青頭菌多酚的提取及體外抗氧化活性的研究

趙紅艷,張鴨關

(曲靖師范學院 化學與環境科學學院，云南 曲靖 655011)

0 引 言

云南得天獨厚的地理條件,孕育著口感細膩、味道鮮美、營養價值極高的各類野生菌[1].大量研究表明,野生菌具有很高的營養價值與藥用價值,多食食用菌不僅可以增強機體免疫功能、降低癌癥誘發率,還能降血脂、降血壓.因此,野生菌也越來越受人們的喜愛.近年來,隨著人們對野生菌研究的不斷深入,野生菌在醫學領域的應用也愈加廣泛.青頭菌[Russulavirescens(Schaeff.)Fr.]是一種常見食藥用菌,又稱綠菇或青桿菌等[2],隸屬傘菌目、紅菇科、紅菇屬,味道鮮美,營養豐富,具有較好的保健與藥用價值[3].早在明代中醫藥學著作《滇南本草》中,就有對“青頭菌”藥用功效“氣味甘淡,微酸,無毒,主治眼目不明,能瀉肝經之火,散熱舒氣,婦人氣郁,服之最良”的記載[2],近年來研究表明,“青頭菌”有抑制腫瘤、消炎、抑菌、抗氧化和調節血脂等功效[4].

酚類化合物是指帶有一個或者多個羥基芳環,多酚是一類含有特定倍數苯酚單元化合物的總稱[5],主要分布于植物細胞的液泡內,一般以糖苷形式廣泛存在[6].多酚類物質具有延緩衰老、降血壓、降血脂、預防癌癥和抑菌抗炎功能[7],這也使得多酚的研究越來越受人們的關注.

1 實驗材料與方法

1.1 主要材料與儀器

數顯恒溫水浴鍋金壇區西城新瑞儀器廠;TDL-5-A飛鴿牌系列離心機上海安亭科學儀器廠;紫外分光光度計TU-1810北京普析通用儀器有限責任公司;SK2200H超聲波清洗器上?？茖С晝x器有限責任公司;DHG-9053A電熱鼓風干燥箱上海一恒科學儀器有限責任公司;DFY-800C高速粉碎機溫嶺市林大機械有限公司;AL204-IC電子天平梅特勒-拖利多儀器上海有限責任公司.

沒食子酸;無水乙醇;無水碳酸鈉;磷酸二氫鈉;磷酸氫二鈉;硫酸亞鐵;鐵氰化鉀;三氯化鐵;30%過氧化氫;DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼);水楊酸;福林酚;三氯乙酸.以上試劑都為分析純,生產廠家為天津市風帆化學試劑科技有限責任公司.

1.2 原料處理

青頭菌,采自曲靖市附近山上(見圖1),由曲靖師范學院生物資源與食品工程學院韓麗紅教授鑒定為青頭菌(Russulavirescens).將青頭菌根部去除,用蒸餾水清洗干凈后,切片,低溫烘干、粉碎,密封備用.

圖1 采自野外的青頭菌

1.3 實驗方法

1.3.1 多酚標準曲線的繪制

參考唐婷范等人[8]方法并加以調整:準確稱取0.01g的沒食子酸,加水溶解,轉移到100 mL的容量瓶中定容,可得0.1mg/mL的沒食子酸溶液.在五支潔凈的25 mL棕色容量瓶中分別移入0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的沒食子酸標準溶液,然后補水至總體積為6.0 mL,再分別加0.5 mL的福林酚,混勻后再加1.5 mL 20%Na2CO3,搖勻.用未加沒事子酸的溶液作為空白對照.將六支容量瓶放到暗處放置30 min.在760 nm處測定六支容量瓶中溶液的吸光度,繪制標準曲線.

1.3.2 青頭菌中多酚的提取及含量的測定

參照張曉婷等人[9]提取多酚的方法并加以調整:稱取1g青頭菌粉末,按照一定的料液比加入一定量的一定濃度的乙醇溶液,保持超聲儀器的溫度為30℃,將離心管放到超聲儀器中提取一定時間后離心5 min,然后將上清液定容到50 mL的容量瓶中,得到多酚提取液.移取1 mL多酚提取液于25 mL的棕色容量瓶中,然后按照標準曲線方法顯色.放置30 min測定多酚濃度.計算多酚含量.

式中:Y(mg/g)是青頭菌多酚提取率;C是待測液濃度(mg/mL);V是樣品溶液的體積(mL);N是稀釋倍數;m是青頭菌干粉的質量(g).

1.3.3 單因素實驗

分別選取不同提取時間(20 min、30 min、40 min、50 min、60 min)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60),乙醇體積分數(20%、30%、40%、50%、60%),進行單因素實驗

1.3.4 正交實驗設計

根據單因素實驗結果,選擇超聲時間、料液比、乙醇體積分數三個水平進行正交實驗,見表1.

表1 正交試驗因素水平表

1.3.5 青頭菌多酚抗氧化活性實驗

(1)青頭菌多酚對羥基自由基的清除

參考李曉強等人[10]的水楊酸法,取9 mmol/L的水楊酸和9 mmol/L的FeSO4各1mL于試管中,再加入2 mL樣品和1 mL 9.8 mmol/L的H2O2進行顯色反應,搖勻后于37℃水浴反應30 min,在510 nm波長下測定混合液的吸光值A1.用超純水代替H2O2溶液測得對照吸光值A2.用乙醇溶液代替樣品測吸光值A0.·OH清除率的計算公式如下:

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

式中:A1-加樣之后所測的吸光度;

A2-純水代替H2O2溶液所測的吸光度;

A0-乙醇溶液代替樣品液所測的吸光度.

(2)青頭菌多酚對DPPH自由基的清除

參考郭翎菲[11]的方法稍作調整,取2.0 mL DPPH溶液和2.0 mL不同濃度的多糖樣品溶液于10 mL比色管中,搖勻放置30 min,在517 nm處測定其吸光度A0,按照同樣的方法測定2.0 mL 80%乙醇溶液和不同濃度多糖樣品溶液2.0 mL的吸光度A1,2.0 mL 80%乙醇溶液和2.0 mL DPPH溶液的吸光度A2.以維生素C為對照品,按下式計算DPPH清除率:

清除率(%)=[1-(A0-A1)/A2]×100

式中:A0-DPPH加多糖之后所測的吸光度;

A1-乙醇代替DPPH之后所測的吸光度;

A2-乙醇代替多糖溶液所測的吸光度.

(3)青頭菌多酚對總還原能力的測定

參照張芳銘等人[12]的實驗方法稍作修改,量取0.1mL且依次增加0.1mL的多酚稀釋液于八支潔凈的離心管中,再分別補水至總體積為1 mL,然后加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液和2.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液,搖勻后放入50℃恒溫水浴鍋反應20 min.取出加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液,然后以3 000 r/min轉速離心5 min.取上清液2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL的三氯化鐵溶液,搖勻后靜置10 min.以試劑空白為參比液,在700 nm波長處測定該溶液的吸光度為A.以吸光度值反映總還原能力,吸光度值越大說明還原能力越強.

2 結果與討論

2.1 多酚標準曲線

以濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標做標準曲線,得回歸方程為Y=0.08708X+0.0177,R2=0.9996,線性較好.

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇體積分數對青頭菌多酚提取的影響結果

由圖2可以看出,隨乙醇體積分數增加,多酚得率先上升后下降.乙醇比例較高時,色素等脂溶性成分大量溶出,阻礙了多酚的溶出,且高濃度的乙醇更容易揮發,與張硯壘等人[13]探究乙醇體積分數對圓鈴1號棗多酚的提取影響得出的結論大體一致.因此最佳的乙醇體積分數為30%.

圖2 乙醇體積分數對青頭菌多酚提取的影響

2.2.2 料液比對青頭菌多酚提取的影響結果

由圖3可以看出,當料液比增加時,多酚的提取率呈上升趨勢,當料液比為1∶30時,多酚得率上升較明顯,最后趨于平穩.可能是料液比較低時,青頭菌中的多酚不能完全被提取出來,增加提取劑乙醇的用量,未被提取的多酚向提取劑乙醇中轉移,溶劑與原料的比值越大,濃度梯度越大,有效成分的擴散速率也越大,與林錦銘等人[14]探究料液比對美藤果殼多酚的提取影響得出的結論一致.因此最佳料液比為1∶50.

圖3 料液比對青頭菌多酚提取的影響

2.2.3 超聲時間對青頭菌多酚提取的影響結果

由圖4可以看出,在20 min～40 min間,青頭菌多酚得率隨時間的增加而升高,最大值為8.29 mg/g.延長時間,多酚得率先降低后又稍微升高,但均小于40 min的得率.多酚得率降低可能是由于提取時間過長,導致部分多酚被分解或過程中發生了氧化分解,與張硯壘等人[13]探究超聲時間對圓1號棗多酚的提取影響得出的結論大體一致.因此最佳提取時間為40 min.

圖4 超聲時間對青頭菌多酚提取的影響

2.3 正交實驗設計結果

由表2中的數據可以得出,三個因素對青頭菌多酚提取的影響大小為C(超聲時間)>A(乙醇體積分數)>B(料液比).其中超聲時間的影響最大,青頭菌多酚提取的最好組合為A1B1C1,即青頭菌多酚的最佳提取方案為乙醇體積分數30%,料液比1∶30,超聲時間40 min.對此方案進行驗證,稱取1g青頭菌粉末,按最佳組合A1B1C1重復三次實驗,多酚提取率分別為9.76 mg/g、9.79 mg/g、9.82 mg/g,于正交實驗結果相符合,因此最佳組合是合理的.

表2 正交實驗設計結果

2.4 抗氧化活性實驗

2.4.1 青頭菌多酚對·OH的清除結果

由圖5可知,青頭菌多酚和Vc的質量濃度越大,對·OH的清除率越大,即清除能力越強.當質量濃度為80 μg/mL時,青頭菌多酚和Vc對·OH的清除率分別為63.32%、96.32%.在胡新穎等人[7]的大麥多酚對·OH的清除能力的實驗中,50 μg/mL的大麥多酚對·OH的清除率為18.78%,本實驗中50 μg/mL的青頭菌多酚對·OH的清除率可達47.32%.相比,青頭菌多酚對·OH的清除率要高很多,說明青頭菌多酚對·OH具有良好的清除效果.

圖5 羥基自由基清除率測定結果

2.4.2 青頭菌多酚對DPPH自由基的清除率測定結果

由圖6可知,青頭菌多酚和Vc的質量濃度越大,對DPPH的清除率越大,即清除能力越強.當質量濃度為20.36 μg/mL時,青頭菌多酚和Vc對DPPH自由基的清除率達到最大值,分別為61.11%、95.32%,Vc對DPPH自由基的清除率明顯高于青頭菌多酚對DPPH自由基的清除率.在汪群等人[15]的海帶多酚對DPPH自由基的清除能力的實驗中,2.0 mg/mL的海帶游離多酚、結合多酚對DPPH自由基的清除率分別為41.72%、19.37%,本實驗中的0.02 mg/mL的青頭菌多酚對DPPH自由基的清除率為61.11%.相比較,青頭菌多酚對DPPH自由基的清除率要高很多,說明青頭菌多酚對DPPH自由基具有良好的清除效果.

圖6 DPPH自由基清除率測定結果

2.4.3 青頭菌多酚對總還原能力的測定結果

由圖7可知,青頭菌多酚溶液和Vc溶液的質量濃度增加,吸光度也增加,即青頭菌多酚提取液和Vc溶液的總還原能力是增強的,青頭菌多酚提取液的總還原能力略低于Vc溶液.

圖7 總還原能力測定結果

3 結 論

本實驗采用不同體積分數的乙醇提取青頭菌多酚.通過單因素和正交實驗優化提取方案,青頭菌多酚的最佳的提取方案為:乙醇體積分數30%,料液比1∶30,超聲時間40 min.在此方案下青頭菌多酚的提取率為9.81mg/g.通過進行·OH和DPPH自由基的清除以及總還原能力的實驗來研究青頭菌多酚的抗氧化活性.抗氧化實驗中,·OH和DPPH自由基的清除率與青頭菌多酚的質量濃度的相關性較好,質量濃度增加,清除率增加.在總還原能力的實驗中,青頭菌多酚的總還原能力與青頭菌多酚的質量濃度的相關性好,濃度增加,吸光度增加,還原能力增強.