提取方法 稱取蟹肉250 mg

從上表中可以看出，手機基站定位精度較低，且對其他定位方式的影響較小(比較GPS和GPS+手機基站，WIFI和WIFI+手機基站，GPS+WIFI和GPS+WIFI+手機基站)，WIFI+GPS定位精度較高。同時，一個顯而易見的結果是，WIFI定位和手機基站定位無法定位出海拔高度，因為這兩者本身給出的位置是平面性的，如需要確定位置海拔高度需衛星定位。

試劑包括購自融智生物科技(青島)有限公司的三氟乙酸(trifluoroacetic acid，TFA)、芥子酸(sinapic acid， SA)基質液、0.01 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS， pH 7.4)、α-氰基-4-羥基肉桂酸(a-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA)，動物組織蛋白裂解液(賽默飛)等。

圖8 支持向量機結果Fig. 8 Result of SVM

2.2.5統計分析 由表1 可知，陽澄湖大閘蟹的蛋白質m/z 平均值為10 621.27，非陽澄湖大閘蟹的蛋白質m/z 平均值為10 381.76，表明在陽澄湖大閘蟹蛋白質含量多于非陽澄湖大閘蟹，所以認為陽澄湖大閘蟹的品質更好。

第十屆全國人大副委員長、原化工部部長顧秀蓮，第十一屆全國政協常委、第十屆上海市政協主席蔣以任，上海市政府副秘書長、市國資委黨委書記、主任宋依佳，中國石油和化學工業聯合會副會長傅向升等出席座談會并講話；上海市交通委黨組書記、主任謝峰，上海市應急管理局黨組書記、局長馬堅泓，上海市化學工業區管理委員會黨委書記、主任馬靜出席座談會；集團黨委書記、董事長劉訓峰作主題報告，總裁王霞主持。

表1 樣本統計Table 1 Sample statistics

根據不同強度的質譜圖，選取了m/z（2 000~10 000）中一共33 組數據進行配對樣本t檢驗（表2），根據蟹鰲肌肉組織蛋白定性定量檢測數據，陽澄湖大閘蟹的肌肉組織蛋白高于非陽澄湖大閘蟹，2 組螃蟹之間的顯著性P值為0.000，顯著性P值小于0.05，認為2 個螃蟹品種之間的蟹鰲肌肉組織蛋白的差異具有統計學意義。

表2 樣本檢驗Table 2 Test of samples

3 討 論

基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)作為一種高效、精確的分析方法，可以使不易氣化、電離的樣品分子實現離子化。MALDI-TOF MS 質譜通過反映與組成有關的分子離子峰，提供了蛋白質分子的相對分子質量數據。

蟹螯肌肉組織蛋白種類豐富，呈現在質譜圖中即數十個甚至上百個不同強度的質譜峰。將待測樣本的指紋圖譜與數據庫進行對比，對樣本的表達蛋白列表和每個蛋白表達量大小的綜合積分進行計算分析，判斷蛋白組圖譜是否存在異常，從而實現螃蟹相似度評估。利用寬譜高分辨基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜在寬m/z 范圍（1 000~300 000)內采用軟電離方式進行蛋白組學的檢測，選擇合適的前處理方式且不引入降低離子化效率的化合物，使得沒有或極少產生離子碎片，便于后期數據解析。 在一定范圍內（m/z 2 000~50 000）可以明顯識別陽澄湖大閘蟹與非陽澄湖大閘蟹在質譜圖上的差異。m/z<10 000 范圍內均有明顯差異，掃描結果顯示該區域出峰強度較高且分標率較高，可以作為區分陽澄湖大閘蟹與其他類別湖蟹的質譜分辨區。動物組織蛋白提取、MALDI-TOF MS 質譜蛋白質組學分析等技術手段在各領域都已比較成熟，技術風險較小。本研究結合這2 種技術運用到物種鑒定上，總體上風險可控，成功率較大；所用的化學試劑和藥品都比較常見，試驗方法簡便易行。利用其高靈敏度、高分辨率、寬檢測范圍的特點實現大閘蟹品質的鑒定方案具有極高的可行性。

因此分析組織蛋白MALDI-TOF MS 譜圖規律，建立不同品類螃蟹蛋白質分子指紋圖譜數據庫，探索本地陽澄湖大閘蟹與其他品種、其他生長環境的蟹類肌肉組織蛋白在質譜圖上差異，并配合機器深度學習算法對數據庫進行深度分析。該方法具有準確可靠、操作便捷快速、推廣成本可控、高通量靶向監測和高通量非靶向篩查的特點，可用于鑒別陽澄湖大閘蟹真偽。