基于桑格測序法建立高鼻羚羊鑒定方法的可行性研究

沙才華，廖秀云，陳 軒，周傲白雪，蔣曉霞，徐博文，黃海超，趙福振，邵建宏

（拱北海關技術中心，國家外來病檢測重點實驗室，國家口蹄疫豬瘟檢測重點實驗室，珠海，519001）

高鼻羚羊（Saiga tatarica）是與劍齒虎（Saber toothed tiger）同期的有蹄類食草動物［1］，被視為具有重要生物學研究價值的活化石。高鼻羚羊的角俗稱羚羊角，在中國傳統醫學中被視為珍稀藥材。歷史上，高鼻羚羊廣泛分布于歐亞大草原，東北至蒙古，東南至中國新疆，橫跨西北部的喀爾巴阡山脈和西南部的高加索山脈，在更為久遠的更新世，高鼻羚羊也曾出沒于白令區域和歐洲的不列顛群島［2］。目前，高鼻羚羊在中國境內已滅絕，整合分類學資訊系統（ITIS）公布的資料顯示［3］，高鼻羚羊分布于南亞、北亞和歐洲，又被稱為草原高鼻羚羊（steppe saiga），“steppe”一詞特指西伯利亞一帶沒有樹木的大草原。另有資料顯示，高鼻羚羊現分布于俄羅斯、哈薩克斯坦、土庫曼斯坦和烏茲別克斯坦［4］。由于分布范圍小、數量少和人工馴養難度大，高鼻羚羊被世界自然保護聯盟（IUCN）列為瀕危物種紅色名錄極危（CR）物種［5］，被保護野生動物遷徙物種公約（CMS）和瀕危野生動植物種國際貿易公約（CITES）列入附錄Ⅱ，是國家一級重點保護野生動物。

調查顯示，高鼻羚羊的分布地區普遍存在盜獵行為，20世紀80年代從前蘇聯出口至中國、日本等地的高鼻羚羊角實際值為官方統計值的5～7倍，1994年從俄羅斯、哈薩克斯坦等地非法走私至東亞的高鼻羚羊角達44 t［6］。2005—2010年，分布有高鼻羚羊的土庫曼斯坦、烏茲別克斯坦、哈薩克斯坦、俄羅斯聯邦和蒙古5個國家相繼簽署CMS［7］，全面取消高鼻羚羊及其制品的國際貿易。然而，非法走私高鼻羚羊角的行為仍屢禁不止，單次最高走私量超過1 000 根［8-9］。此外，由于供需關系長期嚴重不均衡，高鼻羚羊角的黑市價格已高達人民幣8 萬元/根［10-11］。因此，研究高鼻羚羊角的鑒定方法對保護瀕危野生動物，打擊違法犯罪和統一執法口徑具有重要意義。

目前針對高鼻羚羊角鑒定方法的研究主要包括形態觀察、切片觀察等直接判斷法，光譜、色譜等理化分析法，以及各類分子生物學法，由于技術原理和技術手段的區別，上述鑒定方法均有自身的適用性和局限性，基于同類技術建立的不同鑒定方法在鑒定結果上也可能存在偏差。分子生物學技術對微量、痕量樣品的鑒定具有顯著優勢。自常規PCR 技術面世以來，基于分子生物學理念開發的各類檢測、鑒定方法一直在物種鑒定領域中占據主導地位，因此，本研究基于桑格測序法建立一套鑒定高鼻羚羊及其制品的分子生物學檢測方法并驗證其可行性，以作為現有技術的進一步補充。

1 試驗材料

1.1 高鼻羚羊樣品

拱北海關技術中心動物檢疫實驗室存留的高鼻羚羊完整角2份，編號1和2；市場采購的商品化高鼻羚羊角粉3 份，廠商分別為北京同仁堂（亳州）飲片有限責任公司、成都岷江源藥業有限公司和內蒙古普康藥業有限公司，對應編號3、4和5。

1.2 對照樣品

拱北海關技術中心動物檢疫實驗室存留的動物組織和動物制品，包括野牦牛（Bos mutus）肉、水牛（Bubalus bubalis）完整角、家牛（Bos taurus）完整角、梅花鹿（Cervus nippon）完整角、馴鹿（Rangifer tarandus）角切片、馬鹿（Cervus elaphus）角切片、山羊（Capra hircus）完整角、綿羊（Ovis aries）完整角和白犀牛（Ceratotherium simum）角磨粉，各1 份，編號6～14。樣品1、2和6～14均于較早前使用本實驗室自行設計的分子生物學鑒定方法（經CNAS 認證）確認為所述物種。

2 試驗方法

2.1 樣品DNA提取

用蘸有95%乙醇的棉球均勻擦拭角制樣品和肉制樣品的表面數次，以清除附著在樣品表面可能影響檢測結果的異物，干燥后使用碎瓷片或手電鉆（無菌鉆頭）刮/鉆取適量角實質或使用無菌剪刀剪取適量肉組織制備待檢樣品。粉末狀制品直接拆封稱取適量粉末制備待檢樣品。上述待檢樣品均嚴格按照OMEGA 核酸提取試劑盒（OMEGA E.Z.N.A.?Tissue DNA Kit D3396-02）說明書提取DNA，并于-20 ℃保存備用。

2.2 PCR引物合成

由上海輝睿生物科技有限公司合成PCR 引物，大小約300 bp，引物序列：F-primer-300，5'-ACTTCTAGCATCTTCCATAGTTGAG-3'；R-primer-300，5'-GGGAAGTGAAAGGAGTAGGAGG-3'［11］。

2.3 PCR擴增

以供試樣品提取的DNA 為模板進行常規PCR擴增，反應體系：2×TaqPCR Mastermix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL（10 μmol/L），DNA 模板2.0 μL，補水至總反應體積25.0 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33個循環；72 ℃完全延伸5 min。

2.4 電泳和測序

擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并采用桑格測序法雙向測序（測序工作由本實驗室完成）。

2.5 序列分析

通過美國國家生物技術信息中心（NCBI）的序列比對工具BLAST 進行物種相似性比對分析，驗證物種來源。

3 結果

3.1 PCR擴增產物電泳結果

樣品1～4 在約300 bp 處均呈現顯著擴增條帶，樣品5在300 bp處呈現極微弱擴增條帶，樣品6～14、陰性對照和空白對照均未見擴增條帶（圖1）。

圖1 PCR擴增產物電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of PCR amplified products

3.2 NCBI比對結果

2份高鼻羚羊角樣品（樣品1、2）和3份商品化羚羊角粉樣品（樣品3、4 和5）的測序結果（表1）經BLAST 檢索均顯示為Saiga tatarica，且所有測序結果與Saiga tatarica參考序列（登錄號：NC_020746.1）的相似性均大于99.42%（表2）。

表1 樣品1～5的測序結果Tab.1 Sequencing results of sample 1 to sample 5

表2 樣品1～5序列的BLAST結果Tab.2 Results of BLAST for the sequences of sample 1 to sample 5

4 討論

在探索高鼻羚羊桑格測序鑒定方法的過程中，本研究曾根據NCBI 基因數據庫公布的高鼻羚羊細胞色素c 氧化酶亞型Ⅰ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，COI）基因序列，在高度保守區域設計兩套特異性PCR 引物（表3），多次重復試驗結果表明兩套引物均能準確分辨供試樣品是否含有高鼻羚羊成分，但PCR 擴增產物的凝膠電泳圖呈現部分假陽性（圖2），而使用上述對照樣品的引物配合PCR 反應參數得到的擴增結果未出現假陽性。綜合既往研究，發現較長的擴增產物片段有利于提高序列分析的準確性，但可能不利于凝膠電泳圖的特異性呈現。

表3 高鼻羚羊細胞色素c氧化酶亞型Ⅰ基因擴增引物Tab.3 Cytochrome c oxidase subunit I gene amplification primers for Saiga antelope

圖2 部分樣品的Primer-654檢測結果Fig.2 Gel electropherograms of PCR amplification products of some of the samples using Primer-654

具有特征曲線的角是高鼻羚羊最具經濟價值的組織，但多數動物的角組織由角質蛋白和膠原蛋白等成分組成，其線粒體DNA 含量遠少于肉、皮和骨等其他組織，為確保鑒定結果的準確性，本研究先后嘗試了全自動核酸提取儀和人工過柱提取2 種不同的方法，發現后者得到的DNA 質量略優于前者，DNA 質量濃度均大于20 ng/μL，該濃度能夠滿足PCR 擴增的基本要求，但DNA 的平均質量濃度僅為其他常見組織的6%～10%。如圖1、表2 所示，本研究所有對照樣品均未見擴增條帶，而所有陽性樣品與高鼻羚羊參考序列的相似性均大于99.42%，其中，樣品5 的凝膠電泳條帶極其微弱，但其擴增產物測得的序列仍能明確區分于林羚（Tragelaphus spekii）等其他近似物種。經過對蔣超等［11］公開的特異性引物進行反應條件優化并增加桑格測序，本研究建立的檢測方法具有靈敏度高、特異性強的特點，能夠準確擴增微量目標基因。

此外，高鼻羚羊屬（Saiga）物種的分類在國際上仍未達成共識，查詢ITIS、NCBI、IUCN、CMS、CITES 以及國家重點保護野生動物名錄公布的最新物種信息，可歸納出兩個主要分歧和一個高度統一。分歧一是將蒙古高鼻羚羊單列為一個物種（ITIS、CMS 和CITES），亦或歸入高鼻羚羊的亞種（NCBI、IUCN）；分歧二是若蒙古高鼻羚羊單列為一個物種，是否應將其進一步細分為Saiga borealis borealis和S.b.mongolica2 個亞種。統一之處為除國家重點保護野生動物名錄外，其他機構/名錄都從種或亞種的層面將高鼻羚羊與蒙古高鼻羚羊進行區分（表4）。然而，本研究測得的所有目標序列在NCBI 基因數據庫的比對結果僅匹配至種，未顯示具體亞種。為嘗試區分，本研究通過NCBI 進一步查詢S.tatarica、S.t.tatarica和S.t.mongolica的相關信息，發現NCBI 收錄上述3 個物種/亞種的線粒體基因序列數分別為291、76、26 條，前者有長度大于16 000 bp的線粒體全基因序列，而后兩者序列的最長長度均小于1 220 bp，且后兩者均未登錄線粒體的COI基因序列，也未查詢到S.borealis的相關序列。因而，根據現有、可及的種和亞種序列，本研究無法進一步判斷上述方法是否能夠準確區分S.tatarica tatarica和S.t.mongolica，或S.tatarica和S.borealis。換言之，現階段的材料無法證明本研究建立的方法能夠在分子層面區分高鼻羚羊和蒙古高鼻羚羊。再者，本研究納入的平行樣品和對照樣品數量和種類偏少，也未能基于明確、可信的證據分別獲得高鼻羚羊和蒙古高鼻羚羊的樣品，上述均有待后續加以拓展和驗證。

表4 高鼻羚羊屬物種分類Tab.4 Species classification of Saiga