芍藥苷抑制子宮內膜癌遷移侵襲及其作用機制

肖慧 覃鴻恩 姚姿羽 周輝 馬榮河

作者單位：445000 恩施1恩施土家族苗族自治州中心醫院藥劑科；2湖北民族大學附屬民大醫院藥劑科

子宮內膜癌好發于絕經后的中老年婦女，易發生陰道不規則出血，臨床主張手術切除子宮、卵巢或輸卵管，并以化療進行輔助［1］。但對于中晚期子宮內膜癌患者，化療易耐藥，治療效果并不理想，晚期患者5年總生存率約為30%［2-3］。因此，尋找更安全有效的藥物和生物標志物對子宮內膜癌治療具有重要的臨床意義。芍藥苷（Paeoniflorin）是一類具有鎮痛、鎮靜、解痙、抗炎等多種活性作用的天然化合物［4］，同時也具有良好的抗腫瘤作用，在結直腸癌中發現其能抑制惡性腫瘤增殖和遷移［5-6］。然而，目前關于芍藥苷在子宮內膜癌中的藥理活性及其作用并未明確。本研究通過生物信息學分析以及體內和體外實驗觀察芍藥苷干預子宮內膜癌細胞對細胞增殖、遷移和侵襲的影響，并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人子宮內膜癌細胞株HEC108 和Ishikawa 分別購于上海傳秋生物科技有限公司，武漢普諾賽生命科技有限公司；芍藥苷標準品（純度：98%）購于上海純優生物科技有限公司；RPMI 1640 培養基購于上海經科化學科技有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（生產批號：PD-BCA-500）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒（生產批號：P0012A）購自北京伊塔生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（生產批號：C57-C0017-500）購于上海吉至生化科技有限公司；AURKA 和空載質粒購于上?？吕咨锟萍加邢薰?；基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（vimentin）、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、鋅指蛋白（Snail）、極光激酶A（aurora kinase A，AURKA）和Ki-67 多克隆抗體以及辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G（H+L）二抗購自上?？泼羯锟萍加邢薰?；ST-360型酶標儀購自上海晚成醫療器械有限公司。

1.2 生物信息學分析

利用TargetNet 和Swiss target prediction 在線數據庫預測芍藥苷靶基因后進行交叉分析，即得該藥物的可能作用靶點。利用UALCAN數據庫［7］（https：//ualcan.path.uab.edu/）分析芍藥苷的靶點在子宮內膜癌中的表達水平，并通過TCGA（版本：unc.edu_UCEC_IlluminaHiSeq_RNASeqV2.geneExp）在線數據庫下載子宮內膜癌的臨床樣本數據，比較靶基因在不同臨床病理特征間的表達情況。

1.3 細胞培養及分組

將HEC108和Ishikawa 細胞接種至含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液，在37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養，細胞為貼壁生長，胰酶消化液消化后傳代培養，取用對數生長期細胞進行實驗。

根據LipofectamineTM2000說明書將AURKA和空載質粒轉染至細胞（HEC108 和Ishikawa）中，實驗分組：對照組（Control 組/Vector 組，細胞不處理，即正常培養細胞）；AURKA 組（轉染AURKA 質粒），芍藥苷組（0.5 mg/mL 芍藥苷處理細胞），芍藥苷+ AURKA 組（0.5 mg/mL 芍藥苷處理細胞并轉染AURKA 質粒），轉染48 h 后收集各組細胞，采用Western blot檢測AURKA蛋白水平，以評估轉染效率。

1.4 CCK-8實驗檢測細胞活性

HEC108 和Ishikawa 細胞消化離心重懸，以密度為5×103個/孔接種于96 孔板。將細胞置于培養箱進行培養24 h，以不同濃度芍藥苷（0、0.5、1.0、2.0 mg/mL）作用于細胞，分別于0、24、48、72、96 h 對細胞增殖活性進行檢測。每孔加入10μL CCK-8 溶液于37 ℃環境中繼續孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm 的吸光度，以各組吸光度的平均值反映細胞增殖活性。

1.5 CCK-8實驗檢測細胞增殖能力

將HEC108和Ishikawa細胞以密度為5×103個/孔接種于96 孔板。分別于0、24、48、72、96、120、144 h對細胞增殖能力進行檢測。每孔加入10μL CCK-8溶液于37 ℃環境中繼續孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度值，根據吸光度值繪制細胞生長曲線。

1.6 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力

遷移實驗：在24孔板中，將密度為5×104個/mL 的細胞懸液接種于不含Matrigel基質膠的Transwell小室上層，下層添加含10%胎牛血清的培養液，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養12 h，去除Transwell 小室并吸棄24 孔板中的培養液，4%多聚甲醛固定10 min，結晶紫染色15 min，用PBS 洗3 次，用無菌棉簽移除未遷移細胞，在倒置顯微鏡下觀察，拍照統計細胞數量。侵襲實驗：將細胞懸液接種于內鋪Matrigel 基質膠的Transwell小室上層，下層添加含10%胎牛血清的培養液，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養48 h，其余步驟同遷移實驗。

1.7 LDH活性檢測

將HEC108 和Ishikawa 細胞接種于6 孔板（細胞濃度為2×105個/mL），加入0.5 mg/mL 濃度的芍藥苷2 mL，消化離心，加入裂解液后再離心取上清液。按照LDH試劑盒說明書中的操作步驟分別進行加樣后，用酶聯免疫檢測儀在波長為440 nm時測定光密度（OD）值，計算出LDH活性。

1.8 裸鼠移植瘤實驗檢測瘤體生長

8 周齡健康雌性C57BL/6 裸鼠16 只，體質量（22±2）g，購自湖北省實驗動物研究中心，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。所有小鼠均在標準環境中飼養，并自由采食飲水。將Control組、芍藥苷組對數生長期的子宮內膜癌細胞HEC108 重懸，接種于裸鼠腋下脂肪墊，每組8只。每隔1 d 經皮下注射1 次藥物質量濃度為50 mg/mL 的芍藥苷溶液，每天1 次，共2 周。待成瘤后，每2 d 測量一次瘤體體積。成瘤第14 天后處死所有裸鼠，取出瘤體測量瘤體體積及重量。所有實驗動物均遵循3R 原則，經湖北民族大學附屬民大醫院動物實驗倫理審查通過（審批號：KEH20220805）。

1.9 免疫組化染色檢測腫瘤組織中Ki-67的表達水平

處死裸鼠后取出腫瘤組織，常規包埋切片，用PBS 沖洗3 次，每次5 min；微波修復15 min，切片用過氧化酶抑制劑室溫處理10 min，PBS 沖洗3 次，每次3 min；滴加CBL 抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜；PBS 沖洗3次，每次3 min；滴加HRP-羊抗小鼠IgG，室溫孵育10 min；PBS充分淋洗后，滴加H2O2-DAB顯色液顯色；復染，脫水透明，封片。陰性對照用PBS 代替一抗。在顯微鏡下觀察，拍照。

1.10 Western blot檢測蛋白表達

收集各組對數生長期的HEC108 和Ishikawa 細胞，Control 組和芍藥苷組加入SDS 上樣緩沖液，沸水浴中煮沸10 min，電泳后轉至PVDF膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。加入用封閉液稀釋的抗體（1∶5 000），4 ℃孵育過夜。次日PBST洗滌6 min，重復3 次，然后加入封閉液稀釋的HRP標記的羊抗兔二抗（1∶1 000），室溫孵育60 min，PBST 洗滌6 min，重復3 次，ECL 化學發光液進行顯影，以β-actin 作為內參，利用BCA 蛋白檢測試劑檢測蛋白濃度。

1.11 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件分析數據，計量資料用均數±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，采用單因素方差分析各組細胞增殖、遷移和侵襲的差異，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。采用Kaplan-Meier法分析患者總生存期（從確診為惡性腫瘤至因任何原因引起死亡的時間）和無病生存期（從治療開始至腫瘤復發或因任何原因死亡的時間），生存率差異比較采用log-rank檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 芍藥苷靶基因及其與子宮內膜癌臨床不良表型之間關系

通過網絡藥理學分析得到芍藥苷的41 個作用靶點。UALCAN 在線分析顯示有29 個基因表達上調。TCGA數據庫分析結果顯示，在這29個基因中，有2個基因的表達水平與子宮內膜癌的總生存期相關，且只有AURKA與腫瘤分期相關（圖1A），因此選擇AURKA進行后續研究。

圖1 芍藥苷的靶基因AURKA及其與子宮內膜癌臨床特征的關系Fig.1 Paeoniflorin target gene AURKA and its relationship with clinical features of endometrial carcinoma

TCGA數據庫結果顯示，AURKA 在子宮內膜癌組織中的表達明顯高于癌旁組織（圖1B，P=0.002），亞組分析顯示臨床分期Ⅰ期以及Ⅱ-Ⅳ期的子宮內膜癌組織中AURKA 表達均高于癌旁組織（圖1C，P=0.001），預后不良患者中AURKA 表達高于預后良好患者（圖1D，P=0.003），復發患者中AURKA的表達高于非復發患者（圖1E，P=0.009），G3～4分級的子宮內膜癌組織中AURKA表達高于G1～2分級患者（圖1F，P=0.005）。生存分析顯示，AURKA高表達患者的總生存期和無病生存期均小于AURKA 低表達患者（圖1G～H，P=0.006、0.004）。

2.2 芍藥苷體外抑制子宮內膜癌細胞增殖

CCK-8 檢測顯示，不同濃度芍藥苷（0.5、1.0、2.0 mg/mL）作用于HEC108和Ishikawa細胞72 h后，與對照組相比，芍藥苷可以顯著提高細胞抑制率且呈濃度依賴性（圖2A～B，P=0.011、0.015）。72 h時，0.5 mg/mL濃度芍藥苷作用于HEC108 和Ishikawa 細胞，其細胞抑制率基本達50%，因此選擇0.5 mg/mL 濃度的芍藥苷處理細胞進行體外功能實驗。0.5 mg/mL 濃度芍藥苷作用于HEC108和Ishikawa 細胞后，細胞增殖活性低于Control組（圖2C～D，P=0.015、0.019）；LDH 活性高于Control 組（圖2E，P=0.008、0.012），Ki-67 蛋白表達水平低于Control組（圖2F，P=0.010、0.013）。

圖2 芍藥苷抑制子宮內膜癌HEC108和Ishikawa細胞增殖Fig.2 Paeoniflorin inhibited the proliferation of HEC108 and Ishikawa cells

2.3 芍藥苷抑制子宮內膜癌細胞遷移、侵襲和EMT

Transwell 實驗結果顯示，0.5 mg/mL 濃度芍藥苷作用于HEC108 和Ishikawa 細胞后，芍藥苷組遷移細胞數低于Control組（圖3A，P=0.032、0.039），侵襲細胞數也低于Control 組（圖3B，P=0.023、0.025）。Western blot 實驗結果（圖3C）顯示，與Control 組相比，芍藥苷組細胞中MMP2（P=0.027、0.029）、MMP9（P=0.031、0.032）蛋白表達水平均降低。另外，與Control 組相比，芍藥苷組細胞中Vimentin（P=0.022、0.024）、N-cadherin（P=0.023、0.025）、Snail（P=0.026、0.028）蛋白表達水平均降低，而E-cadherin（P=0.021、0.019）蛋白水平升高，見圖3D。

圖3 芍藥苷抑制子宮內膜癌細胞遷移、侵襲和EMT Fig.3 Paeoniflorin inhibited migration, invasion and EMT of endometrial cancer cells

2.4 芍藥苷體內抑制子宮內膜癌細胞增殖

裸鼠建模完成后均未出現意外死亡現象，所有移植瘤瘤體表面皮膚完整，無破潰缺損。裸鼠移植瘤實驗2周后成瘤，而且隨著時間的推移，移植瘤體積不斷增大，但是芍藥苷組增長速度明顯小于對照組（圖4A，P=0.021），移植瘤體積和重量小于對照組（圖4B～C，P=0.003、0.006）。免疫組織化學結果顯示，芍藥苷組中Ki-67 相對表達量低于對照組（圖4D，P=0.012）。

圖4 芍藥苷體內抑制子宮內膜癌細胞增殖Fig.4 Paeoniflorin inhibited proliferation of endometrial cancer cells in vivo

2.5 不同濃度芍藥苷對AURKA蛋白表達的影響

Western blot 檢測結果顯示，隨著芍藥苷濃度增加，HEC108和Ishikawa 細胞中AURKA蛋白表達逐漸減少，呈濃度依賴性（圖5A，P=0.001、0.003）；隨著芍藥苷作用時間的增加，HEC108 和Ishikawa 細胞中AURKA 蛋白表達逐漸減少，呈時間依賴性（圖5B，P=0.004、0.005）；AURKA 組中AURKA 蛋白表達水平高于Vector 組（圖5C，P=0.011、0.014）。細胞增殖實驗顯示，HEC108和Ishikawa 細胞中，AURKA組的OD 值明顯高于Vector 組（圖5D～E，P=0.014、0.018）。AURKA 組細胞LDH 活性低于對Vector 組（圖5F，P=0.024、0.027）。

圖5 AURKA促進子宮內膜癌細胞增殖Fig.5 AURKA promoted proliferation of endometrial cancer cells

2.6 芍藥苷通過AURKA抑制子宮內膜癌細胞增殖

Western blot 實驗結果顯示（圖6A），與對照組相比，HEC108 和Ishikawa 細胞中AURKA 組的AURKA蛋白表達增加（P=0.016、0.019）；與AURKA 組相比，芍藥苷組中AURKA 蛋白表達減少（P=0.020、0.022）；與芍藥苷組相比，芍藥苷+AURKA 組中AURKA 蛋白表達增加（P=0.002、0.006）。細胞增殖實驗顯示（圖6B～C），與對照組相比，AURKA 組中細胞活性增加（P=0.005、0.008）；與AURKA 組相比，芍藥苷組中細胞活性減少（P=0.006、0.007）；與芍藥苷組相比，芍藥苷+AURKA 組中細胞活性增加（P=0.009、0.012）。LDH 活性檢測實驗結果顯示（圖6D），與對照組相比，AURKA組中LDH活性減少（P=0.018、0.020）；與AURKA組相比，芍藥苷組中LDH 活性增加（P=0.004、0.006）；與芍藥苷組相比，芍藥苷+AURKA 組中LDH 活性減少（P=0.007、0.009）。

圖6 芍藥苷通過AURKA抑制子宮內膜癌細胞增殖Fig.6 Paeoniflorin inhibited the proliferation of endometrial cancer through AURKA

3 討論

本研究采用不同濃度的芍藥苷作用子宮內膜癌細胞，觀察其對子宮內膜癌細胞活力的影響并篩選出合適濃度的芍藥苷進行后續功能試驗。研究結果顯示，不同濃度的芍藥苷作用子宮內膜癌細胞，其細胞存活率均明顯下降，且濃度越大，細胞存活率越低，呈濃度依賴趨勢。有研究［8］采用芍藥苷處理人子宮內膜癌細胞系RL95-2 后發現其對細胞有明顯抑制作用，且呈劑量和時間依賴性，這與本研究結果部分相同，說明芍藥苷可能以濃度依賴性的方式抑制子宮內膜癌細胞增殖。體外功能實驗顯示，經芍藥苷處理后的細胞活力降低，LDH 活性升高，Ki-67 蛋白水平降低。本研究結果提示芍藥苷干預子宮內膜癌細胞可明顯抑制細胞活力和調節LDH活性。

裸鼠移植瘤實驗進一步支持芍藥苷對子宮內膜癌細胞增殖的抑制作用，本研究發現經芍藥苷干預裸鼠后，芍藥苷組移植瘤體積和重量均小于對照組，裸鼠移植瘤組織中Ki-67蛋白表達也低于對照組。既往研究已證實，腫瘤細胞中Ki-67 增高往往反映腫瘤細胞的增殖活性增強［9］，說明芍藥苷抑制了裸鼠移植瘤生長。同時本研究還通過生物信息學分析芍藥苷的作用靶點，發現并驗證了AURKA 與子宮內膜癌臨床不良表型有關?；诖?，本研究進一步通過體外細胞實驗進行驗證芍藥苷是否通過靶向調節AURKA 進而影響子宮內膜癌生物學行為，結果發現隨著芍藥苷濃度和時間的增加，AURKA 蛋白表達逐漸減少，呈濃度和時間依賴性，且AURKA 高表達可促進腫瘤細胞增殖，降低LDH 活性，提示AURKA 可以濃度和時間依賴性的方式促進腫瘤細胞增殖；將AURKA 質粒轉染至子宮內膜癌細胞，發現芍藥苷可以通過下調AURKA蛋白表達抑制子宮內膜癌細胞增殖和增加LDH活性。

本研究還發現，經芍藥苷干預子宮內膜癌細胞后細胞遷移和侵襲能力被抑制；并且細胞中MMP2、MMP9、Vimentin、N-cadherin、Snail 蛋白水平降低，E-cadherin 蛋白水平升高。MMP9 與腫瘤侵襲轉移有關，MMP2 也能促進腫瘤細胞遷移［10］。MMP9 和MMP2 是一種基質金屬蛋白酶，可以靶向許多胞外蛋白，能降解Ⅳ型膠原蛋白等細胞外基質，從多方面、多層次參與腫瘤進展的機制及通路調控，目前已被發現與直腸癌、膀胱癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等腫瘤進展密切相關［11-12］。EMT 是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程。通過EMT，上皮細胞失去了細胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質的能力等間質表型［13-14］。N-cadherin屬于Ⅰ類鈣黏蛋白，其表達上調與細胞增殖遷移呈正相關；E-cadherin 也是在上皮細胞膜表達的跨膜糖蛋白，能夠介導上皮細胞間的黏附連接，對維持正常上皮細胞形態和結構完整具有重要作用［15-17］。為了探索芍藥苷抑制子宮內膜癌轉移的作用機制，本研究從EMT出發，觀察芍藥苷對子宮內膜癌細胞中EMT 相關蛋白Vimentin、N-cadherin、Snail 和E-cadherin 表達的影響，研究結果說明芍藥苷可能通靶向AURKA 的方式調節子宮內膜癌細胞EMT 相關蛋白表達，抑制EMT發生，進而抑制腫瘤增殖、侵襲和遷移。

綜上所述，本研究初步發現芍藥苷可以降低子宮內膜癌細胞增殖、遷移和侵襲能力，抑制EMT，下調MMP2 和MMP9 蛋白表達，且其作用機制可能與下調AURKA 表達有關，說明芍藥苷可能是子宮內膜癌潛在的治療藥物，而靶向AURKA 為研究子宮內膜癌治療提供了新的途徑。