腐植酸豆粕發酵活性肽在海刺參、基圍蝦、藍子魚生態養殖模式中的應用研究

薛德林 劉志國 關 蕾 索艷麗 孫向陽 潘華奇 胡江春

1 中國科學院沈陽應用生態研究所 沈陽 110016

2 遼寧威蘭生物技術有限責任公司 沈陽 110022

3 大連翔華生物技術有限公司 大連 116222

腐植酸作為一種飼料添加劑，使用方便，價格低廉，同時具有特殊的功效和作用，是一種具有廣闊應用前景的天然綠色飼料添加劑[1]。在豆粕發酵中添加腐植酸具有1+1≥2 的效果[2]。利用腐植酸的螯合特性能降解水體中毒素，抑制細菌、病毒，激活池水，調節pH 值，補充水體養分，吸附和分解氨氮、硫化氫、亞硝酸鹽等有毒有害物質；利用其絡合特性能夠調水、凈水，絡合重金屬處理渾濁、泛底、死藻、油膜、泡沫等水質情況；利用其物理特性能夠遮光，控制青苔生長，調整菌相、藻相和水色并改良底質泥土；利用其收斂特性能夠調理海刺參腸胃，緩解白便，緩解中毒性腸炎、物理性腸炎等病癥[1]。

近年來，在海產品養殖中，海刺參和基圍蝦是經濟效益最佳的養殖品種。本試驗針對一種創新型的腐植酸豆粕發酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌與海刺參、基圍蝦、藍子魚混套養模式[2]，研究和分析其增產效果、經濟效益等，為參、蝦、魚混套養模式在遼寧、山東、河北等海參養殖區域推廣和應用提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌種

（1）丁酸梭菌（Closhridium butyricum）：從中國工業微生物保藏管理中心購買。丁酸梭菌是專性厭氧的革蘭氏陽性芽孢桿菌，在腸道內能代謝產生多種B 族維生素、維生素E 和酶類物質，厭氧發酵過程中能產生大量淀粉酶，水解淀粉和糖類的最終代謝產物為乙酸、丙酸、丁酸等，其比例為10%∶13%∶68%；發酵終點為pH 3.5，有機酸50%；可有效改善養殖動物腸道健康，供給腸道內益生菌能量，增強免疫力，促進生長。

（2）植物乳桿菌（Lactobacillus acidophilusCICC 6074）：從中國工業微生物保藏管理中心購買。植物乳桿菌兼性厭氧發酵，能產生大量乳酸，抗菌肽、蛋白酶和生物活性物質。

（3）貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）：從中國工業微生物保藏管理中心購買。好氧發酵，生長速度快，易于培養，能夠充分利用有機氮，能分泌產生多種生物活性物質、脂肽類抗生素和激素。

（4）枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis2018）：從遼寧大連黃海海域底泥中分離得到。好氧發酵，可產生活性肽，能充分利用有機氮和含硫物，分解糞便和殘余餌料，降解氨氮、硫化氫和亞硝酸鹽。

（5）海洋膠紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa2019）：從遼寧大連渤海海域大連瓦房店謝屯五島海參養殖場海參圈中分離得到。好氧發酵，產生多種酶類物質，類胡蘿卜素和蝦青素，有很好的誘食效果。

1.1.2 供試發酵原料

（1）腐植酸：從內蒙古霍林河郭勒樹艷腐植酸公司購買。腐植酸含量≥60%，細度≤80 目，水分≤15%，pH 5.0。腐植酸參與發酵可以產生生物活性物質，具有收斂、解毒、消炎、止痢、替抗等功能。

（2）豆粕：黑龍江省九三油脂集團生產，市售。顏色為淺黃色，有大豆香味。成分：蛋白質50%、賴氨酸3.0%、色氨酸0.7%、蛋氨酸0.9%、水分≤10.0%。

（3）精氨酸發酵液濃漿粉：從河北精晶藥業科技股份公司購買。蛋白質含量≥52%、碳水化合物（糖）≥8.0%、總磷含量≥1.0%、灰分≤5.0%、水分≤8.0%、細度≤100 目。

（4）麥麩皮：五得利面粉集團有限公司生產，市售。蛋白質13.6%、脂肪5.0%、碳水化合物64.5%、水分≤10.0%。

1.1.3 供試設備

（1）微生物發酵罐：匯森生物設備（鎮江）有限公司。

（2）微生物固體發酵器：上海鵬平生物設備制造公司。

（3）低溫負壓流化床：上海鵬平生物設備制造公司。

（4）微粉機：上海春谷粉碎機制造公司。

1.1.4 供試養殖苗種

（1）海刺參：大連翔華生物技術有限公司萬眾海參養殖場，自繁。

（2）基圍蝦：海南騰海水產科技有限公司，外購。

（3）藍子魚：福建漳州東山養殖公司，外購。

1.2 腐植酸豆粕發酵活性肽產品生產工藝

以腐植酸、豆粕為發酵原料與丁酸梭菌等5 種菌液混合進行固體發酵，低溫烘干粉碎，得腐植酸豆粕發酵活性肽產品。其生產工藝為：菌種活化→液體發酵→固體料與液體菌種混合→微生物固體發酵器中發酵→低溫負壓流化床烘干→微粉機粉碎→產品保證值檢測。

1.2.1 液體發酵

（1）丁酸梭菌培養與發酵：丁酸梭菌菌種1 支→1000 mL 三角瓶10 瓶（厭氧培養48 h）→500 L 發酵罐（厭氧發酵24 h）→5 T 發酵罐（厭氧發酵72 h）。發酵罐液體發酵培養結束后，用平皿培養法檢測，丁酸梭菌培養密度不低于20×108cfu/mL 為合格產品，無菌密閉條件下灌裝到5 L 或10 L 塑料瓶中，即得到丁酸梭菌WL21-01 生物制劑，入庫備用。

（2）植物乳桿菌：培養過程同丁酸梭菌。區別為：培養基不一樣，培養方式兼性厭氧，保壓不通氣。植物乳桿菌培養密度不低于80×108cfu/mL為合格產品。

（3）貝萊斯芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌：培養基中C/N=1/5，培養方式好氧發酵，萊斯芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌培養密度不低于200×108cfu/mL為合格產品。

（4）海洋膠紅酵母：培養基中C/N=3/2，培養方式好氧發酵，培養密度不低于20×108cfu/mL為合格產品。

1.2.2 固體發酵

（1）液體菌種與原料混合比例：50 ∶100。（2）5 種液體菌種混合比例：1 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1。

（3）4 種發酵原料混合比例：1 ∶1 ∶1 ∶1。

（4）固體發酵：液體菌種和發酵原料放入到固體發酵器中，經好氧、厭氧發酵過程，溫度控制在38 ～50 ℃之間，發酵時間100 h。

1.2.3 烘干粉碎和產品保證值

（1）烘干：經低溫負壓流化床烘干，入口溫度為100 ℃，出口溫度為40 ℃，物料流化時間為12 min。（2）粉碎：微粉機粉碎到200 目，得到腐植酸豆粕發酵活性肽。

（3）產品保證值檢測依據：粗蛋白按照飼料中粗蛋白測定方法（GB/T 6432—1994）進行測定；小肽按照飼料中酸溶蛋白的測定方法（GB/T 22492—2008）進行測定（小肽分子量小于2000 道爾頓）；酸度按照食品安全國家標準乳和乳制品酸度的測定方法（GB 5413.34—2010）對飼料中酸度進行測定；氨基酸（賴氨酸、蛋氨酸、精氨酸）按照飼料中氨基酸的測定方法（GB/T 18246— 2000）進行測定；揮發性鹽基氮按照飼料中揮發性鹽基氮的測定方法（GB/T 32141—2015）進行測定；水分按照飼料中水分的測定方法（GB/T 6435—2014）進行測定。pH 值按照水產品衛生標準的分析方法（GB/T 5009.45—2003）進行測定。

（4）腐植酸豆粕發酵活性肽產品保證值測定結果見表1。

表1 腐植酸豆粕發酵活性肽產品保證值Tab.1 Guaranteed value of humic acid soybean meal fermentation peptide products

2 試驗設計與方法

試驗時間：2021 年5 月20 日—10 月20 日。

試驗地點：在遼寧省大連市普灣新區皮口社區萬眾海產品養殖區（東經122°21′，北緯39°34′）進行，海刺參收獲2次、基圍蝦收獲多次、藍子魚收獲1 ～2 次。試驗設計方案見表2。

表2 腐植酸豆粕發酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌試驗設計方案Tab.2 Experimental design of humic acid soybean meal fermentation peptide, Clostridium butyricum and Lactobacillus plantarum

藍子魚投放水溫應穩定在18 ℃以上。水溫超過20 ℃時，水草、藻類、青苔生長較旺盛，全池覆蓋率60%，每畝投放藍子魚苗0.1 kg（300 元/kg）折合投入30 元/畝，投苗規格為每1000 尾/kg；覆蓋率低的可以按比例減少投放魚苗尾數。藍子魚啃食草、藻、苔生長，排出的糞便通過微生物作用分解，化害為寶，既消除了糞便對水草、藻類、青苔的威脅又增加了微生物群體的數量，為海刺參的生長提供優質的動物蛋白餌料，促進水生環境的生態平衡。

秋季水溫低于15 ℃時，藍子魚開始大量死亡，此時藍子魚規格大約每尾0.20 ～0.25 kg，在此之前必須將魚撈出，出售。

3 結果分析

3.1 腐植酸豆粕發酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對海刺參、基圍蝦、藍子魚產量的影響

腐植酸豆粕發酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對海刺參、基圍蝦、藍子魚產量的影響結果見表3?？梢钥闯?，試驗組1 與對照組相比，海刺參增重37.0 kg/畝，基圍蝦增重2.6 kg/畝，藍子魚增重1.9 kg/畝；試驗組2 與對照組相比，海刺參增重41.9 kg/畝，基圍蝦增重2.6 kg/畝，藍子魚增重2.3 kg/畝；試驗組3 與對照組相比，海刺參增重49.0 kg/畝，基圍蝦增重4.0 kg/畝，藍子魚增重2.7 kg/畝，海刺參增重率提高26.46%～34.48%；基圍蝦增重率提高23.63%～36.36%，藍子魚增重率提高38.0%～54.0%。

表3 腐植酸豆粕發酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對海刺參、基圍蝦、藍子魚產量的影響Tab.3 Eff ects of humic acid soybean meal fermentation peptide, Clostridium butyricum and Lactobacillus plantarum on the yield of sea stichopus, basal shrimp and siganid f ish

3.2 腐植酸豆粕發酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對海參圈理化指標的影響

腐植酸豆粕發酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對海參圈中硫化氫、氨氮、亞硝酸鹽、溶解氧、pH 值等理化指標的影響結果見表4?？梢钥闯?，與對照組相比，投放腐植酸豆粕發酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌后，海參圈中硫化氫降低0.003 ～0.010 mg/L，氨氮降低0.04 ～0.21 mg/L，亞硝酸鹽降低0.013 ～0.024 mg/L，溶解氧提高1.10 ～3.36 mg/L，pH 值趨于穩定，透明度提高14.6 ～29.8%，濁度降低1.9 ～8.3%，底棲硅藻增加2 ～7 g/m2。

表4 腐植酸豆粕發酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對海參圈理化指標的影響Tab.4 Eff ects of humic acid soybean meal fermentation peptide, Clostridium butyricum and Lactobacillus plantarum on physical and chemical indexes of sea cucumber ring

3.3 腐植酸豆粕發酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對海刺參、基圍蝦、藍子魚養殖模式經濟效益分析

腐植酸豆粕發酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對海刺參、基圍蝦、藍子魚生態養殖模式經濟效益的分析結果見表5?？梢钥闯?，試驗組1 投入成本增加600 元/畝，收入增加6374 元/畝，凈收益增加5774 元/畝；試驗組2 投入成本增加1200 元/畝，收入增加7198 元/畝，凈收益增加5998 元/畝；試驗組3 投入成本增加1500 元/畝，收入增加8406 元/畝，凈收益增加6906 元/畝，效果最好。

表5 腐植酸豆粕發酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌對海刺參、基圍蝦、藍子魚養殖模式經濟效益分析Tab.5 Economic benef it analysis of humic acid soybean meal fermentation peptide, Clostridium butyricum and Lactobacillus plantarum on the culture model of sea stichopus, basal shrimp and siganid f ish

3.4 海參圈投入產出情況統計分析比較

海參圈投入海刺參苗重量、規格及其分布和投入產出情況統計分析比較結果見表6?？梢钥闯?，海參圈投入海刺參苗重量34 kg/畝以上，規格是大中小均有，數量是大小均勻分布，呈現一種合理的分布狀態，海參圈產出成品參重量188 kg/畝以上。海參圈海刺參幼稚參投入重量與產出成品參重量比為1 ∶5.53（投入1 kg 幼稚參，產出5.53 kg 成品參）。

表6 海參圈投入海刺參苗重量、基圍蝦蝦苗數量及其投入產出情況統計分析比較Tab.6 Statistical analysis and comparison of seedling weight of sea stichopus, seedling number of basal shrimp and its input-output in sea cucumber ring

4 結果與討論

（1）在海刺參養殖中混套養基圍蝦、藍子魚，以腐植酸豆粕發酵活性肽20 kg/ 畝、丁酸梭菌5 kg/ 畝和植物乳桿菌5 kg/畝用量，并按照潮汐期規律使用6 次，能夠有效調整水體中的C/N 營養比例，促進有益微生物繁殖生長，調整和改善水體顏色，穩定水質，增產增收[2，3]。

（2）本試驗結果表明，腐植酸豆粕發酵活性肽、丁酸梭菌、植物乳桿菌可以使海刺參增重率提高26.46%～34.48%，基圍蝦增重率提高23.63%～36.36%，藍子魚增重率提高38.0%～54.0%。經測定，與對照組相比，試驗組海參圈理化指標均有變化：硫化氫降低0.003 ～0.010 mg/L、氨氮降低0.04 ～0.21 mg/L、亞硝酸鹽降低0.013 ～0.024 mg/L、溶解氧提高1.10 ～3.36 mg/L；pH值穩定在8.15 ～8.20 之間、透明度提高14.6 ～29.8%、濁度降低1.9 ～8.3%、底棲硅藻增加2 ～7 g/m2。從經濟效益看，試驗組3 效果最好，投入成本增加1500 元/畝，收入增加8406 元/畝，凈收益增加6906 元/畝；海刺參苗種重量投入產出比為1 ∶5.53。

（3）在本研究中，海參圈水體和底泥中的動物糞便和殘余餌料，腐爛后會產生硫化氫發黑發臭，滋生病菌，生成大量的氨氮和亞硝酸鹽，當亞硝酸鹽濃度超標時，就會造成養殖動物的死亡。貝萊斯芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌均為好氧菌，能加速參池底部堆積有機物的分解，將大分子有機物降解為多肽等小分子有機物，再降解成為氨基酸、單糖等，最終分解為二氧化碳、硝酸鹽、硫酸鹽等物質，使海參圈中的化學需氧量，生物需氧量降低，水質得到有效改善。同時，海參圈中有大量的單細胞藻類等浮游植物，可以作為海刺參的食物。浮游植物又可以通過光合作用產生大量氧氣和糖類等有機物，這為棲息在底部的海刺參的呼吸、有機物的分解提供了氧氣，由此使海參圈形成一個良好的微生態循環系統[3～5]。

（4）植物乳桿菌繁殖過程中產生的酸性物質能降解重金屬，產生的乳酸桿菌素是一種生物型的防腐劑，也能很好地抑制底部糞便和殘餌料的腐爛，降低了氨氮和亞硝酸鹽的增加，減少了化學降氮增氧劑的用量，使其養殖成本降低，如果長期使用丁酸梭菌能為植物乳酸菌等腸道益生菌的生長繁殖提供能量，二者優勢互補、相互促進，共同構建腸道優勢菌群，護衛腸道安全[1，6]。

（5）有益微生物菌群作為辛勤的“清道夫”和“腸道衛士”，清理底泥中發黑發臭腐爛物、氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫，同時益生菌菌體蛋白為海刺參提供良好的養殖環境和優質營養源。藍子魚作為辛勤的“園丁”，啃食水草、大型藻類、苔蘚，將其轉化成糞便，通過微生物作用將糞便分解，化害為寶，既消除苔、藻、草的威脅又增加了微生物群體的數量，為海刺參的生長提供優質的動物蛋白餌料。同時，增加腐植酸使用量，降低光照強度，可以控制苔蘚、大型藻類、雜草等植物的生長，降低雇傭潛水員撈草的人工費用和使用化學藥品殺草對池底的污染和對生態平衡的破壞[1，2，6]。

（6）本試驗將腐植酸豆粕發酵活性肽、丁酸梭菌和植物乳桿菌應用于海刺參、基圍蝦、藍子魚混套生態養殖模式，在遼寧、山東和河北等地海參養殖區域推廣應用，將會帶來可觀的經濟效益。