基于miR-181c-3p/STAT3通路探討增液潤燥湯治療干燥綜合征作用機制

楊瑞祥,周 全,陳慧敏,李紀高

(1.河南中醫藥大學第一臨床醫學院,河南 鄭州 450046;2.河南中醫藥大學第一附屬醫院,河南 鄭州 450099)

干燥綜合征(Sjogren’s syndrome,SS)是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病,其主要特征是腺體上皮細胞炎癥、損傷及破壞,導致腺體分泌減少或缺失[1]。目前,SS的病因和發病機制尚未完全明確,現階段認為炎癥反應和免疫系統異常與其發病密切相關[2]。西醫對于SS的治療主要采用免疫抑制和替代療法,但存在臨床癥狀改善不明顯、藥物不耐受、長期服藥依從性差等問題。既往研究表明,信號轉導與轉錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)信號通路直接參與SS的發病[3]。miR-181c-3p是miR-181c表達出的一個成熟序列,miR-181c模擬物的外源表達可直靶向抑制同源異形盒基因A1(Homologous heteromorphic box gene A1,HOXA1)及其下游分子STAT3的表達,抑制T細胞的活化,減輕免疫炎癥[4-5]。

中醫根據臨床癥候特點,將SS歸屬于“燥證”“燥痹”等范疇,其病因病機復雜,涉及肺、脾、肝、腎等多個臟腑[6-7]。增液潤燥湯是我科治療SS的臨床經驗方,具有益氣滋陰、生津潤燥、祛瘀通絡的功效。本課題組前期研究發現,低、中、高劑量的增液潤燥湯干預SS模型小鼠,均能夠顯著降低炎癥因子白介素(IL)-1β、IL-17的表達水平[8-9],但對于其具體的上下游通路尚不明確。因此,本研究通過建立SS模型小鼠,觀察各組小鼠的相關指標,從STAT3信號通路及miR-181c-3p表達的角度探討增液潤燥湯對SS的干預機制,以期為增液潤燥湯防治SS的進一步研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物:選取SPF級BALB/c雄性小鼠21只,6～8周齡,體重(22.3±2.1)g,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,合格編號:SCXK(京)2019-0008。實驗過程中無動物死亡。本實驗已通過康泰醫學檢驗服務河北有限公司實驗動物倫理委員會審查,批準號:MDL20220602-01。

1.1.2 實驗藥物與試劑:增液潤燥湯(組方為北沙參、天冬、桔梗各15 g,紫菀、知母、烏梅、桃仁各10 g,制附子、炙甘草各6 g),由河南中醫藥大學第一附屬醫院門診顆粒藥房提供;白芍總苷膠囊(批號210813,規格0.3 g)。免疫球蛋白G(IgG)檢測試劑盒(貨號:CEA544Mu,武漢優爾生商貿有限公司);Citrate檸檬酸鹽緩沖液、PBS磷酸鹽緩沖液、蘇木素染液(貨號分別為ZLI-9064、ZLI-9061、ZLI-9609,北京中杉金橋生物技術有限公司);HOXA1抗體、STAT3抗體、磷酸化STAT3(p-STAT3)抗體、白細胞介素17A(IL-17A)抗體、叉頭盒蛋白P3(Foxp3)抗體、β-actin抗體(貨號分別為DF3187、AF6294、AF3293、DF6127、AF6544,美國Affinity Biosciences公司);STAT3通路激活劑[10](Colivelin,美國MCE公司);miR-181c-3p激動劑(湖州河馬生物科技有限公司)。

1.1.3 實驗儀器:酶標儀(美國Bio-rad公司);全自動脫水機、石蠟切片機、加熱石蠟包埋系統(德國Leica公司);臺式高速冷凍離心機、分光光度計(美國Thermo Fisher公司);熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司);微量分光光度計(杭州優米儀器有限公司);電泳儀(北京百晶生物技術有限公司);低溫離心機(美國Sigma公司);流式細胞儀(常州必達科生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 SS模型小鼠的建立:免疫誘導法制備SS模型小鼠[11]。另取同種小鼠頜下腺組織,剔除淋巴結,放入PBS緩沖液中,在4 ℃條件下勻速離心5 min,充分勻漿,取上清液,檢測蛋白濃度,將蛋白與弗氏完全佐劑乳化,得到質量分數為400 mg/L的抗原溶液。隨機選取3只小鼠作為對照組,除對照組外,其余小鼠第0、14天經兩側腹股溝皮下注射抗原溶液共0.1 ml,首次免疫后第2、7天時,給予以上小鼠腹腔注射0.05 ml百白破聯合疫苗加強免疫。

1.2.2 分組和給藥:將造模成功的BALB/c小鼠隨機分為模型組、白芍總苷組、增液潤燥湯低劑量組、增液潤燥湯高劑量組、增液潤燥湯高劑量+Colivelin組、增液潤燥湯高劑量+miR-181c-3p激動劑組,每組3只。另取3只作為對照組。從造模完成后即第15天開始給藥,增液潤燥湯低、高劑量組分別給予4、12 mg/g增液潤燥湯灌胃,白芍總苷組給予0.234 mg/g白芍總苷灌胃,模型組、對照組給予等體積蒸餾水灌胃,連續給藥60 d;增液潤燥湯高劑量+Colivelin組給予1 mg/kg的Colivelin腹腔注射,2次/周,增液潤燥湯高劑量+miR-181c-3p激動劑組給予miR-181c-3p激動劑腮腺原位多點注射,2次/周,持續60 d。給藥后第60天麻醉狀態下處死小鼠,進行后續處理。

1.3 觀察指標

1.3.1 飲水量:每日于固定時間添加水并記錄,次日于相同時間觀察容器內水剩余量,兩次之間的差即為小鼠每日的飲水量,連續測量60 d。

1.3.2 唾液流率:小鼠麻醉后肌肉注射毛果蕓香堿,15 min后小鼠頭向下將毛細管置于口底,收集唾液20 min;稱量收集唾液前后的毛細管重量,計算唾液量和唾液流率。唾液流率(mg/min)=唾液量(mg)/20 min。

1.3.3 頜下腺臟器指數:各組小鼠于給藥后第60天稱量體重后麻醉狀態下處死,低溫摘取雙側頜下腺稱重,計算臟器指數。頜下腺臟器指數(mg/g)=雙側頜下腺重量(mg)/小鼠體重(g)。

1.3.4 紅細胞沉降率:采用自動血沉分析儀檢測增液潤燥湯高劑量組、增液潤燥湯高劑量+miR-181c-3p激動劑組小鼠的紅細胞沉降率。

1.3.5 血清IgG水平:收集小鼠外周血液樣本,分離血清,參照IgG檢測試劑盒指導步驟,采用ELISA法檢測增液潤燥湯高劑量組、增液潤燥湯高劑量+miR-181c-3p激動劑組小鼠的血清IgG水平。

1.3.6 頜下腺組織病理學觀察:取石蠟包埋的小鼠頜下腺組織,切片后進行脫蠟,行蘇木素-伊紅(HE)染色后脫水、透明、封片。顯微鏡下拍照,觀察頜下腺組織病理學變化。

1.3.7 RT-qPCR法檢測小鼠頜下腺miR-181c-3p的表達:使用Trizol法行小鼠頜下腺組織樣本總RNA提取,微量分光光度計測定純度后使用試劑盒進行逆轉錄合成cDNA,按照以下條件反應上機進行PCR擴增,反應程序:預變性95 ℃、10 min,變性95 ℃、10 s,退火58 ℃、20 s,延伸72 ℃、20 s,共循環40次。實驗得到每個基因的Ct值,以β-actin為內參基因,采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。引物序列:miR-181c-3p-F:5’-TCGGCAGGACCATCGACCGTTGAG-3’,miR-181c-3p-R:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGT-3’。

1.3.8 Western blot法檢測小鼠頜下腺HOXA1、STAT3、p-STAT3、IL-17和Foxp3的表達:取小鼠頜下腺組織,加液氮進行勻漿,加入1 ml的PBS清洗后,估計樣品體積,加入5倍體積裂解液,混勻;裂解后以 4 ℃、12000 r/min離心15 min,收集上清;用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度;蛋白上樣Buffer將蛋白定量為5 mg/ml,-20 ℃保存備用,避免反復凍融;配備SDS-PAGE凝膠,分離提取蛋白并用PVDF膜轉膜;小心取出轉移膜置于封閉液中封閉1 h;加入一抗后4 ℃下反應過夜;洗膜后加入二抗室溫、避光孵育60 min;采用ECL法顯色曝光、顯影沖洗,使用化學發光成像系統成像分析。以β-actin為各蛋白內參,計算目的蛋白的相對表達水平。

1.3.9 流式細胞儀檢測Th17/Treg細胞含量:采用流式細胞術測定外周血輔助性T細胞17(Th17)、調節性T淋巴細胞(Treg)含量,嚴格按照說明書進行檢測。

2 結 果

2.1 各組小鼠日飲水量比較 見表1。給藥前,各組小鼠日飲水量無明顯變化,差異無統計學意義(P>0.05)。給藥60 d,與模型組比較,各組小鼠日飲水量明顯下降(均P<0.05);與增液潤燥湯高劑量組比較,增液潤燥湯高劑量+Colivelin組小鼠日飲水量明顯升高,增液潤燥湯高劑量+miR-181c-3p激動劑組日飲水量明顯下降(均P<0.05)。

表1 各組小鼠日飲水量比較(ml)

2.2 各組小鼠唾液流率比較 見表2。與模型組比較,各組小鼠唾液流率明顯升高(均P<0.05);與增液潤燥湯高劑量組比較,增液潤燥湯高劑量+Colivelin組唾液流率無明顯變化(P>0.05),增液潤燥湯高劑量+miR-181c-3p激動劑組唾液流率顯著升高(P<0.05)。

表2 各組小鼠唾液流率比較(mg/min)

2.3 各組小鼠頜下腺指數比較 見表3。與模型組比較,對照組、增液潤燥湯高劑量組、增液潤燥湯高劑量+miR-181c-3p激動劑組小鼠頜下腺指數明顯增高(均P<0.05)。

表3 各組小鼠頜下腺指數比較(mg/g)

2.4 各組小鼠頜下腺組織病理變化 模型組小鼠腺泡大小不等,淋巴細胞浸潤明顯,形成較多浸潤灶;對照組結構正常,腺泡大小均勻,排列整齊,未見淋巴細胞浸潤;白芍總苷組、增液潤燥湯低劑量組、增液潤燥湯高劑量組腺泡結構基本正常,淋巴細胞浸潤數量較模型組有不同程度減少;增液潤燥湯高劑量+Colivelin組淋巴細胞浸潤數量高于增液潤燥湯高劑量組。見圖1。

圖1 各組小鼠頜下腺組織病理變化(HE染色,×400)

2.5 各組小鼠紅細胞沉降率、IgG水平比較 見表4。與增液潤燥湯高劑量組比較,增液潤燥湯高劑量+miR-181c-3p激動劑組紅細胞沉降率、血清IgG水平明顯下降(均P<0.05)。

表4 各組小鼠紅細胞沉降率、IgG表達水平比較

2.6 各組小鼠頜下腺HOXA1、STAT3、p-STAT3、IL-17和Foxp3蛋白相對表達量比較 與模型組比較,各組HOXA1、STAT3、p-STAT3、IL-17表達明顯下調,Foxp3表達明顯上調(均P<0.05);與增液潤燥湯高劑量組比較,增液潤燥湯高劑量+miR-181c-3p激動劑組HOXA1、STAT3、p-STAT3、IL-17的表達明顯下調,Foxp3表達明顯上調(均P<0.05)。見表5(圖2)。

A:模型組;B:對照組;C:白芍總苷組;D:增液潤燥湯低劑量組;E:增液潤燥湯高劑量組;F:增液潤燥湯高劑量+miR-181c-3p激動劑組

表5 各組小鼠頜下腺HOXA1、STAT3、p-STAT3、IL-17和Foxp3蛋白相對表達量比較

2.7 各組小鼠頜下腺miR-181c-3p表達比較 見表6。與模型組比較,各組miR-181c-3p表達明顯上調(均P<0.05);與增液潤燥湯高劑量組比較,增液潤燥湯高劑量+miR-181c-3p激動劑組miR-181c-3p表達明顯上調(P<0.05)。

表6 各組小鼠頜下腺miR-181c-3p表達比較

2.8 各組小鼠外周血T淋巴細胞亞群比較 見表7。與模型組比較,各組Treg細胞比例明顯上升,Th17細胞比例、Th17/Treg明顯下降(均P<0.05);與增液潤燥湯高劑量組比較,增液潤燥湯高劑量+Colivelin組Treg細胞比例明顯下降,Th17細胞比例、Th17/Treg明顯上升(均P<0.05);與增液潤燥湯高劑量組比較,增液潤燥湯高劑量+miR-181c-3p激動劑組Treg細胞比例明顯上升,Th17細胞比例、Th17/Treg明顯下降(均P<0.05)。

表7 各組小鼠外周血T淋巴細胞亞群比較

3 討 論

中醫古籍中雖無SS病名的記載,但早在《黃帝內經》中即有“燥勝則干”“燥者濡之”的論述,其病機多以陰虛為本,可夾雜燥毒、瘀血等邪氣[12]。中醫藥可通過多途徑發揮整體調節作用,在本病的治療中具有獨特的優勢[13]。增液潤燥湯針對本病陰虛夾雜燥毒、瘀血等的病理特點,消補兼施,標本兼顧,潤燥得宜,行津有法,共奏津液滋潤濡養之功。方中北沙參、天冬性味甘寒,共奏滋養肺胃、養陰生津之功;知母、烏梅清熱養陰生津;紫菀潤肺化痰,開肺布津,與桔梗配伍,以增強宣發肺氣之功;附子溫腎化氣,陽中求陰;久病必瘀,方用桃仁活血行瘀,暢通氣血運行,使津液得以運化全身。諸藥合用,共奏滋陰潤燥、補氣生津、祛瘀通絡之功,則燥證自愈。

miRNA是一類長度約22個核苷酸的單鏈RNA分子,不編碼蛋白質,但調節基因表達[14]。在機體的多種生理及病理過程中,尤其是在自身免疫性疾病中,miRNA起著關鍵作用[15]。研究表明,部分miRNA可以調節免疫細胞發育和免疫反應[16]。miR-181c是一種新發現的免疫細胞活化負調節因子,當提高細胞中miR-181c表達時,可以降低促炎細胞因子的表達水平[17];miR-181c-3p是其表達出的一個成熟序列,表達水平與血清IL-17水平呈負相關,是免疫系統疾病的新型潛在治療靶點[18]。本研究結果顯示,與模型組比較,對照組及各給藥組小鼠頜下腺miR-181c-3p的表達均顯著上調,且與增液潤燥湯高劑量組比較,增液潤燥湯高劑量+miR-181c-3p激動劑組紅細胞沉降率與血清IgG水平明顯下降,表明增液潤燥湯可能通過調節miR-181c-3p表達發揮對SS的治療作用。

T淋巴細胞亞群在自身免疫性疾病及炎癥性疾病中發揮著重要作用[19]。Th17細胞由初始CD4 T淋巴細胞分化而來,是典型的促炎細胞,Treg細胞功能與其相反,具有抗炎和免疫耐受性[20]。在生理條件下,機體Th17/Treg細胞保持動態平衡,當平衡被打破時,Th17細胞過度增殖,則會使IL-17等炎性細胞因子過度表達,引發炎癥反應[21]。研究表明,Th17/Treg細胞平衡向促炎Th17軸的轉變會加劇原發性干燥綜合征和其他自身免疫性疾病,因此調節Th17/Treg細胞平衡被認為是調控SS免疫炎癥的關鍵[22-23]。Foxp3是Treg細胞的標志性轉錄因子,Foxp3在維持Treg細胞的分化成熟及功能中發揮著重要的作用[24]。在前期研究中,本課題組證實增液潤燥湯治療SS有著良好的療效,尤其是在降低炎性指標等方面顯示出了一定的優勢[8-9]。在本研究中,進一步觀察到增液潤燥湯可上調Foxp3的表達,使Th17/Treg細胞平衡向Treg方向偏移,從而改善SS臨床癥狀。

STAT家族有7個成員,其中STAT3由約750個氨基酸組成,在控制炎癥和調節免疫細胞活化中具有重要的信號轉導作用[25]。STAT3磷酸化的過度增強,可以調節炎性細胞因子的表達,促進Th17細胞的增殖以及免疫球蛋白的產生,并抑制Treg細胞,誘發免疫炎癥[26]。在類風濕關節炎、潰瘍性結腸炎等免疫性疾病的發病中STAT3具有關鍵作用,能夠激活T淋巴細胞,因而降低STAT3的磷酸化可以對其發揮治療作用,且STAT3通路已被證明可調節SS的發病[27]。本研究發現,增液潤燥湯可降低STAT3的磷酸化,調節Th17/Treg細胞平衡,從而改善SS臨床癥狀,發揮治療作用。表明增液潤燥湯可能是通過抑制STAT3通路發揮治療作用。Zhao等[28]相關研究證實miR-181c-3p通過抑制轉錄因子HOXA1的表達下調STAT3;結合本研究相關結果,提示增液潤燥湯可以上調SS模型小鼠頜下腺中miR-181c-3p表達水平,下調其直接靶點HOXA1的表達,抑制STAT3磷酸化,調節Th17/Treg細胞失衡,減少IL-17等炎性因子的釋放,從而減少頜下腺淋巴細胞浸潤,發揮治療作用。

綜上所述,增液潤燥湯可以通過上調SS模型小鼠頜下腺中miR-181c-3p表達,抑制STAT3活化,從而改善Th17/Treg細胞失衡,糾正免疫炎癥失調狀態。