南疆棉桿黃腐酸制備及對土壤性質的影響

陸淑芬 胡紹啟 嚴成旭 時春輝*

1 新疆生產建設兵團第一師環境監測站 阿拉爾 843300

2 塔里木大學化學化工學院 阿拉爾 843300

本試驗對新疆棉桿中生化黃腐酸的提取進行了探究。經閱讀國內外相關文獻報道，發酵法與硝解法均可以作為制備生化黃腐酸的方法，由于發酵法較硝解法具有更環保、更綠色的優勢，通過比較，本文選用微生物發酵法制備生化黃腐酸，硝解法作為對照試驗。試驗中探尋了發酵法對新疆棉桿中生化黃腐酸的提取，總結得出了發酵法對應的最佳提取條件，并對提取的生化黃腐酸進行了實際應用，總結得出了生化黃腐酸對土壤多方面性質的影響，以期為棉桿中生化黃腐酸的制備及其在土壤改良方面的應用提供合理的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

棉桿取自于距離塔里木大學北門外2 公里處隸屬十團的商用棉花地；新疆維吾爾自治區阿拉爾市周邊的農田土壤（以下簡稱新疆土壤）、湖北省恩施苗族土家族自治州利川市團堡鎮周邊的農田土壤（以下簡稱湖北土壤）、甘肅省隴南市武都區隆興鎮周邊的農田土壤（以下簡稱甘肅土壤）、四川省米易縣白馬鎮黃草回族村十四社周邊的農田土壤（以下簡稱四川土壤）。

電熱恒溫培養箱DHP-9162（上海善志儀器設備有限公司）、紫外-可見分光光度儀UV1700PC（上海奧析科學儀器有限公司）、FTIR-紅外光譜儀LP-FTIR-300（智南精工儀器工廠）、臺式離心機TDL80-2B9（上海安亭科學儀器廠）、數顯恒溫水浴鍋HH-1（上海梅香儀器有限公司）、pH 計E-201F（雷磁凱利玻儀器有限公司）。鄰菲羅啉，分析純（AR）（上海山浦化工有限公司）；硝酸，分析純（AR）（天津致遠化學試劑有限公司）；生化黃腐酸標樣，分析純（AR）（上海阿拉丁控股集團）。

主要菌種：芽孢桿菌（BacillusC.）、木霉菌（Trichoderma sppP.）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeH.），均由河南沃寶生物科技有限公司生產。

1.2 試驗設計

1.2.1 生化黃腐酸的形成

本研究先采用發酵法將棉桿發酵成富含生化腐植酸的發酵物，在棉花進行機械采摘過程后，截取根部以上棉桿，除去殘留葉片與花苞。修剪棉桿至5 ～8 cm 小段，使用鼓風干燥箱在60 ℃恒溫烘干。烘干后剪碎并用粉碎機粉碎，過40 目篩[1]，得到棉桿粉末。取粉碎好的棉桿50 g 置于培養皿中，菌種采用芽孢桿菌、木霉菌、釀酒酵母的混合菌種，其用量比例為2 ∶1 ∶2，菌種活化采用混合菌種20 g、玉米粉40 g、超凈水200 mL，30 ℃恒溫培養3 d，取懸液。每一份樣品取5 mL 菌液，用超凈水調節棉桿粉含水量至60%～70%，置于恒溫培養箱中分別在不同的溫度梯度下以及不同的發酵時間梯度下進行恒溫發酵。

1.2.2 生化黃腐酸的提取及收率測定

發酵后的提取過程采用堿溶酸析法[2，3]，生化黃腐酸粗品利用容量法測定，其中黃腐酸收率的計算公式如下[4]：

式中，V1——樣品消耗硫酸亞鐵銨標準滴定溶液的體積，mL；V0——空白對照消耗硫酸亞鐵銨標準滴定溶液體積，mL；K——不同黃腐酸來源碳系數，本次試驗黃腐酸碳系數為0.49[4]；c——硫酸亞鐵銨標準滴定溶液濃度，mol/L；m——試樣質量，g；x——生化黃腐酸收率，%。

1.2.3 生化黃腐酸的紫外定性分析

本研究采用紫外-可見分光光度儀測量樣品黃腐酸的吸光度。將此次研究所得到的不同條件下的黃腐酸溶于0.05 mol/L 的碳酸氫鈉溶液中，配成濃度為100 mg/L 的溶液，用紫外-可見分光光度儀，在波長為190 ～350 nm 下測定出黃腐酸的相應吸光度，以探究制備的棉桿黃腐酸和標準品性質是否相同。

1.2.4 生化黃腐酸E4/E6測定及紅外測定

將此次研究所得到的不同條件下的黃腐酸溶于0.05 mol/L 的碳酸氫鈉溶液中，配成濃度為100 mg/L 的溶液在紫外- 可見分光光度儀上對比465 nm（E4）和665 nm（E6）吸光度，以探究生化黃腐酸的縮合程度和芳構化程度。另外，通過紅外吸收光譜的測定分析，以探究所得產品出現的芳香化結構及共軛結構。

1.2.5 對初始土壤性質的測定

將取回的土壤去除其中的枯枝、根系、殘留物等雜質，研磨后過2 mm 篩裝入密封袋中備用。采用烘干法測定每種土壤的含水量，先稱取10 g土壤，將土壤裝入試管中放入140 ℃的烘箱內烘干4 h，稱量剩余土壤的重量，濕重與干重的差值即為土壤含水量；取25 mL 1 mol/L KCl 溶液，加入質量比為1 ∶5 的土壤，搖勻，靜置30 min 后，用pH 計測定浸出液pH 值，即為土壤pH 值。

1.2.6 利用生化黃腐酸培養土壤的方法

將4 種土壤每組分別稱取100 g 于燒杯中，每類土壤共稱取7 組。每組土壤中依次加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g 生化黃腐酸，將生化黃腐酸與土壤充分攪拌，混合均勻，然后將燒杯放置在室溫、通風的條件下模擬自然環境進行培養，培養40 d。培養完成后，再測定土壤各項指標變化。

1.2.7 探究生化黃腐酸對土壤飽和導水率的影響

土壤飽和導水率系在單位水壓梯度下，通過垂直于水流方向的單位土壤截面積的水流速度，又稱土壤滲透系數。本法可在田間進行測定，但易受下層土體性質的影響。在飽和水分的土壤中，土壤的飽和導水率（滲透系數）是根據達西（H. Darcy）定律，在預定時間將滲透筒取出，掛在適當位置，漏斗下接一燒杯。在滲透筒在上部加8 cm 深的土層，在土層上方加入蒸餾水使之一直保持水層深度為10 cm，待漏斗下面滴下第1 滴水時開始用秒表計時，記錄30 min 每種土樣的滲水量并分別用量筒計量滲透過水量Q1、Q2、Q3……Qn。試驗所用的土壤在培養土樣40 d[5]之后，測定土壤飽和導水率變化情況。其中，生化黃腐酸對土壤飽和導水率的影響采用滲透筒法進行探究，按下式進行計算[6，7]。

式中，Q——流量，滲透過一定截面積S（cm2）的水量，mL；L——飽和土層厚度，滲透經過的距離，cm；S——滲透筒的橫截面積，cm2；t——滲透過水量Q時所需的時間，s；h——水層厚度，水頭（水位差），cm；K——飽和導水率（滲透系數），cm/s。

1.2.8 探究生化黃腐酸對土壤飽和含水量的影響

土壤飽和含水量是指在自然條件下，土壤孔隙全部充滿水分時的含水量，包括毛管孔隙和非毛管孔隙含水量。它代表土壤最大容水能力，也就是土壤顆粒間所有孔隙都充滿水時的含水量[8]。首先稱量含水土樣的質量，然后稱量去除水分后的土樣質量，將土樣分批次放入120 ℃的烘箱中烘干6 h 除去土樣中的結合水，取10 g 干土于透明玻璃管中，裝柱后向土柱中滴加蒸餾水，待土柱下方第1 滴液體流出時停止滴加，靜止10 min 土柱，稱量濕土重量。濕土質量減去干土質量，即為土樣飽和含水量。

2 結果與分析

2.1 處理時間對生化黃腐酸收率的影響

發酵試驗中通過改變發酵時間進行單因素試驗。隨著發酵時間的延長，生化黃腐酸收率增加，含量在10 ～15 d 出現最高區間。從圖1 可觀察出15 d 發酵出的生化黃腐酸最多；5 d 生化黃腐酸提取量過少是由于發酵時間過短導致發酵不完全；而20 d 生化黃腐酸含量低可能是由于缺氧導致其他微生物生長，在20 d 培養皿中可以明顯觀察到綠色和白色的菌絲。通過改變提取時間，進行單因素試驗。由圖2 可知，1.5 h 的提取結果明顯量少，2.5 h、3 h的收率并沒有很大的差距。綜合因素考慮，提取時間為2 h 在試驗中成果最佳。

圖1 發酵時間對生化黃腐酸收率的影響Fig.1 Eff ects of fermentation time on the yield of biochemical fulvic acid

圖2 提取時間對生化黃腐酸收率的影響Fig.2 Eff ects of extraction time on the yield of biochemical fulvic acid

2.2 處理溫度對生化黃腐酸收率的影響

發酵試驗中在不同恒溫培養箱設置不同溫度進行有氧發酵，由圖3 可知，發酵溫度在35 ℃時，生化黃腐酸收率最高。25 ℃、40 ℃生化黃腐酸收率偏低，25 ℃可能是由于發酵溫度不在菌種適宜的發酵溫度區間，導致雜菌占據主導。通過改變提取溫度，進行單因素試驗。不同提取溫度單因素試驗結果如圖4 所示，提取溫度愈高，生化黃腐酸收率愈大。65 ℃條件下收率突然降低，這種情況可能由于堿熱浸提溫度過高導致還未發酵的纖維或其他雜質被分解成小于過濾袋縫隙的物質，隨著濾液一起被提取。隨后酸析過程中轉變為鹽類，混入酸液中一起被烘干導致。綜合因素考慮，提取溫度60 ℃在試驗成果中最佳。

圖3 發酵溫度對生化黃腐酸收率的影響Fig.3 Eff ects of fermentation temperature on the yield of biochemical fulvic acid

圖4 提取溫度對生化黃腐酸收率的影響Fig.4 Eff ects of extraction temperature on the yield of biochemical fulvic acid

2.3 正交試驗結果分析

考慮到發酵法中不同發酵溫度、發酵時間、提取溫度及提取時間對結果的影響不同，本研究通過SPSS（23 版）設置4 因素4 水平正交試驗表（表1），采用正交試驗進行篩選。結果及直觀分析見表2，由極差分析可知4 個因素的影響大小為：發酵溫度>提取時間>發酵時間>提取溫度，通過方差分析，反應各因素之間的顯著性差異，方差分析如表3所示，分析結果表明：4種因素中發酵溫度顯著；提取時間、發酵時間與提取溫度不顯著。通過正交試驗設計得出提取的最佳因素為：發酵溫度35 ℃、發酵時間15 d、提取溫度50 ℃、提取時間2 h，且最佳因素條件下生化黃腐酸的收率為40.39%。

表1 制備生化黃腐酸因素水平表Tab.1 Factor levels of biochemical fulvic acid preparation

表2 制備生化黃腐酸正交試驗結果及分析Tab.2 Orthogonal experimental results and analysis of biochemical fulvic acid preparation

表3 制備生化黃腐酸收率的方差分析（α=0.05）Tab.3 Analysis of variance for the yield of biochemical fulvic acid preparation（α=0.05)

2.4 紅外光譜分析

圖5 為最優制備條件下生化黃腐酸與標樣的紅外光譜圖，樣品對比生化黃腐酸標樣可以看出，紅外峰形基本一致，這表明樣品與黃腐酸標樣的結構大致相同；2 種物質在3500 ～2500 cm-1出現明顯羥基吸收峰，說明兩者具有類似的羥基結構；在1622 cm-1處出現了羰基的伸縮振動峰，而羰基的峰小于1700 cm-1說明樣品可能存在共軛作用，表現出生化黃腐酸的特性之一。在1034 cm-1都出現醇的碳氧單鍵的伸縮振動，在1379 cm-1出現脂肪族中的甲基吸收峰。由圖可知，2 種物質雖然在光譜中有細微差異，峰形結構基本一致，表明該試驗制得的物質為生化黃腐酸。

圖5 生化黃腐酸樣品與黃腐酸標樣的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of biochemical fulvic acid and standard fulvic acid

2.5 紫外-可見吸收光譜分析

生化黃腐酸是由多種化學性質相近的物質組成的混合物，含有大量不飽和烴的共軛結構、羧類以及一些具有芳香性的化合物。這些官能團在紫外-可見光區域都有吸收值。本研究測量在190 ～350 nm 波長下的紫外-可見光譜數據，測量時設置波長10 nm 為間隔測試生化黃腐酸的紫外吸收峰值。由圖6 可知，黃腐酸標樣與最優條件下所制得的生化黃腐酸的紫外-可見光譜變化趨勢基本一致。2 份樣品在波長為210 nm 左右呈現一個最高峰值，隨后則是隨著波長增加吸收度不斷減少，發現研究所制取的樣品與標品中結構類似，為同一物質。

圖6 生化黃腐酸樣品與標樣黃腐酸的紫外-可見吸收光譜圖Fig.6 UV absorption spectra of biochemical fulvic acid and standard fulvic acid

2.6 E4/E6 比值分析

E4/E6即生化黃腐酸在465 nm 和665 nm 的吸光度值的比值，該比值能表征生化黃腐酸的基本特征、能表示出生化黃腐酸的縮合程度和芳構化程度，測試結果見表4。發酵法制得的生化黃腐酸發酵時間5 d 與20 d 的E4/E6值明顯小于10 d 及15 d 的樣品。10 d、15 d 樣品的E4/E6值無較大差異，標樣的E4/E6值略小于發酵法制得的生化黃腐酸樣品。說明標樣的芳構化程度大于發酵法制得生化黃腐酸樣品，分子量同樣大于制得的樣品。

表4 不同時間變量下發酵法制得的生化黃腐酸與標樣的E4/E6 值變化Tab.4 Changes in E4/E6 values of biochemical fulvic acid obtained by fermentation method and standard samples under diff erent time variables

2.7 對初始土壤含水量、pH 值測定及土壤種類劃分

試驗結果（表5）與我國土壤系統分類結合可知，試驗采用的新疆土壤為砂質土、湖北土壤為壤土、甘肅土壤為砂質土、四川的土壤為壤土。

2.8 生化黃腐酸對土壤含水量的影響

在各組土樣培養40 d 后，將所有土樣補水至100 g，每2 d 記錄一次土樣剩余質量，共記錄20 d即10 組數據（圖7）。結果表明：隨著生化黃腐酸的加入量增大，土樣的含水量也會隨之上升，這可能是由于生化黃腐酸是一種大分子多官能團結構，能吸附土樣中的水，以減緩土樣中水的蒸發。

圖7 不同土樣含水量的變化Fig.7 Changes in water content of diff erent soils

2.9 生化黃腐酸對土壤飽和含水量的影響

隨著最優條件下制備的生化黃腐酸的加入，4種土壤的飽和含水量均有所提高，其中對四川土壤的影響最大，對新疆土壤的影響最?。▓D8）。結果表明：生化黃腐酸可使土壤飽和含水量增大。

圖8 不同生化黃腐酸加入量對土壤飽和含水量的影響Fig.8 Eff ects of diff erent additions of biochemical fulvic acid on soil saturated water content

2.10 生化黃腐酸對飽和導水率的影響

隨著最優條件下制備的生化黃腐酸的加入，4種土壤的飽和導水率均呈上升趨勢，而且加入量越多，土壤的飽和導水率也提升得越多（圖9）。其中，對甘肅土壤飽和導水率的提升效果最為明顯，當加入量達到1.5 g 時，甘肅土壤的飽和導水率明顯上升；而對新疆土壤飽和導水率的提升效果最小。結果表明：生化黃腐酸能夠增加土壤的飽和導水率。

圖9 不同生化黃腐酸加入量對土壤飽和導水率的影響Fig.9 Eff ects of diff erent additions of biochemical fulvic acid on soil saturated hydraulic conductivity

2.11 生化黃腐酸對土壤pH 值的影響

每種、每組土壤均采用100 g，分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g 生化黃腐酸，以探究添加不同比例生化黃腐酸對土壤pH 值的影響。

如圖10 所示，新疆土壤具有偏堿性，生化黃腐酸本身是弱酸，二者發生酸堿中和反應，降低了新疆土壤的pH 值，使之趨于中性；相較于新疆土壤的偏堿性，其余3 種土壤具有弱酸性，而提取的生化黃腐酸中含有一定量的生化黃腐酸鹽，具有弱堿性，與3 種酸性土壤發生了酸堿中和反應，升高了土壤的pH 值，使之趨于中性。由此說明，生化黃腐酸及其鹽組成了酸堿緩沖體系[9]。

圖10 不同生化黃腐酸加入量對土壤pH 值的影響Fig.10 Eff ects of diff erent additions of biochemical fulvic acid on soil pH value

3 結論

（1）在利用發酵法提取生化黃腐酸的試驗中，通過單因素變量試驗得出，發酵時間單因素變量試驗最佳條件為15 d，發酵溫度單因素變量試驗最佳條件為35 ℃，提取時間單因素試驗變量最佳條件為2 h，提取溫度單因素變量試驗最佳條件為60 ℃。正交試驗結果如下，制備生化黃腐酸的最佳條件為發酵溫度35 ℃、發酵時間15 d、提取溫度50 ℃、提取時間2 h，收率40.39%。通過極差分析得出因素對試驗影響大小排序為：發酵溫度>提取時間>發酵時間>提取溫度。

（2）在利用生化黃腐酸改良土壤性質的試驗中得知：隨著生化黃腐酸加入量的增加，土壤的含水量會增加，加入量為1.5 g 之前含水量變化較為顯著，同時也增大了土壤的最大容水能力；加入量繼續增加后，含水量變化不明顯。隨著生化黃腐酸加入量的增大，土樣的飽和導水率也會隨之增加，出現這種情況考慮是由于生化黃腐酸的結構有利于形成多孔的土壤團聚體，從而增大了土壤的飽和導水率。生化黃腐酸本身是弱酸，可降低堿性土壤的pH 值；生化黃腐酸鹽用于酸性土壤，發生酸堿中和反應，升高了土壤pH 值。由此，生化黃腐酸及其鹽組成了酸堿緩沖體系。