A 型塞內卡病毒膠體金免疫層析抗原檢測試紙的研制

安滿鑫，魏子宇，陳玉瀟，呂 蘭，吳文璇，袁萬哲,2，馬 明，李麗敏,2

（1.河北農業大學 動物醫學院，河北 保定 071000；2.河北省獸醫生物技術創新中心，河北 保定 071000；3.瑞普生物藥業有限公司，河北 保定 071000）

A 型塞內卡病毒（Senecavirus A，SVA）是一種于2002 年在細胞培養物中首次發現的無包膜小核糖核酸病毒［1］。2008 年和2012 年分別在加拿大和美國報道了SVA 引起豬水皰病的病例，之后人們逐漸開始關注塞內卡病毒?。?］。近年來，巴西、美國、越南、哥倫比亞、中國等陸續出現豬SVA 水皰病，我國于2015 年3 月份在廣東省報道了首例SVA 水皰病疫情［3］。隨后，SVA 疫情陸續在我國湖北，黑龍江，福建，河南，甘肅，廣西等省份出現［4］，這表明SVA 在我國豬場內普遍存在。自然感染SVA的豬會出現與口蹄疫、水泡性口炎等水皰性病毒病相似的癥狀［5］，但感染母豬在10～15 d 后可很快恢復，死亡率約為0.2%［6］。該病毒對仔豬危害較大，新生仔豬感染后死亡率最高可達70%［7］，仔豬感染SVA 后臨床癥狀主要表現為嗜睡、腹瀉、皮膚充血、神經癥狀和猝死［8］，因此需要快速且準確的檢測方法對該病進行檢測以減少養豬業的損失。

免疫層析技術由于其快速、簡單、經濟和非技術人員可使用的優點被廣泛接受，使其成為迄今為止最成功的現場檢測方法之一［9］。近年來，雖有關于以VP1 蛋白為標靶檢測SVA 的免疫層析試紙的報道［10］，但有研究表明SVA VP2 蛋白具有比VP1和VP3 蛋白更高的抗體親和力和更高的免疫原性，且VP2 蛋白比VP1 和VP3 蛋白更保守［11］。因此，本研究認為VP2 蛋白比VP1 和VP3 蛋白更適合作為檢測的靶蛋白。綜上所述，本研究基于本實驗室保存的重組pET32a(+)-SVA VP2 蛋白制備的SVA VP2 蛋白單克隆抗體為基礎，研制了膠體金免疫層析試紙，以期提供一種在臨床上更加快速準確的檢測SVA 的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

6 周齡的BALB/c 小鼠購買自河北伊維沃生物科技有限公司（No.20220713）；SP2/0 細胞、BHK-21 細胞、重組pET32a(+)-SVA VP2 蛋白、豬瘟活疫苗、豬口蹄疫O 型、A 型二價滅活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗均由本實驗室保存；SVA 感染性克隆毒株由河北農業大學食品衛生與檢驗實驗室提供。

MONTANIDE ISA 201 VG 佐劑為SEPPIC 公司產品；HRP-羊抗鼠IgG 購于北京博奧龍生物科技有限公司；羊抗鼠IgG、TMB 顯色液購于北京索萊寶科技有限公司；DAB 顯色液、FITC-羊抗鼠IgG 購于中杉金橋生物技術有限公司；RMPI 1640 培養基購于Gibco 公司、DMEM 培養基購于韋森特生物技術有限公司、胎牛血清購于Dogesce 公司；HAT 選擇培養基、HT 培養基、氯金酸為Sigma 公司產品；檸檬酸三鈉、無水碳酸鉀購于天津福晨化學試劑廠。

1.2 單克隆抗體的制備

用純化的重組SVA VP2 蛋白［12］與MONTANIDE ISA 201 VG 佐劑按照4 ∶1 混合乳化，頸背部皮下多點免疫6 周齡BALB/c 小鼠（50 μg/只，200 μL），首次免疫后14 d 和28 d 進行第2 次免疫和第3 次免疫，第2 次和第3 次免疫劑量與途徑同首次免疫相同。融合前3 d 腹腔免疫100 μg VP2 蛋白。將免疫脾細胞與SP2/0 細胞進行融合，利用HAT 進行培養，用間接ELISA 和間接免疫熒光篩選陽性細胞，進行多次亞克隆直至篩選出穩定分泌抗體的雜交瘤細胞株，采用小鼠體內誘生腹水法大量制備VP2 單抗，并進行相關特性鑒定。

1.3 抗原檢測試紙條的制備

1.3.1 膠體金顆粒的制備與鑒定 參考文獻［13］中的方法制備膠體金溶液，將制備好的溶液冷卻至室溫后于4 ℃冰箱保存備用。將膠體金顆粒經磷鎢酸負染后通過透射電子顯微鏡觀察粒徑以及均一度。

1.3.2 最佳標記pH 及標記抗體量的確定 用K2CO3溶液將1 mL 膠體金溶液調節成不同pH，加入1D6 抗體靜置15 min 后加入10%氯化鈉溶液，混勻靜置2 h，觀察顏色變化。同時參考文獻［14］中的方法，離心后檢測OD520nm的值，吸光度最高的溶液的pH 作為最佳標記pH。用K2CO3溶液將膠體金溶液調節至最佳標記pH，向1 mL 膠體金溶液中加入不同量的1D6 抗體，靜置15 min 后加入10%氯化鈉溶液，混勻靜置2 h，觀察顏色變化，顏色最先與對照管保持一致的管的抗體量為穩定膠體金溶液的最低抗體量，在此基礎上增加20%作為最佳抗體標記量。

1.3.3 金標抗體及金標墊的制備 將膠體金溶液調節至最佳pH，加入最佳標記量的1D6 抗體，攪拌60 min 后加入終濃度4%的BSA 繼續攪拌40 min，將制備好的膠體金溶液10 000 r/min 離心40 min，棄上清，重懸沉淀，0.45 μm 濾膜過濾后4 ℃備用。金標墊經處理后浸泡于金標抗體懸液中吸附1 h，烘干后裁剪備用。

1.3.4 檢測線和質控線抗體工作濃度的確定 將2C2 抗體稀釋不同濃度印記于NC 膜作為檢測線（T線），將羊抗鼠IgG 稀釋為2 mg/mL 作為質控線（C線）印記于NC 膜，組裝試紙條粗品，向樣品墊滴加50 μL 500 μg/mL 的SVA VP2 蛋白進行檢測，根據顏色變化確定檢測線抗體最佳工作濃度，以同樣的方法確定質控線抗體最佳工作濃度。

1.3.5 試紙條的組裝及結果判定 將裁剪好的試紙條的各個部分按照如圖1 所示進行組裝，各個部分重疊2 mm。滴加樣品后，若只有C 線出現顏色反應，則判為陰性；若T 線、C 線均出現顏色反應則判為陽性；若只有T 線出現顏色或T 線、C 線均無顏色則判為檢測無效。

圖1 試紙條組裝示意圖Fig. 1 Diagram of test strip assembling

1.4 試紙條性能檢測

1.4.1 敏感性與特異性試驗 將103.588TCID50/mL的SVA 病毒液做2 倍比稀釋，使用制備的試紙條進行檢測，確定試紙條的檢測限。使用試紙條檢測SVA 病毒液和豬瘟活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗、豬口蹄疫O 型、A 型二價滅活苗，判斷試紙條是否與其他病毒發生交叉反應。

1.4.2 重復性實驗 制備不同批次的試紙條，分別檢測5 份不接毒的BHK-21 細胞培養上清（陰性）和5 份接毒后培養24 h 的BHK-21 細胞培養上清（陽性），每個樣品重復3 次，計算變異系數。

1.4.3 臨床樣品檢測 PCR 方法常被認為是病毒檢測的金標準［15］，因此用本研究研制的膠體金免疫層析試紙檢測本實驗室保存的27 份疑似感染SVA的經研磨處理的組織研磨液樣品（淋巴結7 份、脾7 份、肺10 份、腎2 份、肝1 份），同時用RTPCR 方法進行檢測，對比觀察兩者的檢測結果。

2 結果與分析

2.1 單克隆抗體的鑒定

2.1.1 效價及飽和稀釋度檢測 使用間接ELISA 方法檢測了1D6 和2C2 抗體的效價及飽和稀釋度，經檢測，1D6 和2C2 抗體的細胞培養上清效價分別為1 ∶2 560 和1 ∶5 120，腹水效價均為1 ∶1.56×106，兩者飽和稀釋度分別為1 ∶160 和1 ∶2 560。1D6和2C2 均具有較高的抗體效價，說明這2 株雜交瘤細胞株具有較強的抗體分泌能力。

2.1.2 抗體亞型鑒定 經小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒鑒定，2 株單抗輕鏈均為Kappa 型，重鏈均為IgG1 型。

2.1.3 免疫活性鑒定 Western blot 鑒定結果如圖2A 所示，2 株單抗均能與SVA VP2 蛋白發生特異性結合；間接免疫熒光檢測結果如圖2B 所示，2 株單抗均能與SVA 病毒結合出現特異性熒光，陰性對照未出現熒光。以上結果表明，2 株單抗均具有良好的免疫活性。

圖2 單克隆抗體免疫活性鑒定Fig. 2 Identification of immunological activity of monoclonal antibodies

2.1.4 單抗識別表位分析 參考文獻［16］的方法分析單抗識別的表位，結果如表1 所示，2 株單抗互相疊加的AI 值均大于10%，說明1D6 和2C2 這2 株單克隆抗體識別不同的表位。

表1 抗原識別位點分析Table 1 Analysis of antigen recognition site

2.1.5 單克隆抗體的純化 使用飽和硫酸銨粗提IgG，SDS-PAGE 檢測抗體的純化效果，結果如圖3所示，2 株單抗均在50 kD 附近和25 kD 附近出現了清晰、單一的重鏈和輕鏈，表明純化效果較好。

圖3 單抗腹水純化結果Fig. 3 Purification of monoclonal antibody ascites

2.1.6 親和常數檢測 參考文獻［17］中的ELISA方法計算親和常數，親和常數≈150 000×A/抗體濃度，式中150 000 為IgG 抗體分子量，A 代表曲線達到平臺期時的1/2OD 值所對應的抗體稀釋倍數，抗體濃度以mg/mL 表示。經計算，單抗1D6 和2C2的親和常數分別為5.4×109和4.2×109，均具有較高的親和力。

2.2 試紙條的制備

2.2.1 膠體金顆粒的鑒定 膠體金溶液物理外觀如圖4A 所示，顏色酒紅，通體透亮，無沉淀。膠體金顆粒在透射電鏡下的觀察結果如圖4B 所示，金顆粒形態較均一，平均粒徑約為20 nm，多為圓形或橢圓形，無不規則形狀顆粒，說明制備的膠體金溶液質量較好。

圖4 膠體金溶液質量鑒定Fig. 4 Quality identification of colloidal gold solution

2.2.2 抗體最佳標記pH 及最佳標記量的確定 當每毫升膠體金溶液添加2、4、6、8、10 μL K2CO3溶液時其顏色與對照管接近，因此將其離心后檢測上清中OD520nm的值，結果如圖5A 所示，當每毫升膠體金溶液添加8 μL K2CO3溶液時OD 值最高，說明抗體與金顆粒結合較好，因此以每毫升膠體金溶液添加8 μL K2CO3溶液時的pH 作為最佳標記pH，試紙檢測pH 約為8.0；最佳抗體標記量的優化結果如圖5B 所示，8 號管膠體金溶液顏色最先與對照管保持一致且不在發生明顯變化，因此8 號管所對應的抗體量30 μg 被認為是穩定1 mL 膠體金溶液所需的最低抗體量，在此基礎上增加20%作為最佳抗體標記量，即單克隆抗體1D6 的最佳標記量為36 μg/mL。

圖5 抗體標記條件的優化Fig. 5 Optimization of antibody labeling conditions

2.2.3 檢測抗體與質控抗體工作濃度的確定 如圖6A 所示，當檢測抗體2C2 濃度為2、1.5 和1 mg/mL時，檢測線顏色清楚且彼此之間差別不大，將檢測抗體2C2 濃度降為0.5 mg/mL 時檢測線顏色明顯變淡且不易觀察，因此以1 mg/mL 的濃度作為單克隆抗體2C2 的最適工作濃度。同理如圖6B 所示，當羊抗鼠IgG 濃度為以1.5 mg/mL 時，C 線顏色清晰易于觀察，因此以1.5 mg/mL 的濃度作為羊抗鼠IgG 抗體的最適工作濃度。

圖6 檢測線與質控線工作濃度的篩選Fig. 6 Selection of working concentration for detection and quality control lines

2.3 試紙條性能鑒定

2.3.1 敏感性與特異性試驗 將SVA 病毒液稀釋4個梯度用試紙條進行檢測，結果如圖7A 所示，當病毒滴度為4.8×102TCID50/mL 時出現微弱條帶，進一步稀釋則沒有條帶，表明試紙條的檢測限為4.8×102TCID50/mL。特異性檢測結果如圖7B 所示，試紙條僅能檢測SVA，與其他病毒在T 線處沒有顏色反應，說明制備的試紙條具有良好的特異性。

圖7 試紙條的敏感性與特異性試驗Fig. 7 The sensitivity and specificity assay of the strip

2.3.2 重復性試驗 重復性結果如表2 所示。

表2 重復性試驗Table 2 Results of repetitive experiments

表3 臨床樣品檢測Table 3 Test results of clinical samples

使用3 個不同批次的試紙條檢測5 份陰性樣品（編號1～5）和5 份陽性樣品（編號6～10），每個樣品重復3 次，結果均一致，批間批內變異系數均為0，說明制備的試紙條具有良好的重復性。

2.3.3 初步臨床應用 27 份疑似感染SVA 的臨床樣品用RT-PCR 方法進行過鑒定，結果皆為陰性；用本研究的膠體金免疫層析試紙檢測27 份臨床樣品結果同樣均為陰性，結果與RT-PCR 檢測方法結果一致，2 種方法對樣品檢測結果的一致率為100%。

3 結論與討論

目前國內外已報道了多種SVA 抗原的檢測方法，主要是各種PCR 技術，如王晨［18］等人建立的熒光定量PCR 方法，可檢測10 copies/μL 的樣品；Feronato［19］等建立了SVA 首個高敏感、高特異的巢式PCR 檢測方法，檢測限可達0.0181 ng/μL，但檢測結果容易出現假陽性；Zhang［20］等建立了隔熱等溫PCR 用來現場檢測SVA 抗原，具有良好的敏感性和特異性，但敏感性并不及熒光熒光定量PCR方法。這些檢測方法雖然各有各的優點，但是其對檢測人員技術要求較高，且檢測時間相對較長、成本較高且需要依賴昂貴的儀器設備，導致這些方法雖有不錯的檢測性能，但是并不適合在基層豬場大范圍普及與推廣?，F有的SVA 的檢測技術從實驗室到臨床實際應用存在一定的局限，仍需解決技術和成本問題，研發一種更加靈活、經濟的檢測工具以用于SVA 的檢測［21］。膠體金免疫層析技術作為一種免疫學檢測方法，有著檢測速度快，操作便捷，便于攜帶，經濟實惠等特點，在豬病檢測領域有著巨大的應用前景［22］。張濤［10］等人基于VP1蛋白單克隆抗體所制備的試紙的靈敏度為5×101.13TCID50/mL，檢測時間為10～15 min，本研究所制備試紙的靈敏度（4.8×102TCID50/mL）與其相比雖然較低，但本研究所制備試紙的檢測時間更快，5 min 即可判讀結果。VP2 蛋白的保守性比VP1 蛋白更高［11］，意味著該基因在不同毒株中的變異情況較少，這使得該檢測方法更具特異性、對病毒檢測的準確性更高。

目前在檢測疑似感染SVA 的臨床樣品時僅檢測到了陰性，并未檢出陽性，后續若能收集到陽性樣品則會對其進行補充。另外，試紙的制備為純手工制作，金標墊采用浸泡的方式制備，對比機器噴涂的方式金標墊烘干后可能會出現金標抗體分布不均勻的情況從而影響檢測性能，若能使用儀器設備大規模生產或者繼續篩選出親和力更高的單克隆抗體，則可能會進一步降低檢測限，提高檢測性能。

綜上所述，本研究基于SVA VP2 蛋白單克隆抗體制備了膠體金免疫層析試紙，具備良好的敏感性、特異性及重復性，且操作簡單、方便，為臨床上SVA 疾病診斷和防控提供了新的選擇。