苗藥花蝴蝶回調CIA模型大鼠脂肪細胞變化的研究*

張慶忠,龍思芳,戚國平,魏勝蘭,吳富小,朱啟悅,張亞亞,李 秋,韋小龍

(黔南民族醫學高等?？茖W校,貴州 都勻 558000)

類風濕關節炎(RA)是一種臨床表現為手、足小關節的侵襲性炎癥、器官受累、關節畸形、功能喪失等癥狀的疾病[1-3]。國內RA發病率約為0.3%,全世界為0.5%～1.0%,若控制不好約35%RA患者10年內會喪失工作能力[2-3]。目前,治愈RA的文獻資料報道不多,該病的發生與其組織、關節畸變的直接代謝關聯性研究資料也不豐富?；ê麑W名赤脛散(PolygonumruncinatumBuch.-Ham.var.SinenseHemsl.),為蓼科蓼屬植物。貴州省苗族民間中草藥醫生常用此藥治療RA,效果較好[4-5]。本課題組前期研究發現,苗藥花蝴蝶回調RA模型大鼠脂肪細胞、白細胞變化的效果較好。結合另一些研究資料,苗藥花蝴蝶調節牛二型膠原蛋白誘導關節炎(CIA)模型大鼠實驗研究指標有甘油三酯(TG)、脂聯素(ADPN)、白細胞介素-10(IL-10)、類風濕因子(RF)、免疫球蛋白(Ig)等[6-8]。本實驗旨在探討苗藥花蝴蝶回調CIA模型大鼠炎癥、關節畸形等的直接代謝相關因子及其作用機制?，F將本實驗結果報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1苗藥花蝴蝶 提取藥液制備:采自貴州省都勻市螺螄殼等地新鮮苗藥花蝴蝶全株約1 500g,清理洗凈后實驗室水提3次,最后取濃縮液靜置備用。

1.1.2實驗動物及試劑 SPF級雄性SD大鼠40只,體重(180±20)g,由陸軍軍醫大學動物實驗中心提供[SCXK-(軍)2022-0012]。完全弗氏佐劑(CFA)購自美國SIGMA公司;ADPN、IL-10、牛Ⅱ型膠原蛋白(CⅡ)購自北京索萊寶科技有限公司;氨甲蝶呤片為貴州鼎晟泰生物科技有限公司提供(批準文號:國藥準字H31020644)等。

1.2方法

1.2.1CIA建模 將40只大鼠隨機分為正常組8只及建模組32只,按照動物福利保護法進行實驗(本校倫理委員會動物實驗倫理審查表編號:2023013)。將CⅡ溶于0.1 g/mL醋酸溶液,制成濃度為1 mg/mLCⅡ溶液,搖床4 ℃過夜。次日將CⅡ溶液與CFA按體積比(1∶2)混合,并于冰上乳化成乳劑(即CIA建模液)。每只建模組大鼠左右后足跖部皮內注射0.25 mg CIA建模液。

1.2.2建模后分組 CIA建模后大鼠單足關節炎指數評分大于或等于3.5,出現前足或后足關節紅腫、踝關節明顯腫脹,視為造模成功[9]。建模成功CIA模型大鼠隨機分為CIA模型組(模型組)8只、氨甲蝶呤治療組(氨甲蝶呤組)8只、花蝴蝶高劑量治療組(花蝴蝶高組)8只、花蝴蝶低劑量治療組(花蝴蝶低組)8只。

1.2.3給藥 分組第2天,各組大鼠經灌胃給藥。正常組大鼠給予生理鹽水,氨甲蝶呤組大鼠給予1.04 mg/kg氨甲蝶呤,每周2次;結合民間用藥經驗[4-5],花蝴蝶高、低組藥液量分別為每天7.6、3.8 mg/kg。灌胃約35 d即停止給藥(可根據實驗情況調整)。

1.2.4觀察指標

1.2.4.1足腫脹情況觀察 建模前1 d,建模后第4、8、12、16、20、24、28、32天,觀察、評估各組大鼠左右后足跖關節腫脹情況,并照相記錄。根據各組大鼠足關節腫脹評分標準[1,9]進行比較。

1.2.4.2血液相關指標檢測 末次給藥后第2天,腹腔注射10%水合氯醛麻醉[1](0.1 mg/100 g鼠體重),大鼠仰位固定行腹主動脈取全血3 mL即送貴州醫科大學第三附屬醫院檢驗科進行TG、RF、IgA、IgG、IgM等指標檢測。

1.2.4.3IL-10、ADPN檢測 按“1.2.4.2”法麻醉大鼠,大鼠仰位固定行腹主動脈取全血3 mL,靜置1 h并以2 000 r/min離心15 min,取血清,嚴格按酶聯免疫吸附測定法(ELISA法)試劑盒說明檢測IL-10、ADPN。

1.2.4.4足關節病理切片 按“1.2.4.2”法麻醉大鼠,取足關節,并用4%多聚甲醇固定,后送黔南州人民醫院病理科行鼠足關節病理切片(HE染色)制作并掃描成數字圖片資料。進行足趾關節病理切片評分[9]。

2 結 果

2.1各組大鼠足腫脹情況 CIA模型組大鼠關節腫脹指數評分明顯高于正常組、氨甲蝶呤組及花蝴蝶高、低組,差異均有統計學意義(P<0.05);氨甲蝶呤組、花蝴蝶高組大鼠關節腫脹指數評分與正常組比較,差異均無統計學意義(P>0.05),見圖1、表1。

表1 各組大鼠關節腫脹指數評分比較分,n=8)

注:A為正常組;B為CIA模型組;C為氨甲蝶呤組;D為花蝴蝶高組;E為花蝴蝶低組。

2.2各組大鼠RF、IgA、IgG、IgM水平比較 CIA模型組大鼠RF水平明顯高于正常組、氨甲蝶呤組及花蝴蝶高、低組,差異均有統計學意義(P<0.05)。CIA模型大鼠IgA水平明顯低于正常組和氨甲蝶呤組,但明顯高于花蝴蝶高組,差異均有統計學意義(P<0.05),氨甲蝶呤組IgA水平明顯低于正常組,明顯高于花蝴蝶高、低組,差異均有統計學意義(P<0.05)?；ê呓M大鼠IgA水平明顯低于正常組,略高于花蝴蝶低組,但差異均無統計學意義(P>0.05)。CIA模型大鼠IgG水平明顯高于正常組和氨甲蝶呤組,略低于花蝴蝶低組,差異均有統計學意義(P<0.05),略高于花蝴蝶高組,但差異無統計學意義(P>0.05)。氨甲蝶呤組大鼠IgG水平明顯低于花蝴蝶高、低組,差異均有統計學意義(P<0.05),略高于正常組,但差異無統計學意義(P>0.05)?；ê呓M大鼠IgG水平明顯高于正常組,差異有統計學意義(P<0.05),略低于花蝴蝶低組,但差異無統計學意義(P>0.05)。CIA模型組、氨甲蝶呤組、花蝴蝶高組大鼠IgM水平均明顯高于正常組,差異均有統計學意義(P<0.05),CIA模型組大鼠IgM水平略高于氨甲蝶呤組及花蝴蝶高、低組,花蝴蝶高組大鼠IgM水平略低于花蝴蝶低組,但差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠RF、IgA、IgG、IgM水平比較

2.3各組大鼠TG、ADPN、IL-10水平比較 CIA模型組大鼠TG水平明顯低于正常組、氨甲蝶呤組和花蝴蝶高組,差異均有統計學意義(P<0.05),略低于花蝴蝶低組,但差異無統計學意義(P>0.05)。氨甲蝶呤組大鼠TG水平略低于正常組,花蝴蝶高、低組,花蝴蝶高組大鼠TG水平略低于正常組,略高于花蝴蝶低組,但差異均無統計學意義(P>0.05)。CIA模型組大鼠ADPN水平明顯低于正常組、氨甲蝶呤組、花蝴蝶高組,氨甲蝶呤組大鼠ADPN水平明顯低于花蝴蝶低組,花蝴蝶高組大鼠ADPN水平明顯高于氨甲蝶呤組和花蝴蝶低組,差異均有統計學意義(P<0.05)。CIA模型組大鼠IL-10水平明顯低于正常組、花蝴蝶高組,差異均有統計學意義(P<0.05),略低于氨甲蝶呤組、花蝴蝶低組,但差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

2.4各組大鼠足趾關節病理切片評分比較 CIA模型組大鼠脂肪細胞評分低于其他組,白細胞評分高于其他組;與其他組比較,CIA模型組大鼠足關節骨髓腔內現低度脂肪細胞,而白細胞彌漫性增生,差異均有統計學意義(P<0.05),見表3、圖3。

表3 各組大鼠足趾關節病理切片評分比較分,n=8)

注:A為正常組;B為CIA模型組;C為氨甲蝶呤組;D為花蝴蝶高組;E為花蝴蝶低組。

3 討 論

雖然RA病因及發病機制尚不清楚,但有研究認為脂肪細胞變化及其分泌功能性因子和免疫調節因子紊亂是RA發生機制之一[6-8]。本實驗足關節病理切片結果提示,CIA模型組大鼠足關節骨髓腔內現明顯低度脂肪細胞,脂肪細胞可能是RA炎癥、關節畸形等直接代謝關聯的重要指標細胞之一。

RF是臨床醫學診斷RA時常用經典檢測指標[10-12]。本實驗中,CIA模型組大鼠RF、IgM水平明顯高于其他組,IgG水平低于花蝴蝶低組而高于其他組,可能是CIA模型組大鼠沒有給藥花蝴蝶,其體內CⅡ、CFA持續刺激,CIA模型組大鼠反復多次產生了抗體IgG、IgM和抗抗體IgG、IgM等,導致了RF-IgG和RF-IgM水平顯著增加,最終升高了RF、IgG、IgM水平。

CIA模型組大鼠TG、ADPN水平明顯低于其他組,提示可能CIA模型組大鼠脂肪細胞顯著減少,導致該細胞分泌功能性物質(如TG等,TG是重要能源物質之一)和免疫活性因子(如ADPN等)明顯不足,促進了CIA模型組大鼠發生RA和病變。這雖與相關研究結果(脂肪細胞組織是具有內分泌和免疫功能的活性組織)相似[6-7],但仍需進一步實驗證實。

此外,CIA模型組大鼠IL-10水平也較其他組顯著降低。IL-10是公認的炎癥與免疫抑制因子,作為一種多細胞源、多功能的細胞因子,其相對或絕對缺乏,會持續引起免疫激活,導致RA[8,13]。另有研究報道,因IL-10抑制了Th1細胞的免疫調節作用、單核細胞化學趨化作用等[14-15],使RF-IgG和RF-IgM水平顯著增高,即升高了RF水平。

苗藥花蝴蝶可能通過回調CIA模型大鼠脂肪細胞減少,恢復了其功能性物質(如TG等)正常分泌,因此緩解了CIA模型大鼠能量代謝,由于模型大鼠能量供應正常,助力回轉了大鼠炎癥的發展、關節組織畸變凋亡等;此外,苗藥花蝴蝶可能通過回調CIA模型鼠能量代謝水平,使其正常分泌免疫因子,如脂肪因子ADPN、IL-10等,而這些直接參與免疫調節的活性因子又緩解了CIA模型大鼠炎癥、關節畸形等癥狀。目前,這些免疫因子與CIA模型鼠關節畸形等變化的直接物質代謝機制,仍是本課題組進一步研究的方向之一。

綜上所述,苗藥花蝴蝶可能通過回調CIA模型鼠脂肪細胞的減少,保證了正常的能量代謝(如TG)和免疫調節因子分泌(如ADPN、IL-10等),增強了免疫調節作用(如回調了RF、IgG、IgM等),緩解了CIA模型大鼠足關節炎癥、畸形等。