磷對甘藍型油菜幼苗鎘吸收及土壤酶活性的影響

張蓓蓓, 王薪琪, 李卓晴, 吳嘉儀, 吳家萌, 謝華,陳媛, 杜輝輝, 劉孝利, 雷鳴*

(1.湖南農業大學 環境與生態學院,湖南長沙 410128;2.湖南省郴州生態環境監測中心,湖南郴州 424108)

隨著工業的快速發展,化肥、農藥的濫用使重金屬大量積存于農田中,其中鎘因影響范圍廣、污染程度重,成為制約我國農田安全利用的主要重金屬污染物[1]。鎘通過作物吸收進入食物鏈,會對人體健康產生極大的危害[2]。因此,作物吸收積累鎘的規律是一個值得關注的問題。

油菜是我國大宗的油料作物,具有產油、提供生物質能源、觀賞等作用。同時,油菜因生物量大,鎘吸附能力強而被認為是修復鎘污染土壤的良好選擇[3]。研究表明,油菜對鎘的富集能力受施加的無機肥的影響[4]。磷是影響作物生長發育的重要養分元素,施磷能為油菜提供充足的養分,促進油菜生長,從而影響油菜對鎘的吸收。鎘脅迫下施用納米羥基磷灰石和鈣鎂磷肥減弱了鎘對油菜生長發育的影響,通過提高油菜的株高、根長、葉片數目和生物量,使油菜的鎘積累量增加[5]。施加磷肥會通過影響土壤有效鎘含量來影響植物吸收積累鎘,如施用磷酸氫二銨等,可使土壤pH降低,從而增加有效鎘含量[6];施用磷酸氫鈣等,可增加土壤對鎘的吸附,使有效鎘含量降低[7]。土壤酶參與土壤物質的循環過程,對植物生長具有重要意義。崔紅標等[8]的研究表明施用羥基磷灰石增加了脲酶活性,降低了酸性磷酸酶活性。Wu等[9]研究表明,在鎘污染土壤施用磷酸鈣顯著增加了土壤的蔗糖酶和脲酶活性,降低了土壤的過氧化氫酶的活性,表明土壤酶活性對磷有顯著響應。油菜對鎘的吸收積累受多種因素影響[10],研究施磷對有效鎘和酶活性的影響對理解油菜吸收積累鎘的機制具有重要意義。

本研究結合土壤鎘形態、磷形態和土壤酶活性的變化,研究磷添加對油菜吸收積累鎘的影響,為鎘污染農田的修復與治理提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以甘藍型油菜‘油研52’為材料,在湖南農業大學環境與生態學院光照培養室育苗后移栽。育苗環境為:相對濕度70%,溫度22℃,光照強度300～320 μmol/(m2·s),光周期為光照14 h/黑暗10 h,所用營養液為改良的霍格蘭營養液。

供試土壤為湖南農業大學耘園基地的旱作農田耕作層(0～20 cm)土壤。土壤取回后剔除石子和枯葉等異物,自然風干,過10目尼龍篩,混勻備用。

1.2 試驗設置

實驗設置了3個鎘含量和3個磷含量的交互作用模式,共9個處理,每個處理設置6個平行。使用上口直徑10.6 cm,下口直徑8.5 cm,高9.5 cm的聚乙烯花盆,每盆裝5 kg土樣,以CdCl2·5H2O溶液的方式向土壤中加鎘,使土壤鎘含量達到0.3、3.0和5.0 mg/kg,穩定30天(穩定后測定各處理土壤總鎘含量,其值為0.28±0.05、2.82±0.12、4.78±0.25 mg/kg)。穩定后,以KH2PO4溶液形式向土壤中加磷,含量為5.0、75.0、150.0 mg/kg(引入的鉀以KCl進行平衡)。氮肥和鉀肥以(NH4)2SO4、KCl溶液形式于移栽前一周加入。

油菜長出3～4片真葉、高度約6～10 cm時,選擇大小一致的幼苗進行移栽,每盆移栽1株,油菜置于自然環境中生長至抽薹期進行收獲。

1.3 樣品采集與測定

采用抖土法收集根際土壤,置于陰涼的地方風干。分離油菜和土壤后,于油菜根、莖、葉連接部位剪下,依次使用流動的自來水、超純水沖洗。洗凈的植物樣品放入烘箱110 ℃殺青30 min,65 ℃烘至恒重用于后續實驗,油菜生物量以干重表示。

1.3.1 油菜各部位鎘含量測定

油菜各部位樣品鎘含量采用硝酸-高氯酸(體積比4∶1)濕法消解,以國家標準物質(GBW—10049)和空白進行質量控制,用電感耦合等離子質譜(ICP-MS,NexIONTM 350X,PerkinElmer,MA,USA)測定消解液鎘含量[10]。

1.3.2 油菜根際羧酸釋放量測定

室內和田間實驗的數據表明,植物葉片錳含量可以反映根際羧酸鹽的釋放量[11]。油菜葉片錳含量采用硝酸-高氯酸(體積比4∶1)濕法消解,以國家標準物質(GBW—10049)和空白進行質量控制,用電感耦合等離子質譜(ICP-MS,NexIONTM 350X,PerkinElmer,MA,USA)測定消解液錳含量[10]。

1.3.3 土壤pH和有效鎘含量測定

土壤pH采用pH計(SevenCompactS220,梅特勒-托利多)測定,土水比為1∶2.5(w∶v)[12]。土壤有效鎘(DTPA-Cd)采用DTPA提取劑浸提,電感耦合等離子質譜(ICP-MS,NexIONTM 350X,PerkinElmer,MA,USA)測定提取液鎘濃度[10]。

1.3.4 土壤不同磷形態含量測定

采用Deluca等[13]提出的BBP(Biologically-based P extraction approach)法測定生物有效磷(Bioavailable-P)、活性無機磷(Exchangeable-P)、活性有機磷(Hydrolysable-P)和礦物質磷(Ligand-P)。其中,Bioavailable-P用10 mmol/L CaCl2溶液提取;Exchangeable-P用10 mmol/L檸檬酸提取;Hydrolysable-P用磷酸酶和植酸酶的酶混合溶液提取;Ligand-P用1.0 mmol/L HCl溶液提取。最后使用孔雀石綠的方法在630 nm的波長下用酶標儀(TECANSpark 20M)測定提取液的吸光度值,計算各種形態的磷含量。

1.3.5 土壤酶活性測定

采用對硝基苯酚比色法測定β-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase,BG)活性。β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-1,4-N-acetylglucosaminidase,NAG)活性利用硝基苯酚比色法測定,亮氨酸氨基肽酶(leucine aminopeptidase,LAP)活性使用對硝基苯胺比色法測定?；诹姿岜蕉c比色法測定酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,采用鉬酸銨顯色法測定植酸酶(phytase)活性。具體測定步驟均按照蘇州科銘生物技術有限公司提供的相應酶活性試劑盒說明書操作,樣品使用多功能酶標儀(TECAN-Spark 20M)比色測定。

1.3.6 油菜各部位鎘積累量的計算

油菜各部位鎘積累量=各部位鎘含量×生物量。

1.4 數據處理與分析

數據使用Excel 2019整理,IBM SPSS Statistics 26進行統計分析。本文中所有數據采用平均值±標準偏差(n=6),并用單因素方差分析(ANOVA)和鄧肯顯著性差異檢驗,用Origin進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 磷添加對油菜各部位生物量的影響

鎘含量為0.3 mg/kg時,磷添加對油菜生物量的影響不顯著。鎘含量為3.0 mg/kg和5.0 mg/kg時,油菜植株生物量隨著磷添加量的增加而增加,磷添加量由5.0 mg/kg增加至150.0 mg/kg時,油菜植株平均生物量分別由1.59 g增加至2.68 g,由1.61 g增加至2.03 g(圖1)。

2.2 磷添加對油菜各部位鎘含量的影響

由圖2a～c可知,土壤鎘含量為0.3、3.0 mg/kg時,油菜各組織鎘含量隨著磷濃度的增加而呈增加的趨勢,土壤鎘含量為5.0 mg/kg時,油菜各組織鎘含量隨著磷濃度的增加而呈減少的趨勢。隨著磷含量的增加,鎘含量為0.3 mg/kg時,油菜根、莖和葉片的平均鎘含量分別由0.73、2.53和3.12 mg/kg增加至0.85、2.88和3.62 mg/kg;鎘含量為3.0 mg/kg時,油菜根、莖和葉片的平均鎘含量分別由13.80、42.20和77.14 mg/kg增加至17.02、57.12和93.69 mg/kg。鎘含量為5.0 mg/kg時,與5.0 mg/kg磷添加量相比,75.0 mg/kg和150.0 mg/kg的磷添加分別使根部鎘含量降低了9.2%和11.8%,莖部鎘含量降低了13.5%和21.2%,葉片鎘含量降低了6.2%和8.3%。

2.3 磷添加對油菜各部位鎘積累量的影響

由圖3可知,磷添加顯著增加了油菜根和葉片的鎘積累量,而莖鎘積累量僅在鎘含量為3.0 mg/kg時發生顯著變化。土壤鎘含量為0.3、3.0、5.0 mg/kg時,油菜植株鎘積累量隨著磷添加量的增加而呈增加趨勢。150.0 mg/kg磷添加時,油菜的鎘積累量分別為4.75、164.00、165.62微克/盆。

圖2 磷添加對油菜根(a)、莖(b)、葉(c)鎘含量的影響Figure 2 Effect of P addition on Cd content of rapeseed root (a), stem (b), and leaf (c)注:不同的小寫字母表示在P<0.05的水平上差異顯著,下同。

2.4 磷添加對油菜根際pH和有效鎘含量的影響

圖4a反映了外源磷添加量對不同鎘含量土壤pH的影響。在土壤鎘含量為0.3、3.0和5.0 mg/kg時,與5.0 mg/kg磷添加相比,150.0 mg/kg磷添加分別使土壤pH降低了0.10、0.11和0.06個單位。

如圖4b所示,土壤鎘含量為0.3 mg/kg時,磷添加對土壤有效鎘含量無顯著影響。當土壤鎘含量為3.0和5.0 mg/kg時,與5.0 mg/kg的磷添加量相比,75.0 mg/kg的磷添加使土壤有效鎘降低了9.5%和11.4%,150.0 mg/kg的磷添加使土壤有效鎘含量降低了7.5%和15.2%。

圖3 磷添加對油菜根(a)、莖(b)、葉(c)和油菜植株(d)鎘積累量的影響Figure 3 Effect of P addition on Cd accumulation of rapeseed root (a), stem (b), leaf (c) and the plant (d)

圖4 磷添加對pH(a)和有效鎘含量(b)的影響Figure 4 Effect of P addition on pH (a) and DTPA-Cd (b) of soil

2.5 磷添加對油菜根際磷形態的影響

在不同鎘和磷處理中土壤磷含量大小的順序依次為Ligand-P>Exchangeable-P>Hydrolysable-P>Bioavailable-P(圖5)。土壤鎘含量為0.3 mg/kg時,磷添加量由5.0 mg/kg增加至150.0 mg/kg時,土壤Bioavailable-P、Exchangeable-P、Hydrolysable-P的含量分別由1.08、50.80、1.48 mg/kg增加至1.38、53.51、1.87 mg/kg,Ligand-P的濃度由16 257.00 mg/kg減少至13 503.20 mg/kg;土壤鎘含量為3.0 mg/kg時,與5.0 mg/kg磷添加相比,150.0 mg/kg磷添加量使Bioavailable-P、Exchangeable-P、Hydrolysable-P含量增加了48.7%、4.8%、9.4%,Ligand-P含量減少了10.2%;土壤鎘含量為5.0 mg/kg時,與5.0 mg/kg磷添加相比,磷添加量為150.0 mg/kg時土壤的Bioavailable-P、Exchangeable-P、Hydrolysable-P含量增加了35.9%、5.7%、8.9%,Ligand-P的含量減少了10.3%。

圖5 磷添加對土壤生物有效磷(a)、活性無機磷(b)、活性有機磷(c)和礦物質磷(d)的影響Figure 5 Effect of P addition on soil Bioavailable-P (a), Exchangeable-P (b), Hydrolysable-P (c) and Ligand-P (d)

2.6 磷添加對油菜根系釋放羧酸的影響

圖6表明磷添加降低了油菜葉片Mn含量。土壤鎘含量為0.3、3.0、5.0 mg/kg時,與5.0 mg/kg磷添加量相比,75.0 mg/kg外源磷添加時油菜葉片Mn含量分別降低了5.3%、7.2%、10.8%,相比外源磷添加為150.0 mg/kg時分別降低了10.7%、20.2%、10.0%。

2.7 磷添加對油菜根際酶活性的影響

圖7為磷添加對油菜根際土壤酶活性的影響。土壤鎘含量為0.3 mg/kg時,與外源磷添加量為5.0 mg/kg相比,外源磷添加量為150.0 mg/kg時, NAG和UE的酶活性表現為增加,增幅分別為2.4%、49.12%和20.5%(圖7b、圖7e);ACP、Phytase和ALP的酶活性表現為降低,降幅分別為11.5%、17.5%、11.8%(圖7f～h)。土壤鎘含量為3.0 mg/kg時,磷添加量的增加顯著提高了NAG、UE的酶活性,顯著降低了BG、ACP和ALP的活性。土壤鎘含量為5.0 mg/kg時,外源磷的施入,提高了BG(1 626.11～2 038.82 nmol/g·h)、NAG(309.50～420.97 nmol/g·h)、LAP(31.69～33.60 nmol/g·h)、UE(165.05～202.79 nmol/g·h)的活性,但是降低了ACP(1 268.75～1 385.06 nmol/g·h)、ALP(211.45～229.28 nmol/g·h)的活性。

圖6 不同鎘、磷添加時油菜葉片錳的變化Figure 6 Changes of Mn in leaves of Brassica napuswith different Cd and P addition

圖7 不同鎘、磷添加時油菜根際酶活性的變化Figure 7 Changes of enzyme activity in rhizosphere of Brassica napus with different Cd and P addition注:a.BG,β-葡萄糖苷酶;b.NAG,β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶;c.LAP,亮氨酸氨基肽酶;d.NAG+LAP,β-1,4-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶+亮氨酸氨基肽酶;e.UE,脲酶;f.ACP,酸性磷酸酶;g.為Phytase,植酸酶;h.ALP,堿性磷酸酶。

3 討 論

本研究表明,鎘含量為3.0和5.0 mg/kg時,油菜生物量隨著磷的增加而增加(圖1)。施磷對其他作物也有相同的影響,趙羽楠等[14]的研究表明,在50.0 mg/kg鎘脅迫下,磷添加顯著增加結縷草葉片的生物量。Carvalho Bertoli等[15]的研究也表明施磷能增加鎘脅迫環境下的番茄果實的生物量。生物量是植物生長狀況最直接的體現,說明鎘含量較高時磷對促進油菜生長有重要的意義[16]。鎘含量為0.3 mg/kg和3.0 mg/kg時,油菜各部位鎘含量隨施磷量的增加而顯著增加(圖2、圖3)?；粞蟮萚17]和劉文菊等[18]的研究結果表明水稻地上部分鎘含量隨著磷添加量的增加而增加,認為這是由于在一定的鎘含量下,磷添加促進作物根系發育,同時磷添加提高了植物的光合速率,從而促進作物對鎘的吸收。但是土壤鎘含量為5.0 mg/kg時,油菜各部位鎘含量隨著施磷量的增加而減少,鎘積累量隨著施磷量的增加而增加(圖2c、圖3c),這一現象可能是稀釋作用導致的[19],外源磷添加量的增加提高了其生物量,油菜各部位的鎘含量表現為降低,油菜的鎘積累量表現為增加。

本研究結果表明,磷添加顯著降低了土壤pH。本試驗添加的磷為KH2PO4,溶解后呈酸性,這可能是土壤pH降低的主要原因[6]。土壤磷形態的變化與土壤理化性質和酶活性有關。在不同鎘處理的土壤中,隨著磷添加量的增加,Bioavailable-P、Exchangeable-P、Hydrolysable-P含量表現為增加,Ligand-P含量表現為降低(圖5)。Bioavailable-P是土壤溶液中的活性磷庫,磷添加量的增加可能使土壤中Bioavailable-P含量增加。Exchangeable-P是指吸附于土壤顆粒表面或與Ca、Fe、Al等形成化合物的磷,當土壤有機酸含量增加時,這種形態的磷可交換釋放至土壤溶液中。油菜葉片錳含量與油菜根系羧酸鹽釋放量呈正相關[11],結果表明,在0.3、3.0、5.0 mg/kg土壤鎘含量下,油菜葉片錳含量隨著外源磷添加量的增加而減少,這意味著磷添加量低時油菜釋放了更多的羧酸鹽來促進Exchangeable-P的釋放以增加油菜對磷的吸收,導致磷添加量低時土壤的Exchangeable-P含量更低。Hydrolysable-P是指能夠被土壤酶活化的有機磷,Hydrolysable-P的礦化依賴于磷酸酶和植酸酶的活性[20]。在0.3、3.0和5.0 mg/kg的鎘含量背景下,土壤ACP、ALP酶的活性均隨磷添加量的增加而降低,導致Hydrolysable-P釋放量降低,進而增加了土壤中可被酶活化的Hydrolysable-P的含量。Ligand-P是難被植物利用的磷,它的含量與土壤pH相關[21],磷添加量的增加降低了土壤pH,這有利于Ligand-P的活化,從而使Ligand-P含量降低。本研究土壤有效鎘含量隨著磷添加量的增加而降低,而未隨土壤pH的降低而增加,可能是因為本試驗土壤pH較低,所以pH不是影響土壤有效鎘含量的主要因素。土壤有效鎘含量降低可能與Ligand-P的釋放有關[22]。

酶參與土壤中多種重要的生物化學和物質循環過程,其活性是土壤微生物代謝和養分循環動態變化的敏感指標,可以反映磷添加對鎘污染土壤功能的影響[23]。隨著磷含量的增加,土壤中ACP和ALP的活性表現為降低(圖7f、圖7h),NAG和UE的活性表現為增加(圖7b、圖7e)。有研究表明施磷會降低ACP和ALP的活性[24-25]。Wu等[26]發現施加無機磷肥使土壤UE的活力比空白對照提高了3.2倍。這可能是由于外源添加磷緩解油菜-土壤系統的磷限制,使微生物將更多的資源分配給氮循環相關酶類[27-28]。因此,外源磷可能會通過緩解油菜根際的磷限制促進氮養分循環,改善油菜根際環境。

4 結 論

本研究表明,外源磷雖然降低了土壤pH和土壤有效鎘含量,但也促進了土壤礦物質磷的活化,提高了可利用磷庫的規模,增加土壤NAG和UE的活性,改善根際養分循環,減弱了鎘對油菜生長的影響,從而促進油菜的生長,提高了油菜對鎘的積累。本試驗僅限在油菜苗期進行,而外源磷添加在油菜整個生育期內對土壤磷鎘轉化、酶活性變化以及油菜各組織吸收積累鎘的影響還有待進一步研究。