小麥白粉菌環介導等溫擴增檢測技術體系的建立與應用

向禮波 袁斌 薛敏峰 史文琦 曾凡松 楊立軍 龔雙軍

關鍵詞：小麥白粉菌；環介導等溫擴增；靈敏度；特異性；快速檢測

白粉病是一種真菌病害，影響近10000種被子植物，其中包括許多具有重要經濟意義的栽培植物，如觀賞植物，果樹和谷物。大多數白粉病是由子囊菌亞門Ascomycota白粉菌屬Erysiphe真菌所引起，包括大約820種。谷物類白粉病是由禾布氏白粉菌Blurn.eria gra-rninis引起的，僅在禾本科的雜草和栽培谷物中發現。經濟上最重要的是小麥和大麥的白粉病，小麥白粉病在世界許多降雨量大的海洋或半大陸性氣候地區造成重大產量損失。病害防治的主要措施是種植抗性品種和施用殺菌劑。小麥白粉病屬于氣傳性病害，對小麥生產的威脅主要來自于春季流行區，因此，在早春季節對菌源進行檢測是開展病害預警的關鍵環節，也可為化學防治提供科學依據。目前生產上主要通過孢子捕捉器和植保人員田間隨機調查對白粉病進行監測，但該方法費時且起不到早期預警作用，因此，在生產中急需一種實用、操作簡便且快速準確的小麥白粉病菌早期檢測方法。

環介導等溫擴增（loop mediated isothermal am-plification，LAMP）技術是Notomi等2000年開發的一種恒溫核酸擴增技術。該方法針對目的基因序列的特異性區域設計一對外部引物和一對內部引物，在具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶催化作用下，在15～60min內能夠產生大量多環花椰菜結構的DNA片段混合物。該技術憑借著靈敏度高、不需要特殊和昂貴的儀器、直接在反應體系中加入染料根據顏色的變化檢測等優點而備受關注。目前該技術已廣泛應用于各類病原微生物、食品微生物和轉基因成分的檢測。

國內外已開發出多種檢測白粉菌的分子方法。Mori等以核糖體DNA內轉錄間隔區（internaltranscribed spacer，ITS）為靶標序列設計引物將白粉菌屬分成5個譜系。Zeng等用小麥白粉菌的ITS序列開發出小麥白粉菌的常規PCR、巢式PCR檢測體系，并用不同地區采集的小麥白粉病樣驗證開發的PCR檢測體系，發現巢式PCR的靈敏度高于常規PCR。Zheng等利用小麥白粉菌ITS序列篩選出特異性引物Bgt-F/Bgt-R并建立了實時熒光PCR檢測體系，檢測的靈敏度為0.1pg，比常規PCR高100倍，并且從接種ld的發病葉片中成功檢測出小麥白粉菌。以上這些已開發的分子檢測方法均是基于PCR建立的變溫核酸擴增技術，儀器昂貴、操作繁復、耗時較長，不適合在基層植保站應用和推廣。而針對小麥白粉菌的LAMP檢測技術目前尚未見報道。本研究擬以小麥白粉菌基因組中特有效應子基因BGT96224V316-LO-CUS1725（GenBank： VCU40465.1）為靶標序列，篩選合適的LAMP引物，并建立小麥白粉菌的LAMP檢測技術，旨在為準確、簡便的小麥白粉病早期監測提供技術支持。

1材料與方法

1.1供試材料

本研究中所用的菌株包括10株中國小麥白粉菌，分別來自陜西（5-83，6-69）、湖北（11-61，11-99）、安徽（17-18，17-40）、江蘇（21-2，24-4）、新疆（49-1，50-2）和1株瑞士小麥白粉菌（96224），共計1 1株。小麥白粉菌均采用小麥離體葉段方法進行保存和擴繁。另有7種其他白粉菌（表1），分別采集于當地生長季節發病的不同寄主植物，帶回實驗室用原寄主植物進行菌株擴繁。1株可培養病原真菌油菜菌核菌（表1），該菌株的活化培養采用PDA培養基（馬鈴薯200g/L，葡萄糖18g/L，瓊脂18g/L）。

1.2DNA的提取

在PDA培養基上培養油菜菌核菌至菌絲長滿培養皿，刮取菌絲至2mL的離心管中，液氮速凍后于全自動組織研磨儀研磨60s，使用基因組DNA提取試劑盒（D3195-01，Omega Bio-Tek公司）提取真菌基因組DNA。小麥白粉菌和其他7種白粉菌的樣品收集方法如下：首先選取嚴重發病的葉片，在超凈臺中輕輕敲打葉片將抖落的孢子收集到2mL離心管中，再向管中加入7粒直徑為5mm的玻璃珠（Sigma公司，貨號18406）。DNA的提取參照龔雙軍等的方法進行。

1.3LAMP引物設計與合成

根據NCBI中報道的瑞士小麥白粉菌菌株96224基因組序列，依靠基因序列比對分析，選取BGT96224V316_LOCUS1725 （GenBank：

VCU40465.1）為靶標序列，利用Primer Explore 5在線軟件（http：∥primerexplorer.

jp/lampv5 e/index.

html）設計引物（表2）。

1.4LAMP反應體系的特異性檢測

為檢測LAMP方法的特異性，分別以9種供試病原菌的gDNA為模板，以1.3篩選到的引物進行LAMP反應，以滅菌超純水為空白對照。LAMP反應體系Betain、40 U BstDNA聚合酶，模板gDNA 1uL，滅菌超純水補足25uL，混勻后于65℃水浴鍋中反應60 min，80℃2 min進行酶滅活處理，然后向反應體系中加入1肛L鈣黃綠素。使用紫外照射裝置（350～370nm）從反應試管側面進行觀察。綠色熒光為陽性反應，未發熒光為陰性反應。

1.5LAMP反應體系的靈敏度檢測

對提取的小麥白粉菌菌株96224基因組DNA，進行10倍梯度稀釋，得到3fg/uL～3ng/uL的DNA，進行LAMP引物的靈敏度試驗，以滅菌超純水為空白對照。觀察反應體系顏色的變化，方法同1.4。

1.6發病小麥葉片中病原菌的LAMP檢測

為測定LAMP方法對發病葉片中小麥白粉菌的檢測效果，以滅菌超純水為空白對照，以未接種小麥葉片為陰性對照。進行如下試驗設置：剪取感病品種‘Chanceller’第一葉中間部分3cm長，葉片正面朝上放在含苯并咪唑（50mg/L）的瓊脂保鮮培養基上，在超凈臺上收集預先繁殖好的新鮮分生孢子到無菌5mL的離心管中，參考史文琦等的方法進行接種，調整白粉菌菌株96224接種濃度為10～20個/mL，然后將培養皿置于17℃，L∥D=18h∥6h光照培養箱中培養。分別在接種后2、4、8、12、24、48、96．120h和144h取樣進行檢測。使用植物基因組DNA提取試劑盒（D3485-01，Omega Bio-Tek公司）提取小麥組織gDNA，將其作為模板進行LAMP反應。方法同1.4。

2結果與分析

2.1LAMP引物的設計與篩選

以小麥白粉菌菌株96224的DNA為模板，用設計的3套引物進行引物篩選，結果如圖1所示，只有引物Bgt-LAMP-1能夠擴增出明顯的梯狀條帶，其他引物均無條帶出現。加入鈣黃綠素熒光染液后，引物Bgt-LAMP-1反應液為綠色，其他引物的反應液為橙色，說明只有Bgt-LAMP-1可以用于后續特異性和靈敏性試驗。

2.2LAMP反應體系的特異性

為了驗證LAMP反應引物的特異性，對供試的11株小麥白粉菌菌株和8株對照菌株進行LAMP檢測。在紫外燈照射下，陽性反應均為綠色熒光，陰性反應和空白對照均不發熒光。11株小麥白粉菌菌株的檢測結果均為陽性，檢出率為100%，而8株對照菌株無論是專性寄生菌還是腐生菌的檢測結果均為陰性，沒有出現綠色熒光（圖2）。

2.3LAMP反應體系的靈敏度

如圖3所示，以提取的小麥白粉菌96224基因組DNA為模板，10倍梯度稀釋，進行LAMP反應。在紫外光照射下，陽性反應均為綠色熒光，陰性反應和空白對照均不發熒光。LAMP能檢測到濃度為300fg/uL的DNA。

2.4LAMP反應體系對小麥發病組織的檢測結果

提取接種小麥白粉菌2、4、8、12、24、48、96、120h和144h的小麥組織gDNA，進行LAMP反應后加入鈣黃綠素，在紫外燈照射下，接種4h及以上的小麥發病組織的LAMP反應為呈綠色的陽性反應（圖4）；說明該反應體系可準確從發病小麥葉片中檢測到小麥白粉菌，可檢測到小麥白粉菌的最早時間為侵染4h。

3結論與討論

本研究以小麥白粉菌專有的效應子基因BGT96224V316-LOCUS1725（Bgt-2014）篩選出Bgt-LAMP-1引物對并建立了小麥白粉菌LAMP檢測技術。所建立的體系特異性好，能與其他8種專性寄生菌有效區分，靈敏度達到300fg/UL，在接種后4h即可檢測出小麥白粉菌，而正常肉眼觀察到白粉病的癥狀一般在7d左右，所以該方法為田間白粉病菌的早期監測提供手段，為病害的防治提供科學依據。

預測預報技術是準確防控小麥白粉病，減少農藥使用和精準施用的關鍵。因此，開展小麥白粉病預測預報研究，對于科學防治小麥白粉病具有重要意義。分子檢測技術是預測預報的重要手段之一，可為精準的預測預報提供分子技術方案。目前已成功建立了普通PCR、巢式PCR和熒光定量PCR檢測小麥白粉病的方法，尚沒有文獻報道有關LAMP技術在小麥白粉病上的研究。LAMP檢測方法多數是以真菌通用ITS序列作為靶標，筆者前期根據小麥白粉病菌ITS序列設計的1對內引物和1對外引物建立的小麥白粉病菌LAMP檢測體系，不僅能夠檢測到小麥白粉病菌DNA基因組，同樣也能夠檢測到大麥、黃瓜和草莓等其他植物白粉病菌DNA基因組，特異性較差。而且ITS已被證明不足以區分白粉菌的種，而一些持家基因，如肌動蛋白（actin）基因，鈣調蛋白（calmodulin）基因，微小染色體維持蛋白（minichro-mosome maintenance）基因等，在解決這一問題上被證明具有重要的應用價值。本研究使用以小麥白粉菌特有的效應子基因BGT96224V316-LOCUS1725（Bgt-2014）全長序列設計篩選出Bgt-LAMP-1引物對，特異性較好，可用于建立小麥白粉病菌LAMP檢測體系。本研究的LAMP技術從接種小麥白粉菌2h的小麥葉片中未能檢測到陽性結果，分析原因可能是接種后2h這一階段仍是接種的分生孢子，接種孢子濃度過低所以檢測不到；小麥白粉菌分生孢子萌發需要4h左右，此時形成初生芽管并緩慢伸長，小麥葉片中小麥白粉菌的生物量增多達到檢測限，所以接種后4h可以檢測到。

本研究建立的小麥白粉菌LAMP檢測方法雖然簡便快速，但仍然很難用于田間地頭的現場檢測，主要是核酸提取過程需要特殊的儀器，例如必須使用離心機，并且步驟較多，所需時間較長。下一步將從DNA提取方面優化該檢測方法。目前正在嘗試使用Chelex-IOO提取小麥葉片的DNA，該方法加入堿提取液研磨后直接吸取上清液用于擴增反應，不使用離心機且提取時間僅為60min；目前使用的核酸染料鈣黃綠素是一種自發光熒光染料，在日光下可以自然發出黃綠熒光，方便觀察結果。經過以上的優化后，小麥白粉菌LAMP檢測方法將更加簡便快速，使基層的植保工作者能夠直接在田間地頭開展工作。