熱應激對綿羊機體氧化損傷及免疫功能的影響

李述方 王海榮

摘要： 高溫易引起綿羊熱應激，熱應激時下丘腦-垂體-腎上腺軸（The hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）和交感-腎上腺髓質軸（The sympathetico-adrenomedullary axis，SAM）興奮，引起體內多種激素水平變化，以抵抗熱應激對機體的影響；同時產生大量的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）通過核因子E2相關因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）、抗氧化反應元件（Antioxidant response element，ARE）、核轉錄因子kB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）等信號通路，調控抗氧化酶及細胞因子的表達與分泌。高溫引發的熱應激最終會導致綿羊生長和繁殖能力降低。本文主要闡述了熱應激時綿羊體內激素水平的變化，以及氧化應激信號通路、天然免疫和適應性免疫的調控作用，以期為減輕熱應激對綿羊機體氧化損傷及免疫功能影響的研究提供參考依據。

關鍵詞： 熱應激；綿羊；內分泌激素；氧化應激信號通路；免疫

中圖分類號： S858.26?? 文獻標識碼： A ? 文章編號： 1000-4440（2023）07-1606-07

Effects of heat stress on oxidative damage and immune function in sheep

LI Shu-fang， WANG Hai-rong

（Inner Mongolia Key Laboratory of Animal Nutrition and Feed Science/College of Animal Science， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018，China）

Abstract： High temperature can cause heat stress in sheep. During heat stress，the hypothalamus-pituitary-adrenal axis （HPA） and the sympathetic-adrenomedullary axis （SAM） are excited， causing changes in various hormone levels in the body to resist the effects of heat stress. At the same time， a large amount of reactive oxygen species （ROS） and reactive nitrogen species （RNS） are produced， which regulate the expression and secretion of antioxidant enzymes and cytokines through nuclear factor erythroid 2-related factor 2 （Nrf2）， antioxidant response element （ARE）， nuclear factor kappa-B （NF-κB） and other signaling pathways. The heat stress induced by high temperature can eventually lead to reduced growth and reproductive capacity of sheep. This article mainly described the changes of hormone levels in sheep during heat stress， as well as the regulatory effects of oxidative stress signaling pathways， natural immunity， and adaptive immunity， in order to provide reference for the study of reducing the effects of heat stress on oxidative damage and immune function in sheep.

Key words： heat stress；sheep;endocrine hormones；oxidative stress signaling pathway；immunity

綿羊屬恒溫動物，在等熱區（21～25 ℃）內機體代謝穩定，25 ℃以上引起綿羊熱應激[1]。熱應激下機體會調整營養物質的吸收代謝，降低代謝效率，機體內自由基代謝平衡被擾亂，細胞和線粒體氧化損傷，最終導致綿羊生產能力下降[2]。熱應激發生時體內氧化-抗氧化平衡被打破，產生過多的活性氧（ROS）和活性氮（RNS），并通過次級代謝物[如超氧陰離子（O2·-）、過氧化氫（H2O2）、羥基自由基（·OH）、亞硝基離子（NO）或過氧亞硝酸鹽（ONOO-）]造成DNA和蛋白質等生物大分子損傷、炎癥和細胞凋亡[3-4]。此外，熱應激會激活HPA軸提高外周血糖皮質激素水平，從而抑制細胞因子的合成和釋放，并通過下丘腦-垂體-腎上腺軸（The hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）和交感-腎上腺髓質軸（The sympathetico-adrenomedullary axis，SAM）引起代謝、免疫和生殖障礙等，給畜牧業帶來較大的經濟損失[5]。

1 熱應激對內分泌激素的影響

1.1 熱應激引起HPA軸和SAM軸激活

HPA軸和SAM軸是機體感知內穩態失衡的反應部位，是應激發生時內分泌系統兩個主要調節免疫應答的途徑[6]。熱應激激活SAM軸，促使腎上腺髓質分泌腎上腺素（Epinephrine，EPI）、去甲腎上腺素（Norepinephrine，NE）和多巴胺（Dopamine，DA），提高機體應激能力[7]。當受到強烈刺激，SAM軸不能有效調節時，HPA軸被激活，下丘腦室旁核分泌促腎上腺皮質激素釋放激素（Corticotropin releasing hormone，CRH）刺激促腎上腺皮質激素（Adrenal corticotropic hormone，ACTH）的分泌進而促進糖皮質激素（Glucocorticoid，GC）的分泌[8]。ACTH的主要生理功能是維持腎上腺正常形態和功能并調控GC的分泌，GC的分泌有利于機體能量動員和保持機體內環境穩定。熱應激初期，HPA軸和SAM軸被激活，通過提高GC和兒茶酚胺（Catecholamine，CA）的分泌緩解熱應激反應[8-9]。當機體處于慢性熱應激（環境溫度持續升高幾天到幾周不等）狀態下，HPA軸持續興奮，導致HPA軸功能嚴重失調[10]。王哲奇[11]研究發現，間歇性熱應激條件下ACTH含量顯著增加，而重度熱應激下ACTH含量未發生顯著性變化，可能是重度熱應激導致HPA失調，影響ACTH的分泌。Cwynar等[8]發現隨著環境溫度上升，美利奴羊血清中皮質醇（Cortisol，COR）和EPI含量呈上升趨勢，并且重度熱應激下（50 ℃）血清中NE含量顯著升高。這可能是熱應激激活了HPA軸和SAM軸，促進GC和CA分泌，以緩解熱應激對綿羊生長發育帶來的負面影響。說明熱應激狀態下機體通過HPA軸和SAM軸調控激素的分泌以維持內環境穩定。

1.2 熱應激引起血液皮質醇含量變化

COR屬于應激激素，通常被用作動物應激的生物標記物。外界溫度升高時，血漿中GC水平增加，動物機體分解代謝加強，以抵御機體造成的壓力。其調節機制是熱應激時HPA軸和神經內分泌反饋通路被激活，導致血液中COR濃度升高[12]。Minton等[13]研究發現，羔羊剛暴露于熱應激條件下（35 ℃）時血清中COR濃度迅速增加3倍，12 h后恢復至正常水平。溫濕度指數（THI）是以溫度、濕度評價空氣炎熱程度的一個綜合性指標。Wojtas等[9]發現對照組（THI=69.575）美利奴羊血清COR濃度為（5.88±2.80） ng/dl，熱應激（THI=78.08）第7 d血清COR濃度升高至（7.97±1.80） ng/dl，熱應激條件下通風（THI=75.825）第7 d血清COR濃度降至（4.48±2.60） ng/dl。血漿COR濃度在熱應激初期升高可能是由于HPA軸的激活，觸發了皮質醇激素的級聯分泌，緩解了熱應激；長期遭受熱應激且超過機體自身調節能力時，HPA軸失調，腎上腺功能受到抑制或受損，導致血液COR濃度低于正常水平，緩解熱應激的能力下降[9]。此外，COR濃度逐漸降低至基礎水平也有利于減少動物在慢性熱應激期間的代謝產熱。

1.3 熱應激引起血液甲狀腺激素變化

甲狀腺激素（Thyroid hormone，TH）是動物體維持基礎代謝、調節產熱以維持體內熱平衡的重要激素。熱應激時機體通過下丘腦-垂體-甲狀腺（Hypothalamus-pituitary-thyroid，HPT）軸調控TH并抑制其分泌，從而降低基礎代謝率及細胞產熱水平[14]。TH主要有三碘甲狀腺原氨酸（Triiodothyronine，T3）和四碘甲狀腺素（Tetraiodothyronine，T4）2種形式[15]，T3分泌的減少被認為是動物機體減少產熱，維持機體熱平衡的一種表現[16]，T4能夠刺激細胞耗氧和產熱，從而提高基礎代謝率，提高葡萄糖利用率，改變脂質代謝[17]。甲狀腺對溫度敏感，Omida等[18]發現，熱應激減少了綿羊促甲狀腺激素（Thyroid stimulating hormone，TSH）的分泌和血液T3、T4的濃度。Lu等[19]發現，嚴重熱應激（THI連續7 d高于23.3）時，湖羊血清中T3和T4的濃度分別為（3.920±0.041） ng/ml和（82.92±1.55） ng/ml，顯著高于中度熱應激條件下（THI≤11.82）的（1.24±0.02） ng/ml和（41.89±1.23） ng/ml。熱應激過程中TH水平降低可能是機體減少產熱的一種適應性機制。

1.4 熱應激引起血液中其他激素變化

熱應激除了影響腎上腺和甲狀腺激素分泌，對生長激素（Growth hormone，GH）、胰島素（Insulin，INS）和瘦素等激素分泌也產生一定影響。GH是主要的產熱激素之一，GH水平的下降可能會減少身體的熱量生成，以維持動物機體熱平衡。張燦等[20]發現，熱應激導致藏綿羊血液中GH含量降低45.50％。GH參與調控機體糖、脂和蛋白質代謝，綿羊GH水平降低可能與熱應激期間體質量減輕密切相關。但李林等[21]發現，隨著熱應激程度的加強，第5周荷斯坦奶牛血液和肝臟中GH、IGF-I含量均高于第1周?？赡苁且驗闊釕е卵菨舛壬?，而GH能促使肝臟通過IGF-I軸激活糖異生途徑[22]。造成GH水平差異的原因可能與熱應激強度、持續時間及動物品種有關。瘦素調節攝食和能量平衡，其向下丘腦室旁核發送厭食信號，導致采食量下降，減少代謝熱的產生，維持動物體內能量平衡[23]。有研究結果表明，熱應激顯著降低了14 d羔羊和母羊血清中瘦素水平[11]。胰島素是體內唯一的降血糖激素，目前關于熱應激影響胰島素分泌的報道不一致。王哲奇[11]發現，試驗第28 d時，中度和重度熱應激均顯著升高了綿羊血清中胰島素水平。胰島素水平升高可能是由于熱應激期間血糖濃度升高所導致。而Nicolas-lopez等[24]報道，熱應激不影響綿羊胰島素的分泌。這種激素分泌的差異可能是品種差異、年齡及熱應激程度而引起。

2 熱應激對氧化應激信號通路的調節

動物發生熱應激時，體內多種信號通路交互聯系組成調控網絡，并相互調節以維持機體氧化平衡，本文主要從目前研究熱點Keap1-Nrf2/ARE通路和NF-κB通路的抗氧化應激作用及其調控機制進行綜述。

2.1 熱應激與Keap1-Nrf2/ARE信號通路

Keap1-Nrf2/ARE信號通路是機體抵抗氧化應激關鍵的防御性轉導通路。正常狀態下，Keap1與Nrf2經泛素連接酶（Cul3）以泛素化底物結合蛋白的形式形成Keap1-Nrf2復合體，Nrf2處于失活狀態[25]，隨后被泛素化降解使其無法進入細胞核，抑制下游靶基因的轉錄[26]。熱應激時，機體氧化-抗氧化平衡被打破，形成大量O2·-和H2O2自由基和非自由基[27]。ROS與一氧化氮（NO）反應產生NO、ONOO-和二硝基鐵絡合物等具高度氧化活性的自由基和硝基類親電子化合物[28]。自由基或親電子化合物與Keap1的半胱氨酸殘基通過氧化或共價修飾使其構象改變，造成Nrf2與之解耦連激活Nrf2；此外Nrf2也可被磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶C（PKC）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）和蛋白激酶R樣內質網激酶（PERK）等激酶誘導其磷酸化，導致Nrf2與Keap1分離活化[29]?；罨蟮腘rf2移位進入細胞核與小分子肌腱纖維瘤蛋白（Maf）形成異二聚體Nrf2-Maf并識別ARE，啟動下游一系列保護基因如Ⅱ相解毒酶基因及抗氧化酶類基因如血紅素加氧酶1（HO-1）基因、醌氧化還原酶1（NQO1）基因、過氧化物酶Ⅰ（PrxⅠ）基因、超氧化物歧化酶（SOD）基因及過氧化氫酶（CAT）基因轉錄，增強細胞對ROS的清除能力[30-31]。減輕親電子化合物和自由基引起的細胞損傷，發揮對氧化損傷的保護作用。石璐璐等[32]研究發現，高溫環境下14 d時綿羊血液白細胞中超氧化物歧化酶2（SOD2）基因和Nrf2 mRNA表達上調，28 d時，降低了血清中CAT、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）活性和總抗氧化能力（T-AOC），說明慢性熱應激能夠降低綿羊抗氧化能力。王換換等[33]發現，熱應激奶牛血液中COR含量以及肝臟組織中丙二醛（MDA）含量顯著升高，通過激活肝臟中Keap1-Nrf2/ARE信號通路上調下游的Ⅱ相解毒酶基因表達量，提高CAT、SOD 和GSH-Px活性緩解了氧化應激。說明熱應激打破了機體氧化-抗氧化系統平衡，發生氧化應激反應，激活Nrf2信號通路可以緩解氧化應激帶來的損傷。

2.2 熱應激與NF-κB信號通路

NF-κB通常以異源二聚體（p50/p65）的形式與NF-κB抑制蛋白（Inhibitor of nuclear factor kappa-B，IκB）在細胞質基質中結合，受到內外界刺激激活后與IκB解離，移位至細胞核內與特異的啟動子結合，從而調控基因的轉錄。p50/p65可在氧化應激條件下被直接修飾，Gambhir等[34]發現，p50亞基結構域的半胱氨酸殘基（Cys-62）容易氧化，使其與DNA結合能力降低。氧化應激產生的O2·-在線粒體SOD作用下轉化為H2O2，H2O2在鐵的作用下通過Fenton反應被還原為·OH [35]，·OH可導致NF-κB激活，啟動下游靶基因轉錄[36]。H2O2可以激活NF-κB誘導激酶（NIK），導致抑制性κB激酶α（IKKα）磷酸化和NF-κB活性增加[37]。熱應激產生的熱休克蛋白70（Heat shock protein 70，HSP70）及熱休克蛋白90（Heat shock protein 90，HSP90）均能影響NF-κB活性[38-39]， HSP70作為一種損傷相關模式分子（Death-associated molecular patterns，DAMP），可被Toll樣受體2（Toll-like receptors 2，TLR2）和Toll樣受體4（Toll-like receptors 4， TLR4）識別，觸發宿主的先天免疫反應[40]。HSP90能調控IKKα與IKKβ活性，使用格爾德霉素（HSP90特異性抑制劑）時IKKα與抑制性κB激酶β（IKKβ）的合成被阻斷，從而影響NF-κB的激活[41]。此外，熱應激還能使動物腸道產生的脂多糖（LPS）發生移位，通過旁細胞通路和跨細胞轉運等方式易位進入血液或者上皮被免疫細胞和上皮細胞識別，經LPS/ TLR4/NF-κB信號傳導途徑觸發炎癥反應[42-43]。葉建新等[44]發現，與正常組相比，模型組大鼠[相對溫度（40.0±0.5） ℃，相對濕度（70%±5%）]腦組織受損嚴重，腦組織中TLR4、NF-κB及下游炎性因子腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor alpha，TNF-α）、白細胞介素1β（Interleukin-1 beta，IL-1β）、白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）含量顯著升高。張宇等[45]發現，熱應激顯著升高了山羊小腸上皮細胞IL-1β基因、TNF-α基因、白細胞介素8基因（IL-8）、NF-κB基因表達水平。說明熱應激通過激活NF-κB信號途徑，導致機體炎性因子的大量分泌，造成組織和細胞損傷。然而NF-κB在氧化應激時也起著有益作用，NADPH（Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate）氧化還原系統提供了主要的抗氧化機制。Gu等[46]發現，NIK可通過磷酸化和促進葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的活性，促進NADPH的產生，減少ROS異常積累和緩解氧化應激。Wu等[47]研究結果表明，持續的氧化應激導致蛋白酶失活，通過阻止IκB的降解來抑制NF-κB的活化。說明熱應激在早期具有激活NF-κB的潛能，但在持續的氧化應激中可能抑制了NF-κB活性。

氧化應激是一個涉及多條信號通路的復雜過程，此過程并不是由某條通路單獨調控，而是多條通路協同作用。諸如PI3K/Akt、AMPK、MAPK及FoxO信號通路也參與氧化應激的調節，在對熱應激引起的氧化應激的研究應綜合考慮各種因素之間的相互作用。

3 熱應激對綿羊免疫功能的影響

動物機體免疫調節是一個復雜的過程，其中各種理化成分在分子水平、細胞水平和組織器官水平上參與免疫調節，熱應激激活HPA和SAM軸以調節對熱應激的反應，從而引起免疫反應的變化。

3.1 熱應激對天然免疫的影響

天然免疫系統是指機體天生具有的生理防御功能，具有作用范圍廣、反應迅速、非特異性等特點。當物理屏障不能消除病原體時，天然免疫系統會促進中性粒細胞、單核細胞和巨噬細胞遷移到感染部位，通過胞吞的方式吞噬病原體，溶酶體途徑殺死病原微生物，隨后產生特異性免疫[48]。He等[49]發現，暴露于（37±2） ℃（8 h/d，持續14 d）的肉雞脾臟中，淋巴器官的生長指數降低，促炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA豐度增加。白細胞是免疫系統的主要組成部分，包括淋巴細胞和各種吞噬細胞，其數量增加或減少是機體在熱應激狀態下產生的一種免疫應答反應。Mcewen等[50]研究結果表明，應激情況下動物通過HPA軸引起GC增加導致血液淋巴細胞數量顯著下降。Wojtas等[9]用氣候室模擬熱應激，觀察到美利奴羊外周血白細胞計數由（10.07±2.10） k/μl下降至（9.12±0.70） k/μl，并且COR從（5.88±2.80） ng/dl升至（7.97±1.80） ng/dl。血液中白細胞的減少可能是免疫細胞重新分配到其他器官以適應熱應激。與GC相反的是，CA已被證明能增加血液中白細胞數量。重度熱應激時，綿羊血液中白細胞數量增多，血清中NE濃度顯著升高[8]。熱應激動物的白細胞數量增加或減少，可能與激素濃度和組合的差異，以及動物種類、應激暴露時間和動物對熱應激的適應有關。

熱應激激活HPA軸引起GC分泌增加，GC抑制巨噬細胞的免疫功能，阻礙淋巴細胞分裂，加速凋亡，從而抑制天然免疫和細胞免疫[10]。Singh等[51]發現，適應性較好的Chokla綿羊在熱應激時淋巴細胞計數增加，中性粒細胞計數減少，而適應性較差的Marwari綿羊淋巴細胞計數減少，嗜酸性粒細胞和中性粒細胞數量增加。熱應激初期和輕度熱應激時，熱應激程度較弱，動物機體能通過自身調節來適應熱應激，但重度熱應激時，免疫細胞數量及凋亡率發生變化，導致免疫力降低，同時漿細胞產生抗體減少，抑制體液免疫；熱應激會阻礙抗原的識別遞呈和抗體的活化增殖，導致免疫應答及時清除抗原的能力受到抑制[10]?？梢?，熱應激通過改變免疫功能和增加對疾病的易感性，對綿羊免疫系統產生不利影響。熱應激條件下，與先天免疫反應相關的急性期蛋白如血清白蛋白（Albumin，ALB）、觸珠蛋白（Haptoglobin，HP）以及血清內毒素和熱休克蛋白（Heat shock proteins ，HSPs）含量增加[52]。Kaufman等[53]發現，與在熱中性區的奶牛相比，奶牛發生熱應激時，血清急性期蛋白濃度升高。Dangi等[54]發現，熱應激時熱休克因子1（Heat shock factor 1，HSF1）進入細胞核與熱休克元件（Heat shock element，HSE）結合啟動HSP70和HSP90轉錄。熱休克蛋白可通過激活抗氧化酶系統來減少ROS的產生，來保護機體免受氧化損傷[55]，同時熱應激產生的HSP70及HSP90均能影響NF-κB活性[38-39]。Saadeldin等[56]發現，急性熱應激（45 ℃，4 h）條件下，綿羊成纖維細胞中HSP70和HSP90基因表達水平均顯著升高。以上結果揭示了熱應激期間激活了全身炎癥，雖然目前炎癥的作用尚不清楚，但炎癥途徑的激活可能為動物機體緩解熱應激帶來的不利影響提供了思路。

3.2 熱應激對適應性免疫的影響

適應性免疫由細胞免疫和體液免疫組成，細胞免疫是由免疫細胞介導的免疫反應，包括T細胞介導的免疫應答，單核細胞、中性粒細胞和巨噬細胞的吞噬作用以及NK細胞的殺傷功能。高溫環境下，動物選擇性產生輔助性T細胞1/2（ T helper cells 1/2，Th1/2）型細胞因子以調節Th1/Th2細胞因子的平衡[57]。Th1分泌的干擾素γ（Interferon-γ，INF-γ）、白細胞介素2（Interleukin-2，IL-2）、白細胞介素12（Interleukin-12，IL-12）和TNF-α激活細胞免疫，促使炎癥發生；Th2分泌的白細胞介素4（Interleukin-4，IL-4）、白細胞介素5（Interleukin-5，IL-5）、IL-6、白細胞介素10（Interleukin-10，IL-10）、白細胞介素11（Interleukin-11，IL-11）和白細胞介素13（Interleukin-13，IL-13）誘導體液免疫和過敏反應以及抑制炎癥反應。熱應激激活SAM軸和HPA軸調節GC和CA分泌[36]，GC抑制IL-12表達，CA抑制IL-12和促進IL-10表達，GC和CA通過影響細胞因子的分泌調節Th1和Th2的平衡[57]。Shi等[58]研究發現，遭受間歇性不同程度熱應激28 d后，綿羊血清中IL-2、IL-1和TNF-α濃度增加；間歇性不同程度熱應激組和室外組第28 d綿羊血清中IL-2濃度較第14 d顯著降低，IL-1、IL-1β和TNF-α濃度較第14 d顯著升高。彭孝坤等[59] 報道，38 ℃急性熱應激處理4 h后，肉羊血清中IL-2含量顯著升高，8 h后血清中IL-1β含量顯著升高，并且38 ℃急性熱應激時TNF-α和IL-1β含量比30 ℃和34 ℃急性熱應激時上升程度要高。結果表明急性和慢性熱應激均促進Th1細胞因子的分泌，降低細胞免疫功能。

免疫球蛋白在體液免疫中起主要作用，免疫球蛋白能夠促進巨噬細胞的吞噬作用以及與抗原結合，其含量的高低代表體液免疫的狀況。Wu等[60]認為，免疫球蛋白含量的變化受應激類型、應激持續時間、應激強度以及動物品種和動物機體健康狀況的影響。陳浩等[61]研究結果表明，與非熱應激期間相比，慢性熱應激（CCI=29.61）條件下牛血清免疫球蛋白A（Immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）含量分別減少了29%、25%，免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）含量沒有變化。Shi等[58]發現，熱應激28 d時，綿羊血清中IgA、IgG、IgM濃度降低。彭孝坤等[59]發現，38 ℃急性熱應激處理4 h后，肉羊血清中IgM、IgA和IgG含量顯著降低，而34 ℃熱應激時無明顯變化。說明急性和慢性熱應激均可以降低動物機體血清中免疫球蛋白含量，抑制體液免疫。

4 小 結

熱應激時綿羊體內過量的ROS和氮衍生物產生且通過Keap1-Nrf2/ARE、NF-κB信號通路調控抗氧化酶及細胞因子的表達與分泌，加劇氧化損傷；同時，熱應激激活HPA軸和SAM軸，造成激素水平的改變，調節機體熱平衡，影響綿羊免疫功能。本文通過綜述熱應激時綿羊體內激素水平改變、氧化應激信號通路的作用以及天然免疫和適應性免疫的調控，分析熱應激時綿羊體內生理狀況及免疫功能的變化，為緩解熱應激對機體的損害提供依據。

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（責任編輯：成紓寒）