腸道微生物對骨質疏松大鼠/小鼠調節作用機制的研究進展

秦 銳，郭 剛，張世峰，郭 健*

1.蘭州大學第二醫院疼痛科，甘肅 蘭州 730030；2.蘭州大學第二醫院骨科，甘肅 蘭州 730030

腸道微生物群由胃腸道中的基因組成分、產物和微生物組成，具有較為穩定的種群結構，該微生物群數量龐大，種類繁多。腸道菌群對健康具有積極的影響，例如，腸道菌群會誘導產生免疫調節因子，這些因子能夠調節腸道炎癥反應、加強細胞保護、維持屏障完整性和穩態等。其中，有益細菌是保障腸道功能穩定性的必要菌群，維持腸道處于動態平衡狀態，起到儲備營養、提高免疫力、對抗腸道微環境改變等作用。但同時，機體功能受到飲食不當、藥物使用、細胞衰老、情緒焦慮等多種負面因素影響，導致腸道微生物群成分發生改變，人體內多項慢性疾病的發生風險增大，如糖尿病、肥胖、骨質疏松等[1]。腸道微生物會對宿主生理產生巨大影響，因此，以腸道微生物為目標靶點或診斷方向成為熱門的研究主題。骨質疏松（OP）是以骨強度和骨密度下降為標志的骨骼疾病，病因多為機體衰老、糖皮質激素干擾或雌激素缺乏，容易改變骨結構、增加骨脆性，同時還伴隨著劇烈疼痛、行為障礙，骨折發生的幾率大大提高。當前已有明確的報道指出腸道微生物群的變化會影響到骨密度和骨結構?！肮俏⑸飳W”是一門將骨骼生物學與微生物學相結合的學科，但目前仍需對關于腸道微生物如何調節骨質疏松的論題進行深入的研究。本文通過闡述腸道微生物對骨質疏松大鼠/小鼠調節作用機制問題，以期為如何使用益生菌預防骨質疏松提供新思路。

1 腸道菌群與骨質疏松的關系

骨健康是確保成骨細胞和破骨細胞在一定程度上保持動態平衡，使機體在從成長到逐漸衰老的過程中保持相對穩定的骨骼微環境。當破骨細胞生成速率高于成骨細胞的生成速率時，會導致骨質流失，造成骨質疏松。OP 可分為兩種形式：原發性或繼發性，其具體屬于哪種形式取決于它是作為自然衰老的過程(雌激素缺乏)還是疾病病理的過程。這兩種形式都是由骨重建過程中的不平衡引發的，骨吸收/形成量明顯低于骨丟失量，導致骨骼微環境發生變化。在OP 發生時，往往會表現出骨量低、骨小梁變薄、骨質流失等特征，骨折風險增大，嚴重性不可小覷。

腸道內細菌數量超過100 萬億，種類多達29 個細菌門。微生物群落的物種多樣性與健康息息相關，微生物群通過產生必需的營養物質，消化其他無法消化的食物成分，促進免疫系統的成熟，有益于宿主的身體健康。微生物群群落組成的不健康失衡，稱為生態失調，與多種代謝、炎癥、腸道屏障受損密切相關。一旦發生菌群失調，將會對機體造成嚴重的影響。腸道菌群是腸道中非常重要的穩態成分，腸道菌群失調可以顯著改變部分前體細胞活性，如巨噬細胞RAW264.7 等，該細胞能夠誘導分化為破骨細胞，最終導致破骨細胞數量增加，同時骨髓中CD4+T4細胞占比降低，輔助免疫作用減弱。Metzger 等[2]通過給小鼠口服有害菌，發現該菌群會引發小鼠腸道炎性病癥和骨質丟失。無菌小鼠的骨量均高于普通小鼠。Hathaway 等發現GF 小鼠比無特定病原體小鼠的骨密度高，將無特定病原體小鼠的腸道菌群移植給GF 小鼠，發現GF 小鼠骨密度下降。Li 等[3]發現對于由性類固醇誘導造成的小鼠骨丟失，GF 小鼠具有抵抗作用。

糖皮質激素（GCs）是一種有效的免疫調節藥物，具有顯著的副作用，包括由糖皮質激素引起的骨質疏松癥（GIO）。GCs 會直接誘導成骨細胞和骨細胞凋亡，也會改變腸道菌群組成。盡管已知腸道微生物群有助于調節骨密度，但其在GIO 中具體起著什么作用尚未被研究過。Jonathan 等為了測試其相關性，給雄性C57/Bl6J 小鼠使用糖皮質激素（潑尼松龍，GC-Tx）造模8 周，使小鼠成為GIO 小鼠，同時飼以廣譜抗生素，以耗盡微生物群，使得該小鼠骨小梁明顯丟失。用益生菌（路氏乳桿菌）補充調節腸道微生物，可防止骨小梁的丟失。這充分體現了腸道微生物群對GIO 的需求，長期ABX 預防了GC-Tx誘導的骨小梁丟失。微生物群分析結果表明，糖皮質激素治療改變了Verrucomicobiales 和Bacteriodales 門的豐度，隨機森林分析表明，不同類群之間卟啉單胞菌科和梭菌目操作分類單元（OTU）的豐度存在顯著差異。此外，將GC-Tx 小鼠的糞便移植給未經治療的野生型WT 小鼠會導致其骨丟失，說明微生物群對于GIO 的治療能夠改善骨丟失。

2 動物品系選擇

在腸道微生物與大鼠/小鼠骨質疏松之間的聯系的相關研究中，常用的大鼠品系為Wistar 大鼠和SD 大鼠。常用的小鼠品系較多，包含C57BL6 小鼠、CB6F1 小鼠、SAMP6 小鼠、SAMR1 小鼠、ICR 小鼠、無菌小鼠等。在特殊的實驗中，轉基因小鼠也可以被用作試驗模型，如純合子敲除護骨素基因小鼠，隨著鼠齡的增長OP 癥狀加強。其中，無菌小鼠憑借其自身無任何細菌、無任何病原微生物的優勢，在實驗中成為首選動物品系，但缺點是對飼養環境要求高，價格昂貴。

3 動物模型的制備

基于OP 發生的生理病理過程，常見的造模方式主要包括兩種，即原發性和繼發性OP 模型。其中原發性OP 模型造模方法主要包含雄鼠切除睪丸法、雌鼠切除卵巢法，大多數品系大/小鼠均可以使用該方法進行造模。繼發性OP 多由疾病發生、藥物干預等造成，包括常見的內分泌代謝OP 模型（鏈脲佐菌素+卵巢切除）和藥物性骨質疏松模型（糖皮質激素造模）等，通過上述造模過程，誘發OP。實驗室多用切除雙側卵巢誘發造模，其優點是造模手術操作簡單，死亡率低，造模成功率高。

4 常用益生菌調節骨質疏松方式和作用機制

益生菌的定義為含有活的非致病性微生物的膳食補充劑。其中，多種細菌作為有益的益生菌得到了廣泛應用，如腸球菌屬、雙歧桿菌、乳酸菌屬等，少數酵母菌也具有益生菌特性。益生菌具有如下特征：在胃腸道系統中生存（耐酸和膽酸）、表型和基因型穩定性、與黏膜表面的黏附性、抗生素耐藥性、抗菌物質的產生和抑制病原體的能力。此外，益生菌或其發酵產物不能對宿主產生危害，不得使用含有可傳播耐藥基因的細菌，除非對病原微生物進行誘導，引起免疫系統反應。研究表明補充益生菌對于骨組織微環境有潛在改善, 主要通過提升其數量和豐度來調節腸道酸堿度，影響其抗菌肽的分泌；通過增強宿主免疫功能和促進生成黏液來增強屏障功能, 但具體機制不詳。許多研究已經開始利用動物模型來研究益生菌是否可以用于預防原發性和繼發性骨質疏松性骨丟失。通過對原發性骨質疏松小鼠更年期（OVX）模型進行研究，發現添加多種不同的益生菌（羅伊氏乳桿菌ATCC 6475、副干酪乳桿菌（NTU 101）或植物乳桿菌（NTU 102）、鼠李糖乳桿菌GG、副干酪乳桿DSM13434、植物乳桿菌DSM 15312、DSM 1531 等），均能夠有效改善OVX 模型鼠骨質疏松病癥，骨體積分數、骨密度、骨小梁厚度和數量均明顯上調，與空白對照組小鼠指標水平相當；骨質中RANKL 蛋白、TRAP5 m、皮質骨RNARANKL/OPG 比值均減少，血清吸收標志物c 末端肽和尿鈣排泄分數也有所下降，而成骨細胞相關基因不變（見表1）。這些結果進一步為益生菌通過調節破骨細胞的吸收防止雌激素缺乏導致小鼠骨丟失的觀點提供了支持。在非益生菌組中相關指標無明顯變化，說明非益生菌無法改善OP。OVX 大鼠中股骨的成骨細胞減少但骨表面的破骨細胞增加。在對OVX 大鼠模型進行長雙歧桿菌治療16 周后，發現其骨密度增加，骨小梁數量增加、厚度也增加，破骨細胞受到抑制。這表明與小鼠OVX 模型類似，益生菌能夠有效調節大鼠OVX 模型中的破骨細胞[4]。

表1 益生菌/非益生菌與骨質疏松動物模型中的骨骼健康的作用機制

5 結論

骨質疏松是一種發生率極高的骨骼并發癥，鑒于此今后科研工作重心不僅要關注如何緩解骨質疏松，更需要重視對其的預防。益生菌能夠正向調節腸道微環境，維持腸道菌群穩定性，提高骨密度，增加骨小梁的數量。但如何提升益生菌的豐度和定植，提高菌群作用效率，減少有害菌的入侵，幫助預防骨質流失等問題仍需要進行進一步研究。