凍融交替對小麥秸稈降解特性的影響

趙子淵，艾為黨，卞 強，汪 震，黃 峰

（1.中國航天員科研訓練中心人因工程重點實驗室，北京 100094；2.中國農業大學土地科學與技術學院，北京 100193）

1 引言

隨著深空探測的發展，航天員要在月球等地外基地中生存下去，生存環境實現長期的物質循環供給，離不開受控生態生保系統（Controlled Ecological Life Support System，CELSS） 的 支 持［1］。CELSS 是在有限密閉空間內構建的人-植物-微生物-環境自循環式閉路生態系統，最終實現有限空間內的物質循環利用，在地外空間建立適人居住的類地球環境［2］。從目前受控生態生保系統研究來看，小麥已被選為主要候選物種之一，進行糧食生產，成為航天員的主要食物來源［3-4］。在綠航星際4 人180 天集成試驗中，小麥秸稈是產量最多占比最大的固廢［5］。麥稈不做處理將嚴重影響CELSS 中的物質流平衡，降低系統物質閉合度，并造成基地內的環境污染問題。如何處理小麥秸稈，實現密閉系統內物質的回收利用，對建立功能良好的受控生態生保系統意義重大。

目前，生物處理方式如好氧堆肥，可實現小麥秸稈的資源化利用，所得產物既可用作植物栽培基質，也可用于月球土壤的改良，是一種可行的技術途徑［6］。然而，由于小麥秸稈中纖維素、半纖維素和木質素等組分交織在一起，形成了緊湊復雜的網狀結構［7］，降低了酶的可及性，是阻礙秸稈降解的天然屏障［8］，使得在生物處理過程中，微生物自然發酵周期長、腐熟難度大。研究表明，通過適當的預處理破壞秸稈的復雜結構，打破其抗降解屏障，是實現其生物降解和轉化的關鍵［9］。

凍融交替是一種新興的秸稈預處理手段，其原理是通過水結晶的反復形成和融化，使秸稈空隙中的游離水結冰后體積膨脹，從而破壞秸稈結構，為后續生物發酵創造有利條件［10］。目前，已有研究人員對此進行了初步探索，李天沛等［11］使用酸、堿、氧化試劑聯合低溫凍融處理高粱秸稈，-10 ℃冷凍12 h，處理后各組高粱秸稈組分含量與對照組相比均有顯著變化，其中木質素去除率最高。Zhang 等［12］在不同冷凍溫度和時間下對小麥秸稈進行凍融處理，隨著溫度的降低和時間的延長，通過掃描電鏡觀察到秸稈孔徑逐漸增大。Li 等［13］以玉米秸稈為原料，在-20 ℃氨水中冷凍12 h，接著20 ℃解凍12 h，持續7 d，秸稈中揮發性固體含量減少了60.6%。由此可見，凍融交替預處理有利于秸稈的后續降解和微生物轉化利用。

由于月球溫度可降至-180 ℃［14］，航天員可利用天然低溫快速節能地完成水的冷凍過程，因此凍融交替法在月球基地中具有極大的應用潛力。然而，目前研究人員大多把凍融作為一種輔助手段，常結合酸、堿等化學處理，在月球基地中并不方便實現；此外，專門針對小麥秸稈的凍融預處理研究較少，關于凍融交替本身對小麥秸稈的降解特性所造成的具體影響尚未明晰。為此，本文，利用超低溫冰柜創造低溫環境，對小麥秸稈進行凍融交替處理，初步探究凍融交替對其降解特性的影響，以期為凍融交替預處理技術的進一步成熟及其在月球基地中的應用提供參考。

2 方法

2.1 實驗材料

小麥秸稈，為實驗室自行種植的小麥收獲后的殘余部分，儲存于干燥陰涼處，烘干，剪切至0.3～0.5 cm，基礎理化性質見表1。

表1 小麥秸稈基礎理化性質Table 1 Basic physicochemical properties of wheat straw

2.2 正交實驗設計

設置冷凍溫度、冷凍時間和凍融次數3 個因素，并參考前期預實驗結果確定出各因素的3 個水平，開展3 因素3 水平正交優化實驗，各因素水平設置見表2，另設置CK1組（實驗材料為原始秸稈）和CK 組（實驗材料用水浸泡8 h，但不進行凍融處理）作為對照組，共計11 個處理組，各處理組重復3 次。

表2 正交因素水平表Table 2 Orthogonal factors and levels

每組取2 g 在60 ℃烘箱中烘干至恒重的小麥秸稈，與40 mL 純凈水混合后置于200 mL 錐形瓶中靜置8 h（使水分充分浸入秸稈內部空隙），隨后置于超低溫冰柜中進行冷凍處理，待超低溫冰柜溫度降至目標溫度時開始計時，達到所設定的冷凍時間后拿出并于25 ℃下解凍，待完全解凍后立即將其放回超低溫冰柜中進行下一輪凍融處理，若是最后一輪則使用快速濾紙過濾后將濾液和秸稈置于4 ℃冰箱中儲存，秸稈在進行結構檢測前烘干。

2.3 測試方法及指標

本文通過可溶性總碳（Total Soluble Carbon，TSC）、可溶性總氮（Total Soluble Nitrogen，TSN）含量來定量研究凍融對秸稈降解特性的影響。一方面，由于可溶性碳、可溶性氮與微生物活性存在緊密聯系，是微生物更容易利用的底物［15］，與預處理后的生物處理效果顯著相關，可用處理前后其含量的變化來反映凍融效果；另一方面，對所有處理直接進行結構測定難以客觀準確地進行定量評價，因此本文首選可溶性總碳及可溶性總氮含量研究凍融對秸稈降解的影響?？扇苄钥偺紳舛仁褂肨OC-VCPH 型總碳分析儀（Shimadzu，日本）測定，并換算為可溶性總碳含量，檢測方法參考HJ 501-2009《水質 總有機碳的測定 燃燒氧化-非分散紅外吸收法》［16］；可溶性總氮濃度使用Vario TOC 型TOC／TN 分析儀（Elementar，德國）測定，并換算為含量，檢測方法參考ASTM D8083-16（2023） 通過高溫催化燃燒和化學發光檢測在水中計算的總氮和總凱氏定氮（Total Kjeldahl Nitrogen，TKN）的標準測試方法［17］。

通過預處理改變秸稈的微觀形貌，有助于增大秸稈比表面積及后續生物處理中酶與底物的接觸，通過掃描電鏡進行觀察驗證。將少量制備的小麥秸稈樣品烘干后，用碳基膠帶粘到掃描電鏡載物臺上，用S4800 掃描電鏡（Hitachi，日本）進行微觀形貌觀察。測試條件為加速電壓15 kV，工作距離為10 mm。

通過X 射線衍射（X-Ray Diffraction，XRD）分析可測定秸稈中纖維素的結晶度，從而判斷秸稈降解難易程度的改變。將少量小麥秸稈樣品烘干磨碎后，采用D8 advance 型X 射線衍射儀（Bruker，德國）進行小麥秸稈纖維素纖維的晶體結構分析，在2θ＝5°～60°內以2°／min 的掃描速度進行。結晶度CrI（%）計算見式（1）。

式中，Imax為衍射峰強度最大值（約2θ＝22°）；Iam為無定形峰的衍射強度，取2θ＝18.7°的衍射強度值。

傅立葉紅外變換光譜（Fourier Trans-form Infrared Spectroscopy，FTIR）分析是一種常見的現代化學分析手段，通過對比小麥秸稈凍融處理前后的譜圖，可檢測其化學鍵、官能團的變化，進而了解其結構和組成的改變。采用Nicolet iS10 型傅立葉紅外光譜儀（Thermo Scientific，美國）進行分析測定。樣品經充分干燥后使用Tissuelyser-24 L 型多樣品組織研磨儀研磨過40 目篩，上機測定，分辨率4 cm-1，波數范圍400～4000 cm-1。

2.4 數據處理

使用SPSS Statistics 26.0 軟件對正交實驗結果進行方差分析（ANOVA），P＜0.05 認為差異具有統計學意義。使用Origin 2021 對所得數據進行繪圖。

3 結果與討論

3.1 對可溶性總碳及總氮影響

表3 為不同處理組可溶性總碳分析結果，表4 為可溶性總碳極差R分析結果。通過計算極差R值進行比較，可以看出凍融次數R＞冷凍溫度R＞冷凍時間R，三因素中影響最大的是凍融次數，其次是冷凍溫度，最后是冷凍時間。分析各因素K值可以看出，隨著冷凍溫度的降低和凍融次數的增多，可溶性總碳、總氮含量明顯升高，而隨著冷凍時間的延長，可溶性總碳含量改變不明顯。此外，冷凍溫度的K3、冷凍時間的K1和凍融次數的K3最 高，分 別 為37.1 mg／g，35.9 mg／g 和38.3 mg／g，得出對應的最優凍融條件為冷凍溫度-80 ℃，冷凍時間4 h，凍融次數3 次，即本實驗中的處理7，此時可溶性總碳為41.8 mg／g，比僅進行浸泡未進行凍融的CK 對照組高了51.4%。

表3 不同處理組的可溶性總碳Table 3 TSC under different conditions

表5 為可溶性總碳的方差分析結果，由表5結果可知，凍融次數對可溶性總碳含量影響非常顯著（P＜0.01），這是由于在每次冷凍過程中，水分結冰膨脹所破壞的秸稈內部空間有限，多次冷凍過程提高了秸稈內部結構被破壞的整體比例；另一方面，秸稈內部相同空間多次受到結冰產生的膨脹力的作用，被破壞得更徹底。凍融次數的顯著作用在其他學者的研究中也有體現，Zhu等［18］將楊木切片在-20 ℃下進行凍融處理隨后生產半纖維素，隨著凍融次數從1 次增加到4 次，半纖維素產率逐漸提高，凍融4 次時半纖維素的產率從64.93 mg／g 提高到85.87 mg／g。

表5 正交實驗方差分析-可溶性總碳Table 5 ANOVA analysis on orthogonal tests- TSC

表6 為不同處理組可溶性總氮分析結果，表7 為可溶性總氮極差R分析結果。由表7 可知，3 個因素的影響程度依次為：冷凍溫度＞凍融次數＞冷凍時間，與可溶性總碳相比，冷凍溫度對可溶性總氮的影響更大，而凍融次數的影響略小。分析各因素3 個水平的K值可以看出，隨著冷凍溫度的降低和凍融次數的增多，可溶性總氮含量升高，而隨著冷凍時間的延長，可溶性總氮含量下降。此外，冷凍溫度的K3、冷凍時間的K1和凍融次數的K3最高，分別為9.4 mg／g，9.0 mg／g 和9.3 mg／g，得出對應的最優凍融條件為冷凍溫度-80 ℃，冷凍時間4 h，凍融次數3 次，與可溶性總碳的最優條件一致，此時可溶性總氮含量為11.1 mg／g，比僅進行浸泡未進行凍融的CK 對照組高了73.4%。

表6 不同處理組下可溶性總氮Table 6 TSN under different conditions

表7 正交實驗極差分析-可溶性總氮Table 7 Range analysis on orthogonal tests-TSN mg／g

表8 為可溶性總氮方差分析結果，由表8 可知，冷凍溫度和凍融次數對可溶性總氮影響非常顯著（P＜0.01），凍融次數的顯著影響與前述可溶性總碳的原因類似。溫度的影響主要由冰的物理性質導致，溫度越低，冰的硬度越高，對秸稈內部結構的破壞更徹底；此外，溫度越低，冰的體積也越大，可破壞的內部空間增大，導致了更多含碳、含氮物質的溶解。

表8 正交實驗方差分析-可溶性總氮Table 8 ANOVA analysis on orthogonal tests- TSN

3.2 對小麥秸稈微觀形貌的影響

根據3.1 結果，選擇可溶性總碳、總氮含量最高的7 組和相對最低的1 組，僅用水浸泡8 h 但不進行凍融處理的秸稈CK 組和原始干秸稈CK1組進行掃描電鏡及后續分析。

不同處理下小麥秸稈掃描電鏡照片如圖1所示，圖1（a）可以看出，原始秸稈CK1組結構致密，表面光滑，紋理清晰，幾乎無可見孔隙。由圖1（b）可知，經水浸泡8 h 后的CK 組表面碎屑物質增多，但整體仍保持致密有序的形態。觀察經凍融處理后的圖1（c）和圖1（d），-40 ℃凍融交替處理1 次的1 組秸稈表面出現少量短而淺的裂紋，而經-80 ℃凍融交替處理3 次的7組秸稈表面出現大量深而密的裂紋。由此可見，凍融對秸稈表面結構有顯著的破壞作用，隨著凍融條件的加強，秸稈表面的斷裂程度越大，比表面積越大，微生物和酶越容易侵入秸稈內部參與其降解。

圖1 不同處理下小麥秸稈掃描電鏡照片（×650 倍）Fig.1 SEM images of wheat straw under different conditions（×650 times）

3.3 對結晶度的影響

纖維素在小麥秸稈中含量較多，是秸稈中較難降解和轉化的部分［19］。纖維素從結構上可劃分為結晶區和無定形區，結晶區分子排列整齊，結構致密，較難降解，無定形區分子鏈無序堆積，相比結晶區更易降解。結晶度即結晶區所占的比例，通過預處理手段降低纖維素結晶度，有利于秸稈后續的生物降解。

不同處理下小麥秸稈XRD 圖譜如圖2 所示，由圖2 可知，所有樣品均在2θ為16°和22°左右出現衍射峰，在2θ為18.7°左右出現反向峰，整體呈現典型的纖維素Ⅰ型結構，說明浸泡以及凍融處理對纖維素晶體結構類型無明顯影響。此外，經結晶度公式計算，原始秸稈中纖維素結晶度為49.27%，與劉曉英［20］的研究結果相近。1 組和7 組結晶度分別為49.53%和52.21%?？梢钥闯鲭S著凍融條件的加強，纖維素結晶度反而提高。究其原因，是由于凍融同時作用于結晶區和非結晶區［21］，一方面凍融作用破壞了纖維素結晶區的氫鍵，降低了結晶度；另一方面，根據X 射線衍射圖譜計算纖維素結晶度時，半纖維素和木質素被算入無定形區，凍融會使代表無定形區的部分半纖維素溶解［22］。在本文實驗結果中，凍融對結晶區的破壞效果小于對無定形區的破壞效果，因此計算得出的結晶度與對照相比反而升高，這與鄭續等［23］使用蒸汽爆破法，Kim 等［24］采用氨水，Akhtar 等［25］采用酸、堿輔助微波預處理秸稈后發現纖維素結晶度上升的原因一致。

圖2 不同處理下小麥秸稈XRD 圖譜Fig.2 XRD pattern of wheat straw under different conditions

3.4 對小麥秸稈化學結構特性的影響

不同處理下小麥秸稈傅立葉紅外變換光譜如圖3 所示，所有曲線趨勢保持一致，沒有明顯的新特征峰出現，說明浸泡以及凍融處理沒有導致新的官能團產生。3350 cm-1處是一個強而寬的-OH 伸縮振動吸收峰，隨著處理條件的加強，此吸收峰逐漸減弱，說明秸稈中纖維素之間以及纖維素和半纖維素之間的部分氫鍵被打斷，而氫鍵是導致纖維素生物降解難度大的一個重要原因［26］，氫鍵被打斷越多，后續的生物降解越容易。2920 cm-1處的吸收峰是由C-H 伸縮振動引起的，在-80 ℃，3 次處理組中此峰明顯減弱，意味著凍融處理使纖維素大分子中部分甲基和亞甲基發生了斷裂［27］。1730 cm-1處為木質素側鏈C ＝O 的伸展振動吸收峰［28］，1510 cm-1處為木質素芳香環中C ＝C 的伸縮振動［29］，這兩處吸收峰減弱幅度較小，說明凍融處理對秸稈中木質素的影響不大。波數1047 cm-1處代表纖維素和部分半纖維素中C-O 的伸縮，895 cm-1為纖維素和半纖維素中β-1，4-糖苷鍵的特征吸收峰［20］，這兩峰的變化趨勢保持一致。首先，浸泡后的CK 組與原始秸稈CK1組完全重合，說明單純的水分浸泡無法降解秸稈中的纖維素和半纖維素，而凍融后的2 個處理中這2 個峰強度減弱，意味著凍融處理可以使秸稈中部分纖維素和半纖維素降解；此外，-80 ℃，3 次處理的峰強度比-40 ℃，1 次處理的更低，說明凍融溫度越低、次數越多，纖維素、半纖維素降解效果越強，這與前文中可溶性總碳、總氮結果和掃描電鏡觀察結果保持一致。

圖3 不同處理下小麥秸稈傅立葉紅外變換光譜Fig.3 FTIR of wheat straw under different conditions

4 結論

1） 凍融交替處理可提高小麥秸稈中可溶性總碳（TSC）、可溶性總氮（TSN）含量，凍融次數對TSC 影響非常顯著，冷凍溫度和凍融次數對TSN影響非常顯著；在冷凍溫度-80 ℃，冷凍時間4 h，凍融3 次的條件下，TSC 和TSN 含量提升最明顯，相較于CK 對照組分別提高了51.4%和73.4%。

2） 凍融交替處理可使小麥秸稈表面產生裂紋從而增大其比表面積，提高后續生物處理時與酶的接觸面積；凍融交替處理對纖維素無定形區的影響大于結晶區，導致結晶度升高，還可打斷秸稈中-OH、C-H、C-O 鍵，使部分纖維素和半纖維素降解溶出，有利于后續微生物的利用。

3） 利用超低溫對小麥秸稈進行凍融處理，可顯著改變其生物降解特性。實驗結果可為未來月球基地受控生態生保系統的小麥秸稈等植物類固廢的資源化處理提供參考。