獼猴桃膠孢炭疽病菌的農桿菌介導遺傳轉化體系構建及熒光標記菌株鑒定

蘇琦雅,鄧 蕾,潘 慧,鐘彩虹,劉德江*,李 黎#

(1.佳木斯大學 生物與農業學院,黑龍江 佳木斯 154007;2.中國科學院 武漢植物園,武漢 430074;3.中國科學院 植物種質創新與特色農業重點實驗室,武漢 430074;4.中國科學院 獼猴桃產業技術工程實驗室,武漢 430073)

近年來,隨著獼猴桃產業的快速發展,獼猴桃炭疽病在我國四川、江西等多省份發現,部分園區感病超過30%,呈現同一園區多點發病的狀況,對獼猴桃產量和品質造成了嚴重影響[1-2]。獼猴桃感病后葉片邊緣卷縮,初期呈現水漬狀病斑,后期為褐色不規則形病斑,病斑正面散生許多小黑點,病健交界明顯。病情嚴重時多個病斑常連接成片,形成穿孔或大量落葉[3]。此外,該病還會導致獼猴桃果實硬度、維生素C含量迅速下降,果面出現褐色病斑直至完全腐爛,降低果實質量[4]。

膠孢炭疽菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Sacc.],有性態為圍小叢殼菌(Glomerellacingulata),屬子囊菌門,無性態為膠孢炭疽菌。一般以菌絲體和分生孢子盤形式在宿主上越冬,翌年早春形成分生孢子,借風雨和昆蟲傳播,從氣孔、傷口侵入,導致植物發病[5]。迄今為止,已報道該菌可導致蘋果、桃、芒果、番木瓜、柑橘、黃柏、板栗、枇杷、麥冬、橡膠等200多種植物感染炭疽病,危害重大[6]。2016年9月,基于生物學特性、致病力驗證及真菌的內轉錄間隔區(internally transcribed spacer,ITS)、β-微管蛋白(beta-tubulin,β-tubulin)及甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehydephos phate dehydrogenase,GAPDH)多序列實驗,膠孢炭疽菌被首次鑒定為我國貴州六盤水及浙江泰順等地獼猴桃炭疽病的主要致病菌[7],但該菌對獼猴桃的定殖侵染及致病機理并未得到深入研究。綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)作為一種全新的非酶報告基因,具有熒光特性穩定、實時原位檢測方便、受體細胞的種屬和類型多樣等優點,被廣泛用于植物病原菌檢測、侵染與定殖、基因表達及抗性植株篩選中[8]。然而,綠色熒光蛋白作為報告基因研究炭疽病菌對獼猴桃的侵染過程未見報道。

針對膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)菌株,李思蒙等[9]、張俊等[10]、曾泉等[11]及陸英等[12]分別成功建立了聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介導的楊樹、芒果、辣椒、咖啡膠孢炭疽菌的遺傳轉化體系,獲得了對應的GFP熒光轉化子。但PEG介導遺傳轉化具有一些缺點,譬如步驟繁瑣且轉化效率低、易產生部分瞬時轉化子和多拷貝整合等。近幾年,農桿菌介導構建綠色熒光蛋白菌株的技術因其操作簡單、穩定性強、轉化效率高、單拷貝插入突變體多等優點,也被用于膠孢炭疽菌的熒光菌構建中。李偉等[13]以篩選致病基因為目的,首次建立了農桿菌介導的芒果膠孢炭疽菌遺傳轉化體系,篩選到多株菌落形態異?；虍a孢能力下降的突變體;王海艷等[14]構建了農桿菌介導的蘋果炭疽病菌遺傳轉化體系;但上述2項研究并未獲得其熒光菌株。畢方鋮等[15]首次篩選到GFP熒光的芒果膠孢炭疽病菌,得到了8株致病力減弱或缺失的轉化子。因此,在畢方鋮等[15]研究體系的基礎上,擬針對獼猴桃膠孢炭疽病菌構建遺傳轉化體系,獲得與野生型形態、致病力一致且可穩定遺傳的GFP熒光轉化子,為探究該菌對獼猴桃的侵染規律及致病機理奠定材料基礎。該研究結果將有助于盡快減少該病對獼猴桃產業造成的經濟損失。

1 材料與方法

1.1 供試材料

膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)菌株KFCG-W(KF為宿主獼猴桃縮寫,CG為炭疽病拉丁名縮寫,W代表野生菌株)分離自獼猴桃炭疽病感病果實[5]。含GFP基因和潮霉素B抗性基因的雙元質粒pCAMBgfp及以其為轉化載體的農桿菌EHA105菌株,均由廣東省農業科學院果樹研究所畢方鋮研究員惠贈[15]。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar,PDA)、LB(Luria-Bertani)培養基、誘導培養基(induction medium,IM)及篩選培養基配方與鄧蕾等[16]一致。

1.2 實驗方法

1.2.1 含雙元載體的農桿菌液制備 將上述含雙元質粒的EHA105農桿菌菌株在LB平板上進行活化,28℃下培養48h后挑取單菌落至含50μg/mL卡那霉素(kanamycin,Kan)及25μg/mL利福平(rifampicin,Rif)的LB液體培養基中。將培養基混勻后放入恒溫培養箱,以200r/min條件振蕩培養48h后將菌液在離心機內以5000r/min離心5min,倒掉上清液,將剩余沉淀在IM液體培養基中重懸,調整重懸濃度至600nm波長下的溶液吸光度(optical density,OD600)為0.2,隨后在28℃下以200r/min條件振蕩培養6h,備用。

1.2.2 膠孢炭疽病菌的孢子懸液制備 將KFCG-W菌株在PDA平板上接種培養2周,觀察平板產孢情況。用無菌涂布棒在平板表面多次輕輕刮擦,逐次加入無菌水,輕輕晃動平板,收集孢子液并用2層無菌紗布過濾,隨后進一步用IM液體培養基將孢子重懸混勻,最終通過顯微觀察計數稀釋得到濃度為1×106個/mL的孢子懸液。

1.2.3 孢子與農桿菌菌株共轉化 準備鋪有無菌玻璃紙的IM共培養基+200μmol/L乙酰丁香酮(acetosyringone,AS)平板,將1.0mL農桿菌液及1.0mL孢子懸液均勻混合,取100μL涂布于平板上,在25℃條件下避光共培養48h。隨后,將玻璃紙轉移至篩選培養基(含160μg/mL潮霉素和200μmol/L頭孢霉素),置于25℃條件下培養。待長出新菌落后將單菌落挑至含160μg/mL潮霉素的培養基上反復繼代培養,其中仍可穩定生長的菌落作為候選轉化子[17]。

1.2.4 候選轉化子的PCR檢測及熒光驗證 1) GFP基因的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)檢測:收集轉化子菌絲提取脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)。擴增引物序列為GFP-F/GFP-R:5′-AGCAAGGGCGAGGAGCTGT-3′/5′-TTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3′。PCR擴增體系為模板1μL,10μmol/L正反向引物各0.5μL,2×phanta max master mix(Dye Plus) 12.5μL,加入滅菌超純水補至25μL。反應程序為95℃預變性3min,95℃變性15s、60℃退火15s、72℃延伸1min,循環35次;72℃條件下保存10min。使用Tanon 1600全自動數碼凝膠成像分析系統觀察PCR產物的電泳檢測結果,初步確定陽性轉化子。2) 轉化子的熒光檢測:針對這些初步確定為陽性轉化子的材料,在25℃條件下培養4d;先用LUYOR-3410手持熒光儀觀察其菌落,如發現帶GFP熒光,則挑取菌絲制作成玻片,進一步運用熒光顯微鏡Leica DFC550進行觀察;如仍可觀察到明確的熒光,則被確定為陽性轉化子。

1.2.5 陽性轉化子的菌落形態及致病性驗證 1) 轉化子的菌落形態觀察及菌絲生長速率測定:將陽性轉化子活化,用打孔器取直徑為0.8cm的菌餅,接種置于PDA平板的中心,在25℃條件下培養4d后運用十字交叉法測量菌落的平均直徑,觀察菌落形態,計算標準誤差。以野生型為對照,重復3次。2) 轉化子的致病力測定:參照鄧蕾等[16]的方法,用75%酒精對中華獼猴桃‘東紅’品種果實進行消毒,消毒30s后立即用無菌水沖洗3次,自然晾干后用注射器針頭在果實表面刺孔。以野生型KFCG-W菌株為對照,將直徑0.8cm的轉化子菌餅接種到果實表面上,菌絲面與果實接觸,在25℃條件下培養6d后測定病斑直徑,計算標準誤差值,重復8次。將顯著水平設定為0.05,運用SPSS 20.0軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 轉化子PCR檢測

首先,為確定獼猴桃炭疽病菌KFCG-W菌株遺傳轉化的最佳潮霉素篩選濃度,設置了梯度篩選實驗。野生型KFCG-W菌株在不同濃度潮霉素B平板上的菌絲生長情況如圖1所示。由圖1可知,野生型KFCG-W菌株在不含潮霉素的PDA平板上正常生長(A列);當潮霉素質量濃度分別為60μg/mL(B列)、120μg/mL(C列)時,菌絲受到不同程度的抑制但仍在生長,且隨著潮霉素濃度的增加,菌絲受抑制的程度越來越明顯。當潮霉素質量濃度增加至140μg/mL(D列)時,菌株已基本停止生長。當潮霉素質量濃度進一步增加至160μg/mL(E列)或180μg/mL(F列)時,菌株完全停止生長?；趯嶒灲Y果可知,潮霉素質量濃度為160μg/mL時野生型菌株已完全無法生長,滿足篩選要求,特將轉化子篩選質量濃度設定為160μg/mL(E列)。

按照1.2.1～1.2.3步驟進行農桿菌介導的獼猴桃炭疽病菌KFCG-W菌株遺傳轉化,經潮霉素篩選及數次繼代培養篩選,初步篩選獲得11株轉化子。為保證轉化子的準確性,進一步利用GFP序列特異性引物對野生型KFCG-W菌株及11株轉化子(CG1～CG11)進行PCR檢測,PCR擴增后能得到目的GFP片段710堿基對(base pair,bp)的轉化子被視為遺傳轉化成功的轉化子。野生型KFCG-W菌株及轉化子PCR檢測電泳圖如圖2所示。由圖2可知,與預期結果一致,對應泳道1的野生型KFCG-W菌株未擴增到目的熒光GFP基因條帶中,分別對應泳道2～12的轉化子CG1～CG11均可擴增得到710bp的GFP基因目的條帶中,由此說明GFP片段已穩定插入轉化子基因組中,可用于進行下一步研究。

注:M為電泳;泳道1為KFCG-W野生菌株;泳道2～12依次對應轉化子CG1～CG11。圖2 野生型KFCG-W菌株及轉化子PCR檢測電泳圖Fig.2 PCR verification for wild type stain and transformants of C.gloeosporioides

2.2 熒光顯微檢測

為進一步確定遺傳轉化子的熒光穩定性,對11株轉化子在25℃條件下PDA培養基上培養4d后的菌絲生長狀態、孢子及菌絲顯微結構、接種果實后的感病癥狀進行分析。結果表明,11株轉化子在激發光條件下均可表達穩定的綠色熒光,由此證實11株轉化子中的外源GFP基因均能正常表達并遺傳穩定。觀察熒光強度發現大部分菌株的GFP表達水平一致,其中CG-10菌株的熒光強度最強烈。轉化子CG-10的熒光顯微觀察結果如圖3所示。

圖3 轉化子CG-10的熒光顯微觀察Fig.3 Fluorescence microscopic observation of transformant CG-10

由圖3(a)可知,在明場條件下CG-10轉化子在PDA平板上菌絲生長正常。由圖3(b)可知,在紫外激發光條件下,該菌株的菌絲熒光明亮穩定,菌絲的輪紋較明場下更清晰。由圖3(c)可知,將CG-10轉化子接種果實后,在明場條件下果面出現典型的軟腐癥狀,病部果肉呈水漬狀腐爛,病健交界處明顯。由圖3(d)可知,在紫外激發光條件下,CG-10轉化子的病斑呈現明亮的熒光,熒光形狀面積與果實病斑完全一致,有利于更直觀地觀察軟腐病菌對獼猴桃果實的侵染過程。由圖3(e)可知,在明場條件下CG-10轉化子菌絲結構正常,孢子萌發正常。由圖3(f)可知,轉化子的菌絲和孢子熒光穩定,較明場而言能更清晰地觀察膠孢炭疽病菌的菌絲結構及孢子形態。

2.3 轉化子的菌落形態分析

為進一步篩選出與野生型菌株菌落形態一致的熒光轉化子菌株,對野生型菌株及11株轉化子在PDA平板上的菌落特征進行了觀察,結果如圖4所示。觀察接種4d后的平板菌落,由圖4(a)可知,野生型菌株菌絲白色濃密,菌絲生長速度較快。與野生型菌株相比,CG-1(圖4(b))、CG-4(圖4(e))、CG-6(圖4(g))、CG-8(圖4(i))、CG-9(圖4(j))5株轉化子的菌落形態及菌絲生長速度基本一致;CG-2(圖4(c))、CG-3(圖4(d))、CG-5(圖4(f))、CG-7(圖4(h))、CG-10(圖4(k))、CG-11(圖4(l))6株轉化子的菌落形態與野生型菌株存在顯著差異,菌絲扭結或邊緣不平整,生長速率明顯下降,說明GFP片段的插入對菌絲生長造成了影響。其中,CG-10菌絲呈淺綠色,與轉化子的熒光觀察結果一致,可能與GFP基因顯著高表達相關。

圖4 野生型及轉化子在PDA平板上的菌落形態Fig.4 The cultural characteristics wild type stain and transformants of C.gloeosporioides on PDA medium

2.4 致病力測定

為進一步篩選出與野生型菌株致病力一致的熒光轉化子菌株,將野生型菌株及11株轉化子的菌餅接種于獼猴桃果實上,接種6d后觀察果實的感病癥狀,結果如圖5所示。由圖5(a)可知,野生型菌株會引起明顯的感病癥狀,接種點為病部中心,呈淺褐色或褐色,病斑從接種點向外延展,果肉呈水漬狀腐爛,病健交界處明顯。相對于野生型KFCG-W菌株,11株轉化子中CG-7轉化子(圖5(h))的致病力增加;CG-4(圖5(e))、CG-5(圖5(f))、CG-9(圖5(j))、CG-10(圖5(k))4株轉化子與野生型菌株的致病力基本一致;CG-1(圖5(b))、CG-2(圖5(c))、CG-3(圖5(d))、CG-6(圖5(g))、CG-8(圖5(i))及CG-11(圖5(l))6株轉化子的致病力減弱。

圖5 野生型菌株及轉化子菌株對獼猴桃果實的致病力表型Fig.5 The pathogenicity of wild type strain and transformants of C.gloeosporioides to kiwifruit

對果實病斑的致病力數據進行方差分析,以進一步確定篩選到的轉化子與野生型無顯著差異。將顯著水平設定為0.05,根據差異顯著性標注原理,如果2組標注的字母中沒有重疊,說明在95%置信水平兩者具有顯著差異。如果2組標注的字母有1個相同標記字母,即表示2組差異不顯著。野生型菌株及轉化子菌株對獼猴桃果實的致病力差異分析結果如圖6所示。由圖6可知,與KFCG-W菌株相比,CG-7、CG-1、CG-6、CG-11、CG-3、CG-2、CG-8 7個菌株致病力與野生型差異顯著;CG-5、CG-9、CG-4、CG-10 4個菌株的致病力差異不顯著。

注:字母a～g代表差異顯著性。圖6 野生型菌株及轉化子菌株對獼猴桃果實的致病力差異分析Fig.6 The pathogenicity analysis of wild type strain and transformants of C.gloeosporioides to kiwifruit

綜合轉化子的熒光觀察、菌落形態觀察及致病力測試結果,可知CG-4及CG-9轉化子的菌落形態、菌絲生長速率、分生孢子形態、致病力與野生型無明顯差異,且熒光穩定;其他9株轉化子均與野生型KFCG-W菌株存在一定差異。

3 討論

在絲狀真菌的遺傳轉化過程中,載體的選擇、潮霉素篩選濃度、農桿菌濃度、培養基及共培養條件等因素直接影響轉化效率。此外,由于植物宿主及生存環境不同,不同宿主上分離得到的同一種真菌菌株在致病力、產孢能力及對潮霉素的敏感程度等均可能存在較大差異。研究主要針對在獼猴桃上分離到的膠孢炭疽病菌,摸索遺傳轉化體系條件及參數細節。

近年,針對從不同宿主上分離到的膠孢炭疽病菌構建的農桿菌介導的遺傳轉化體系研究十分有限。李偉等[13]針對芒果上分離到的膠孢炭疽菌建立了農桿菌介導的遺傳轉化體系,發現當潮霉素篩選質量濃度為200μg/mL,農桿菌在660nm處的吸光度值(optical density,OD660)為0.15,共培養時乙酰丁香酮摩爾濃度為200μmol/L時,選用pH值為5.5的IM共培養基轉化效果最好;篩選到多個炭疽病的轉移脫氧核糖核酸(transferred DNA,T-DNA)插入突變體,包含菌落形態異常突變體3個,產孢能力下降突變體6個。王海艷等[14]以蘋果上分離到的膠孢炭疽病菌為轉化受體,利用攜帶雙元載體pBIG3C的農桿菌進行轉化及體系優化,認為病菌分生孢子懸液濃度為1×105個/mL,共培養基中添加200μmol/L乙酰丁香酮,在共培養溫度22℃條件下培養24h時轉化效率較高;T-DNA均整合進病菌基因組中,以單拷貝形式整合且穩定遺傳,篩選到多株生長速率、分生孢子萌發率、附著胞形成比例、致病力顯著減低或形態異常的突變子。在此基礎上,畢方鋮等[15]構建了含潮霉素抗性基因和GFP基因的雙元載體pCAMBgfp,以其為轉化載體對芒果膠孢炭疽病菌進行了遺傳轉化,確定了最佳的潮霉素篩選質量濃度為150μg/mL,首次篩選得到8株致病力減弱或缺失的熒光轉化子。實驗首次針對從獼猴桃宿主上分離到的膠孢炭疽病菌進行了體系優化,為獲得最佳的轉化效果,選用了畢方鋮等[15]構建的雙元載體pCAMBgfp,并對病菌的分生孢子濃度、共培養溫度、乙酰丁香酮摩爾濃度等條件進行了優化,發現適當的乙酰丁香酮誘導有利于載體的表達。當潮霉素質量濃度為160μg/mL,農桿菌菌液吸光度OD600調整為0.2,病菌分生孢子懸浮液濃度為1×106個/mL,共培養基中添加200μmol/L的乙酰丁香酮,在25℃條件下避光共培養48h時,轉化效率相對較高且有利于單個轉化子的分辨和挑取。

病原菌的侵染過程十分復雜,涉及一系列基因的表達,菌絲的快速生長、分生孢子的正常產生是病菌侵染和致病的前提。實驗進一步對篩選獲得的11個轉化子進行熒光遺傳穩定性、菌落形態、菌絲生長速率、分生孢子形態及致病力測定,發現與野生型菌株相比較,CG-4及CG-9轉化子各方面無明顯差異且熒光穩定,說明該遺傳轉化體系可有效用于構建獼猴桃膠孢炭疽病菌的熒光菌株,用于菌株侵染機制研究。此外,與野生型菌株相比,其他9株轉化子或菌落形態改變,或菌絲生長速率變化,或致病力顯著增減,推測可能是T4轉座子的隨機插入位點與菌絲生長或致病力密切相關,但還有待于進一步的深入研究加以證實。其中,CG-1、CG-6、CG-8轉化子的菌絲生長速率雖未明顯改變,但致病力顯著減弱;CG-2、CG-3、CG-5、CG-7、CG-10、CG-11轉化子的菌絲生長速率顯著下降,對應CG-2、CG-3及CG-11致病力下降,但CG-5、CG-10轉化子致病力差異不顯著,CG-7轉化子致病力反而增強,說明菌株致病性不僅與菌絲生長速率相關,還與產孢率、孢子萌發率、附著胞的形成等多因素綜合關聯,該現象與蘋果膠孢炭疽病菌轉化研究一致[14]。后續可進一步擴大獼猴桃膠孢炭疽病菌的轉化子庫容量,結合轉化子的生物學特性及致病性分析,定位克隆病菌關鍵的生長發育及致病基因,為全面揭示其致病機理奠定基礎。

4 結論

該研究首次建立了獼猴桃炭疽病菌的農桿菌介導遺傳轉化體系,為后續探索獼猴桃炭疽病菌功能基因組學研究奠定了技術基礎。同時,獲得了2株菌落形態、菌絲生長速率、分生孢子形態及致病力與野生型無明顯差異且熒光穩定的轉化子(CG-4、CG-9),為系統研究該菌的侵染定殖機理奠定了材料基礎。此外,獲得了9株菌落形態及致病力與野生型差異顯著的突變體,可進一步用于開展關鍵致病基因驗證。隨著我國獼猴桃產業的迅猛發展、栽培面積急速增長,對炭疽病的研究需求也日益增加,該研究結果有助于盡快解析獼猴桃-膠孢炭疽病菌的分子互作機制,從而提高獼猴桃產業應對該病害的能力。