水稻小孢子培養研究進展

查中萍，郭 英，殷得所，王紅波，胡建林，鄭興飛，董華林，薛 蓮，胡 鵬，羅肖隕，徐得澤

（湖北省農業科學院糧食作物研究所/農業農村部作物分子育種重點實驗室/糧食作物種質創新與遺傳改良湖北省重點實驗室，武漢 430064）

水稻（Oryza sativaL.）是中國重要的糧食作物［1，2］。常規的雜交水稻育種法需要親本雜交之后再通過6～8 代的回交和定向篩選才能實現優良性狀的遺傳改良。利用單倍體育種技術則可以直接獲得優良純合個體，縮短育種進程［2，3］。水稻小孢子培養和花藥培養都是常用的單倍體育種方法。Guha等［4］發現花粉?？梢悦撾x正常配子體發育途徑轉向孢子體發育并在體外誘導胚狀體產生單倍體植株，單倍體培養技術逐漸發展起來。水稻花藥培養技術發展迅速，該技術具有加速性狀穩定、縮短育種年限、提高選擇效率等優點，在種質資源創新、雜種優勢利用以及水稻分子育種上被廣泛應用［5-13］。小孢子培養是直接從花蕾或者花藥中分離新鮮的小孢子，通過組織培養技術，采用適宜的培養基和培養條件進行培養，誘導產生胚狀體從而獲得單倍體植株，再通過技術手段使染色體加倍，獲得純合可育的雙單倍體（DH）。與花藥培養相比，小孢子培養可以排除花藥壁和絨氈層細胞的干擾，研究者可以在單倍體、單細胞水平上進行遺傳操作［14，15］。本研究根據水稻小孢子培養的研究情況，綜述了影響小孢子培養的主要影響因素以及小孢子培養技術面臨的問題，并對小孢子培養技術發展前景進行了展望。

1 小孢子分離純化方法

水稻小孢子位于花藥內，每個花藥有2 000～4 000 個小孢子。小孢子分離，即將經過預處理的幼穗經常規消毒（同一般組織培養消毒流程），然后在無菌條件下從花藥中分離小孢子。分離小孢子的方法可歸納為擠壓法、器械法和散落法3 種。

1.1 擠壓法

陳英等［16］分別用注射器內管擠壓或磁力攪拌法從花藥中分離出花粉，經過篩及500 r/min 離心2～3 次（每次2 min 左右），使小孢子從花藥中游離到抽提液中取得純凈花粉粒，王玲仙等［17］利用玻棒擠壓獲得分離的小孢子。通過無菌不銹鋼網或尼龍網篩去除比小孢子大的組織碎片，收集小孢子懸浮液。由于水稻花粉粒直徑一般在40～65 μm，故濾網一般選擇150～300 目。收集好的小孢子懸浮物從500～800 r/min 轉速低速離心使小孢子純化。前期研究發現，由于轉速較低，為便于收集小孢子最好用13～15 mL 尖底玻璃離心管離心，棄上清液后加抽提液反復清洗2～3 次，以徹底洗脫懸浮液中的植物組織殘液，最后用培養液（誘導培養基）清洗1 次，即可制備成小孢子懸浮液并轉入培養器進行培養。

1.2 器械法

為了提高分離效果，一些研究者探索用機器分離小孢子。常用的方法是利用超速旋切機或勻漿機將水稻花藥切碎，從而釋放出游離小孢子。陸瑞菊等［14］、郭桂梅等［15］使用勻漿機高速旋切幼穗，懸浮液用150 目篩網過濾，濾液以700 r/min 轉速離心5 min，重復3 次，收集小孢子。前期研究發現，由于水稻幼穗枝梗的木質化程度較高，放入容器直接利用旋切機或勻漿機處理后殘渣較多容易堵塞濾網而影響小孢子分離效率。因此，最好去除較老的枝梗，或者剪下每朵穎花進行旋切。

1.3 散落法

選用合適滲透壓的培養基對花藥進行液體漂浮培養時花藥會自行開裂，小孢子從花藥裂口處散落到培養基中，利用這種方法收集小孢子的方法叫散落法。陳英等［16］將花藥接種在液體培養基上，花藥漂浮于液面，先后自然裂開，不斷釋放出花粉。定期將花藥從培養瓶中取出，轉入另外培養瓶中繼續培養，再釋放花粉。過一定時期再將這些花藥轉出，這樣花藥被先后轉出，各培養瓶中留下不同時期由花藥釋放出的花粉，供繼續培養。王玲仙等［17］采用碳饑餓散落法處理花藥，即培養時不添加蔗糖而是用甘露醇代替來調節滲透壓，研究發現采用碳饑餓散落法能加速小孢子的散落速度而且收集量大。劉成洪等［18］以21%蔗糖溶液純化小孢子懸浮液，加無糖溶液調節滲透壓以600 r/min 轉速離心5 min，去除上清液后加1.5 mL 誘導培養基接種于培養皿中。

2 影響小孢子培養的主要因素

2.1 基因型

小孢子培養由花藥培養發展而來，因此小孢子培養與花藥培養方式相同，供體品種的基因型是影響單倍體培養的關鍵因素，基因型對愈傷組織或胚狀體的誘導率影響較大，沈錦驊等［19］對比分析了各種類型的水稻材料后，得出各類型水稻的花藥培養力由強到弱依次為糯稻、粳稻、秈粳型雜交稻、秈稻，但不同材料之間差異較大。粳稻類型相對于秈稻來說更易被誘導［12］，其愈傷組織誘導率最高可達40%以上，一般也都會在10%以上［20］，而秈稻類型的花藥培養效率普遍偏低，其花粉培養的株產率平均只有1%～3%［16］。江樹業等［21］研究表明，秈稻雜交組合中若有培養效率較高的粳稻的血緣，其雜交F1的培養效率也會較好。陳兆貴等［22］研究表明，花藥培養力是受親本控制的遺傳性狀，如果父本和母本的培養力均較強，F1代的培養力也會較強。何濤［23］在研究影響秈稻花藥培養的因素及高培養力材料的篩選時發現，愈傷組織的誘導和綠苗的分化之間相關性顯著，且均是由多基因控制的數量性狀。對水稻花藥培養效率的遺傳解析表明，愈傷組織誘導率和綠苗分化率是由核基因控制的數量遺傳性狀，且這2 個性狀之間沒有關聯，可獨立遺傳［24］。其中，影響花藥培養力的基因被認為在1 號染色體上，而控制綠苗與白苗分化比例的基因位于10 號染色體上［25］。何平等［24］對110 個DH 系進行花藥培養力的數量性狀位點（QTLs）分析，得到了與愈傷組織誘導有關的5 個QTLs，分別分布在第6、7、8、10 和12 號染色體上，與綠苗分化率有關的2 個QTLs 分布在第1 號和第9 號染色體上。研究認為，如果將能提高愈傷誘導率和綠苗分化率的QTLs 聚合在一起，篩選出愈傷誘導率和綠苗分化率均較高的材料，將大幅度提升花藥的培養力［13］。由此可見，小孢子培養能力與其他遺傳性狀相同，是一種受基因調控的遺傳特性。

2.2 親本生理狀態及小孢子發育時期

親本植株的生理狀態對愈傷組織或胚狀體誘導頻率有直接影響。一般從發育健壯的植株上取花粉進行培養效果較好。另外，游離小孢子培養還受供體植株生長條件的影響，如溫度、光照、光周期等。在氣溫不穩定的季節，有時同一材料、生長在同一田地中只是取穗日期前后不同，小孢子胚狀體誘導率都有明顯差異。據胡忠等［26］報道，在昆明粳稻孕穗期間的溫度為18.5～20.0 ℃時，愈傷組織的誘導率要比氣溫為16～18 ℃時的誘導率高3～4 倍。

選擇合適發育時期的花粉是提高小孢子培養誘導率的重要因素?；ǚ郯l育在單核靠邊期是水稻花藥培養的最佳時期。田間取樣的適宜時間一般為晴天的8：00—10：00 或16：00—18：00，此時細胞處于旺盛的分裂期。處于單核中晚期的花粉細胞誘導愈傷組織的能力較強［27，28］。這個時期小孢子發育尚未進入配子體發育階段，因此可以被迫增殖，表現出較高的被誘導率［29］。Chen［30］報道了花粉母細胞與四分體時期花粉在培養中停止在單核早期不產生愈傷組織，其他發育時期的花粉的愈傷組織誘導率分別為單核早期5.6%、單核中晚期35.7%、第一次分裂期6.7%、雙核期0。在試驗過程中，為了準確找到單核中晚期花粉細胞，人們經常用劍葉與其下一葉的葉枕間距離、穎殼的顏色及花藥長度作為外部形態指標來進行幼穗的選擇。通?；ㄋ幍膯魏丝窟吰?，穗苞飽滿而不破，穎殼淺綠色，花藥淡黃色，花藥長度伸長至穎殼2/5～1/2 處，劍葉與下一葉的葉枕距為8～12 cm，但這種形態判斷指標比較粗放，不同的材料間存在較大差異，故不同的材料取材時要綜合衡量。

2.3 預處理

預處理是誘導小孢子由配子體發育轉向孢子體發育的重要因素。常用的方法包括熱激處理、低溫處理、鹽處理、輻射、滲透、化學處理等。預處理的目的在于人為地改變小孢子的內在狀態，從而誘導小孢子轉入孢子體發育［5］。小孢子培養由花藥培養發展而來，因此，花藥培養的預處理也適應小孢子培養。高溫熱激處理能加快小孢子分裂，從而提高花藥培養的愈傷組織誘導率。熱激溫度和熱激時間都對熱激效果有影響。李大林［31］于接種前將幼穗分別于40、45、50、55 ℃和60 ℃溫水中處理，發現40～45 ℃處理1～5 min 和60 ℃處理10 s 均取得誘導率高于對照的效果。郭桂梅等［15］研究證明，游離小孢子于32 ℃熱激預處理2 d 能提高小孢子的愈傷組織產量和綠苗產量。低溫預處理是簡單易行的預處理方法，具體步驟為將幼穗保留兩葉一節，用75%的乙醇棉球擦拭表面進行消毒，然后用干凈的濕紗布包裹放入保鮮袋中，置于生化培養箱或冰箱中冷藏。低溫處理的作用機制是延緩花粉的退化、維持花粉發育的生理環境、提高源性生長素水平并降低乙烯水平、啟動雄核發育等［32］。對離體幼穗進行適當天數的低溫處理可以提高花藥培養效率已被多數研究證實［33，34］。陸瑞菊等［14］研究比較了5 ℃4 d 和5 ℃8 d 低溫預處理對水稻花藥培養的影響，發現5 ℃8 d 低溫預處理的效果明顯好于5 ℃4 d 的，平均愈傷組織產量提高了3.68 倍，平均綠苗產量提高了1.97倍。肖國櫻［32］的研究表明，低溫預處理20 d 內時間越長，水稻花藥培養效果越好。張連平等［35］的研究表明，水稻花藥培養10 ℃下低溫預處理8 d 效果好于4 d，超過10 d 效果下降。周雄韜等［36］對4 個秈稻雜交組合的花粉在9～11 ℃下處理14 d，胚胎誘導率平均達到24.1%，綠苗率為7.93%。劉成洪等［18］對粳稻F1小孢子培養條件的優化研究表明，低溫（4 ℃）處理水稻幼穗12 d 在誘導愈傷組織產量和分化綠苗產量上都要優于16 d 處理。李三和等［37］報道最適溫度是10 ℃，取材后的低溫預處理可以明顯提高水稻花藥培養的愈傷誘導率。吳永忠等［38］將花藥接種于液體培養基上，預培養0、3、5、7、10 d，再將花藥取出分離小孢子進行小孢子培養，表明花藥預培養7 d 后的小孢子能啟動分裂。郭桂梅等［15］對甘露醇滲透和化學因素進行小孢子培養預處理研究發現，花藥分別于60 g/L 甘露醇和10 mg/L 秋水仙堿中預處理3 d 均能明顯提高小孢子愈傷組織產量及綠苗產量。王玲仙等［17］于添加了Ficoll 和活性炭的預培養基中繼續培養16 d 的花粉中成功培養出高活性的小孢子，并誘導出了愈傷組織。

2.4 基本培養基類型及生長調節劑配比

培養基中含大量元素、微量元素、附加物、生長調節劑和碳源等成分，這些成分的含量和比例對小孢子培養效率都有直接影響。培養基可分為誘導培養基、分化培養基、生根培養基。用于胚狀體或愈傷組織誘導的誘導培養基是關鍵，已經研究出適合各種不同水稻小孢子培養的誘導培養基，如N6、合5、M8、SK3 等［3，39-41］；査中萍等［3］的研究表明，改良的M8（GM8）培養基是水稻花藥培養最佳誘導培養基，常見基本培養基見表1。

表1 小孢子培養常用基本培養基（單位：mg/L）

除基本培養基外，誘導培養基中的碳源和生長調節劑也是小孢子培養的重要影響因素。王光遠等［42］認為KM8p 培養基含有多種糖、有機酸和維生素等能為水稻小孢子的分裂提供良好的營養環境，能顯著提高小孢子的分裂頻率，同時蔗糖濃度為6%時最有利于胚狀體的發生。朱永生等［43］的研究證明，使用3%蔗糖+3%麥芽糖對胚狀體的發生及培養力的改善效果更佳。適當的生長調節劑濃度和配比不僅影響小孢子的發育方向及誘導率，并對其形態發生起重要作用。用于水稻小孢子培養的外源生長調節劑有2，4-D、NAA，細胞分裂素類有KT、6-BA等。陳英等［16］報道粳稻花藥培養一般只需2.0 mg/L 2，4-D 即可獲得較好的誘導率，當2，4-D 濃度高于10.0 mg/L 時，雖然能提高愈傷組織誘導率，但綠苗分化率卻降低。該研究表明，在水稻小孢子培養過程中，需要兼顧愈傷誘導與綠苗分化2 個階段，合理調節2，4-D 的用量。研究報道多種生長調節劑配比更有利于水稻小孢子誘導培養，査中萍等［3］的研究證明，培養基NAA 3.0 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L 最有利于水稻花藥小孢子誘導培養。

2.5 培養方式

小孢子的培養方法有固體培養、液體培養和固液雙層振蕩培養。吳暉霞等［44］對液體淺層培養和Transwell-CoL 培養盤2 種培養方式進行了比較，認為液體培養中出現的通氣不良問題，游離小孢子比花藥培養顯得更突出，沉在皿底的多細胞團或早期胚狀體往往分裂遲緩、生長慢，有的停止分裂，甚至褐化。當轉移這些褐化結構到固體分化培養基后，大部分不能恢復生長。采用Tarsnwell-CoL 培養盤培養游離小孢子時，由于它的構造優于35 mm 的培育皿，小孢子可以通過膜接觸到液體培養基，能及時充分獲得養分，而不會沉到皿底，始終處于良好的通氣狀態中。申娟等［45］在蔬菜類作物小孢子培養研究中發現，固液雙層振蕩培養的誘導頻率高于固體培養和液體培養，不僅可以增加胚的數量，同時胚狀體的發育也較好。分析其原因可能是固液雙層振蕩培養可以改善液體培養基的通氣性使小孢子從活性高的液體培養基中汲取營養且胚狀體長大后又不會沉沒，使子葉胚產生率大大提高，胚也生長更健壯，提高了胚發育的同步性和胚的質量，促進了胚在成苗培養基上的直接成苗。王玲仙等［17］在液體培養基中加入Ficoll 和活性炭，提高了愈傷組織的誘導率。培養基的通氣條件影響花粉的體胚發生，還會導致愈傷組織中的乳酸積累，引起白苗?；ǚ垡后w培養階段時在培養基中加入Ficoll，不僅可懸浮花粉，而且可懸浮花粉發育的體胚，從而提高花粉分裂頻率和得苗率，Ficoll 還能使花粉釋放變慢，提高小孢子的活力，同時加入Ficoll后能提高培養基的滲透壓，以提高愈傷組織再生植株的頻率。

2.6 胚狀體的發生及植株再生的影響

胚狀體分化成植株是小孢子培養中的重要環節，該階段主要的影響因素是培養基組分。一般的做法是參考適宜于供試材料的分化培養基組分，通過對植物生長調節劑濃度、碳源成分、pH 等條件調節進行改良。査中萍等［3］的研究發現，能同時適用秈稻、粳稻的通用分化培養基為MS+KT 2.0 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30.0 g/L，pH 為5.8。

在對游離小孢子培養形成的早期胚狀體進行再分化的工作中，發現將誘導培養14、21 d 時形成的早期胚狀體轉移到分化培養基上，比28、35 d 時轉移的效果好。選擇誘導培養14～21 d，直徑已達0.5 mm以上的早期胚狀體轉入分化培養基能獲得較高的綠苗再生頻率。過早將未達到直徑0.5 mm 的早期胚狀體轉移到分化培養基上，胚狀體很難繼續生長；沒有及時將再生的早期胚狀體轉移到分化培養基上時，褐化的早期胚狀體會不斷增加，容易喪失分化能力，或導致再生白化苗的頻率增加［45］。

小孢子培養所產生的單倍體植株常表現高度不育，需誘導染色體加倍。陸瑞菊等［14］研究報道預處理液中添加適量的秋水仙堿可以提高粳稻再生植株中雙單倍體植株的產量。

李朝燦［46］采用單倍體再生苗秋水仙堿浸根處理，平均加倍率達25.8%。對于水稻單倍體再生苗的浸根處理，秋水仙堿濃度以1 000 mg/L 為宜，處理時間以24 h 為宜，間歇處理加倍效果更好。用加有二甲基亞砜的秋水仙堿水溶液浸泡幼苗根和分蘗節誘發染色體加倍有很好效果［47］。楊漢民等［48］在小麥單倍體植株的加倍中也獲得類似的研究結果。

3 水稻小孢子培養存在的問題

盡管小孢子培養技術有許多優勢，而且水稻小孢子培養研究取得了一定進展，但仍不能廣泛應用于育種，致使已育成的花培品種在生產中大面積推廣的數量還不多，效益不高。表明利用小孢子培養技術育種在理論和實踐上還存在不少問題。主要表現在以下幾點：一是誘導頻率和分化成苗率低，可重復性差，很難利用；二是水稻分化培養中均有白化苗現象發生，小孢子培養白化苗現象也很突出，雖然有一些研究從胚胎發生的細胞形態學、代謝水平、分子水平等方面探究了小孢子胚胎發生機制，但是孢子體發育的誘導機制、啟動機制尚不明確。

4 水稻小孢子培養的前景展望

小孢子培養技術在十字花科、禾本科植物中應用比較成熟，在大白菜、甘藍、菜心、小麥等植物中都建立了完整的培養體系［49］。隨著對小孢子培養的深入研究和小孢子發生機理的進一步探索，依據水稻已有的花藥培養體系建立更有效、更完善的水稻小孢子培養技術體系將成為可能。隨著水稻小孢子培養技術體系的日益完善和成熟，游離小孢子培養技術將會更多地應用于種質創新、轉基因研究和分子標記等領域。游離小孢子培養技術不僅會成為常規育種的重要組成部分，而且必將在基礎研究領域發揮更大的作用。同時，利用單倍體小孢子進行誘變及突變體篩選，可以避免變異體為嵌合體，當代就能選擇出隱性突變性狀，在游離小孢子培養的多細胞團形成期、胚狀體形成期和胚狀體萌發成苗階段分別給予選擇壓，最終創造出抗病、耐逆新種質。