4-氰基吡啶合成異煙酸菌種發酵工藝的研究

周浩，齊勇，劉淑琦，陳洋

（安徽瑞邦生物科技有限公司，安徽 馬鞍山 243100）

異煙酸（isonicotinic acid），又名4-吡啶甲酸，分子式為C6H5NO2，它作為一種中間體在各個領域均有應用[1]：在醫學上，主要是抗結核原料，如異煙肼、異煙酸酯等；在化工上，主要作為防銹蝕劑、電鍍添加劑、PVC 熱穩定劑等；異煙酸也可以作為植物生長劑，主要合成植物體內的抗倒胺，用于調節植物代謝[2]。

目前化學法和生物法是合成異煙酸的主要方法?；瘜W法由于存在污染性大、工藝復雜、不符合可持續發展等弊端現已經逐步被生物法所取代。而生物法則是目前流行的采用腈水解酶為催化劑催化轉化4-氰基吡啶合成異煙酸[2]，該方法由于綠色環保而逐漸得到眾多學者的關注。該轉化反應式如下：

有相關研究人員利用生物酶催化合成異煙酸小試，最終異煙酸的生成量可以達到117.9 g/L[3-4]。

本研究利用本公司實驗室所構建出的一株產腈水酶的重組大腸桿菌M70進行高密度發酵，并對其發酵條件進行了系統研究，同時鑒定了其催化合成異煙酸的能力，研究了不同碳源、氮源、誘導劑濃度、金屬離子種類、金屬離子濃度對于發酵條件的影響，同時鑒定了其催化合成異煙酸的能力。

1 實驗部分

1.1 材料與方法

菌種：大腸桿菌M70：本實驗室構建，保藏于安徽瑞邦生物科技有限公司實驗室。

培養基：5 g/L 酵母浸粉，10 g/L 蛋白胨，10 g/L NaCl，瓊脂粉15 g/L。

TB培養基：24 g/L 酵母浸粉，12 g/L 蛋白胨，2.4 g/L KH2PO4，16 g/L磷酸氫二鉀，5 g/L甘油。

發酵基礎培養基：32 g/L氮源，20 g/L碳源，17.5 g/L十二水磷酸氫二鈉，3.3 g/L磷酸二氫鉀，2 g/L NaCl，1.2 g/L氯化銨，1.5 g/L七水硫酸鎂。

注：以上培養基均為卡那霉素抗性，Kana終濃度均為50 mg/L。

儀器：超凈工作臺，培養箱，pH 計，搖床，滅菌鍋，-80°C 冰箱，離心機，5 L 玻璃發酵罐，雙聯酶反應器，紫外分光光度計，高效液相色譜儀。

1.2 培養方法

1.2.1 菌種活化

使用移液槍，從-80℃冰箱中的甘油管吸取100 μL菌液，隨后將其加入到無菌離心管中，再加入900 μL的無菌純水，用這種方法操作將其稀釋至10-6左右，然后使用移液槍將微量稀釋的菌液滴入平板表面，再使用涂布棒使其均勻抹開，將其放于培養箱中，培養箱溫度設置為37℃，培養12 h。

1.2.2 一級種子培養

將生長好的菌株平板分別利用移液槍槍頭挑取單克隆菌落于2 個三角搖瓶中，其中每個搖瓶中包含40mL 一級LB 培養基，將其放于培養箱中，培養箱溫度設置為37℃，培養12 h。

1.2.3 二級種子培養

將培養好的2 個一級種子液利用移液槍分別接種到2 個含有150 mL 二級TB 培養基的三角搖瓶中，整個移種過程在超凈臺上完成，種子液接種量為1%，隨后放入搖床培養，培養溫度設定為37℃，培養8 h。

1.2.4 發酵培養

發酵罐培養基配好，將堿（50%氨水）配置好，調節初始pH為7.0±0.2。待二級種子培養完成，將其在無菌火焰中接種至5 L發酵罐中，接種完將發酵罐壓力調至0.02 MPa左右，空氣流量調到5 L/min，待穩定后將溶氧校至100。發酵控制系統中DO 設定在37～43 之間，發酵開始后待溶氧降至50 左右時，將溶氧聯動。發酵大約3～4 h后轉速大約會達到950 rpm，此時溶氧會有約30 min 左右的跌底，之后會上升20～30 左右。等到溶氧回升至60 以上，轉速下降后，此時開始補料，期間注意pH 值會上升至7.2 左右，控制補料保證pH 值不再上升或有下降趨勢。補料后3 h左右測OD值，等到OD達到60 以上開始降溫加入乳糖誘導。根據比生長速率u來調整補料速度。誘導后每6～8 h取樣測OD酶活，待酶活無明顯升高時放罐。

比生長速率計算公式：

式中：u—比生長速率；b—T2發酵時間取樣OD 值；a—T1發酵時間取樣OD值；T1、T2—發酵前后時間。

1.2.5 催化反應

將99.8%的4-氰基吡啶用去離子水配制成體積分數為50%的4-氰基吡啶溶液，水浴伴熱保溫；將計量好的菌液倒入純水中，用液堿調pH為7.0±0.2。開始流加4-氰基吡啶水溶液，蠕動泵流速為43 rpm（40 g/min），取樣1次/0.5 h測4-氰基吡啶、煙酰胺、異煙酸含量。當4-氰基吡啶含量＞1 000 mg/kg，開始進行過程調控，逐步降低流速或停止流加4-氰水溶液5 min左右，控制4-氰基吡啶含量＜1 000 mg/kg。定時取樣檢測異煙酸含量。當異煙酸含量＞280 g/L，停止流加4-氰基吡啶水溶液。停止流加4-氰基吡啶水溶液1 h后，取樣測4-氰基吡啶、異煙酸、煙酰胺含量。整體反應時間為7～10 h。

1.3 檢測方法

1.3.1 pH值和溶氧DO測定

采用梅特勒pH電極和光學溶氧電極進行測定[5]。

1.3.2 菌體量測定

每隔4 h 取樣，將樣品根據發酵情況進行梯度稀釋100～400倍不等，測OD600，將吸光值控制在標準范圍0.3～0.7，如超過量程，則擴大稀釋倍數[6]。按公式（1）的計算菌體的生物量：

1.3.3 發酵液酶活測定

底物溶液：100 μL（70 g/L 4-氰基吡啶）+690 μL pH=7.0 磷酸鹽緩沖溶液（配置方法：稱取二水磷酸二氫鈉3.04 g，十二水磷酸氫二鈉10.92 g，溶于1 L 去離子水中）。

反應：將底物溶液放置于金屬浴上，恒溫30℃，振蕩混合反應。隨后加入10 μL稀釋后的發酵液，反應時間20 min，利用200 μL 的硫酸停止反應。隨后將反應液離心至固液分離。取上清液過0.22 μm微濾膜，后采用液相色譜分析儀進行測定[7]；色譜柱條件：VP-ODS C18 色譜柱，流動相為50%乙腈與2.28 g/L 磷酸二氫鉀水溶液。按照1∶10 的比例進行同時洗脫。檢測溫度30℃，流速1 mL/min，檢測波長為230 nm[7]。按照公式（2）計算粗酶活：

式中：c—液相色譜得出的異煙酸濃度，μg/mL；V—反應體積，800 μL反應液和200 μL硫酸；X—反應進樣前的稀釋倍數；T—反應時間，10 min；v—所加粗酶液體積，10 μL；123.1—異煙酸分子量，g/moL。

發酵液酶活（U/mL）

=粗酶液酶活×反應進樣前的稀釋倍數X

1.3.4 催化產物異煙酸測定

異煙酸測定預處理方式同上述發酵液處理方式。將其稀釋至一定倍數，然后過0.22 μm 微孔濾膜，隨后采用液相色譜分析儀進行測定；色譜條件：VP-ODS 不銹鋼柱（4.6 mm×250 mm），流動相為（A 溶液∶B 溶液=9∶1）進行洗脫[7]。

A 溶液：水+庚烷磺酸鈉+三乙胺+冰乙酸=80 mL+0.1 g+0.02 mL+0.1 mL

B溶液：乙腈

柱溫30℃，流速0.8 mL/min，檢測波長為265 nm。按照公式（3）計算異煙酸濃度：

式中：ci—待進樣溶液中各組分的濃度，μg/mL；N—樣品的稀釋倍數。

2 結果與討論

2.1 不同氮源對發酵產腈水解酶酶活的影響

菌體的細胞物質主要由氮源組成，發酵腈水合酶需要尋找一個合適氮源，同時氮源除了幫助菌體生長繁殖的同時，也可以促進目的產物的合成。因此，我們針對氮源進行優化，期望篩選合適氮源。

本試驗以發酵培養基為基礎，加入20 g/L 的甘油，額外加入32 g/L的氮源，分別利用不同種類的酵母粉以及蛋白胨[8]，來研究這些氮源對M70 生長和產酶的影響，結果如圖1所示。

圖1 不同氮源對發酵產腈水解酶酶活的影響

由圖1可知，最初采用酵母抽提物單配基礎鹽溶液作為發酵培養基，圖中明顯可以看到，雖然菌體量達到了80，但是酶活較低，僅僅只有346 U/mL。隨后在選擇其他不同氮源后，菌體量和酶活呈現了明顯上升的趨勢。由圖1 可以看到，M70 在利用酵母粉作為氮源時，其產酶能力最好，其中安琪酵母粉908 酶活可以達到817 U/mL，OD600達到了157，說明該氮源更利于產酶。同時由圖中可以看到，雖然玉米漿干粉和魚骨蛋白胨對于M70 發酵也有一定效果，但同比酵母粉仍然差距20%，分析原因為該M70 菌株更適合利用酵母粉為氮源，促進其酶的合成，因此我們選擇安琪酵母粉908 作為最適氮源。

2.2 不同碳源對發酵產腈水解酶酶活的影響

保持培養基其他條件不變，以安琪酵母粉908作為氮源（添加量為32 g/L），更換不同碳源（添加量為20 g/L），碳源種類例如葡萄糖、麥芽糖、甘油等[8]，來研究這些碳源對M70生長和產酶的影響，結果如圖2所示。

圖2 不同碳源對發酵產腈水解酶酶活的影響

由圖2 可知，M70 菌在利用麥芽糖、蔗糖和淀粉作為碳源時，其菌體量達到了146、151和124，相對應的酶活也平均在550 U/mL 左右，M70 菌株使用葡萄糖和甘油作為碳源效果優于其他有機碳源。OD 值水平相當，酶活分別為778 U/mL 和821 U/mL，OD 值分別為152和165。相比葡糖糖，甘油代謝較慢，利用率高，不會產生碳流分解代謝阻礙，不容易生成乙酸副產物，而其他碳源，如麥芽糖、淀粉等，菌株對其利用效果明顯要比甘油差。因此對比后，我們選擇甘油作為最適碳源。

2.3 誘導劑用量對發酵產腈水解酶酶活的影響

保持其他反應條件不變，以乳糖作為誘導劑，甘油和安琪908酵母粉作為碳氮源，觀察不同誘導劑用量對M70發酵產酶活的影響，結果如圖3所示。

圖3 誘導劑用量對發酵產腈水解酶酶活的影響

從圖3 中看出，利用乳糖誘導，其發酵酶活及菌體量都隨乳糖在發酵體系中的終濃度上升而增加，但當乳糖濃度超過8 g/L時，其酶活出現了略微下降的趨勢，由此可知，再增加乳糖濃度，將對發酵酶活產生抑制作用，同時還會增加發酵成本，因此基本確定乳糖8 g/L 為最適誘導濃度，此時的酶活及生物量最高，酶活和生物量分別達到892 U/mL和172。

2.4 不同金屬離子對發酵產腈水解酶酶活的影響

保持其他反應條件不變，碳氮源分別為甘油和908酵母粉，誘導劑乳糖濃度為8 g/L，觀察不同金屬離子對發酵產腈水解酶酶活的影響，結果如圖4所示。

圖4 不同金屬離子對發酵產腈水解酶酶活的影響

從圖4中看出，不同金屬離子對于發酵的酶活差異顯著，其中以Fe作為金屬離子添加進行發酵，酶活和生物量明顯有較大提升，其酶活達到了1 012 U/mL。其中Co和Mn兩種金屬離子對于發酵酶活有明顯抑制作用，酶活僅僅只有100 U/mL。因此我們選擇Fe作為最適的金屬離子。

2.5 不同Fe離子濃度對發酵產腈水解酶酶活的影響

保持其他反應條件不變，碳氮源分別為甘油和908酵母粉，誘導劑乳糖濃度為8 g/L，采用Fe作為金屬離子參與發酵，觀察不同Fe 離子濃度對發酵產腈水解酶酶活的影響，結果如圖5所示。

圖5 Fe離子濃度對發酵產腈水解酶酶活的影響

從圖5 中看出，以Fe 離子作為金屬離子參與發酵，其發酵酶活及菌體量都隨著Fe離子濃度在發酵體系中的終濃度上升而增加，但當Fe 離子濃度超過1 g/L 時，其酶活出現了略微下降的趨勢，由此可知，再增加Fe離子濃度，將對發酵酶活產生抑制作用，因此基本確定Fe離子濃度為1 g/L時為最適誘導濃度，此時的酶活及生物量最高，OD和酶活分別達到了185和1 076 U/mL。

2.6 M70菌株發酵優化后的催化合成異煙酸的驗證

為進一步驗證M70 菌發酵優化后催化合成異煙酸的實際應用情況，我們依據上述實驗發酵所得到的發酵液進行催化合成異煙酸驗證。從圖6可知，采用50%的4-氰基吡啶進行流加反應，前期反應體系中的4-氰基吡啶和異煙酸濃度逐漸增加，同時伴有少量煙酰胺的生成。當反應至7 h左右，反應體系中3-氰基吡啶積累到了1.2 g/L。當反應至7 h 左右，異煙酸濃度已經達到280 g/L，此時反應體系中酶活力下降，需要停止流加反應。因為4-氰基吡啶對于酶有底物抑制，會導致濃度高，底物轉化不完全。此時將反應停止至8 h，反應體系中煙酰胺含量達到了285 g/L，4-氰基吡啶轉化完全。雜質煙酰胺含量較低，僅有200 mg/kg。以上結果顯示，該M70 菌株在優化后合成異煙酸方面具有良好的催化性能。

圖6 M70催化4-氰基吡啶合成異煙酸

3 結論

本研究利用本公司自主構建出的一株產腈水解酶的重組大腸桿菌M70進行高密度發酵，期間對其產酶和合成異煙酸的能力做了相關研究，并對其發酵條件、培養基進行優化。通過氮源、碳源、誘導劑濃度、金屬離子種類及金屬離子濃度等一系列影響因素，確定最優的碳氮源等條件，最終確定了發酵培養基成分，其組成為：32 g/L 安琪908 酵母粉，20 g/L 甘油，17.5 g/L 十二水磷酸氫二鈉，3.3 g/L 磷酸二氫鉀，2 g/L NaCl，1.2 g/L 氯化銨，1.5 g/L七水硫酸鎂，并利用乳糖為誘導劑，濃度為8 g/L，采用Fe作用發酵的金屬離子，添加量為1 g/L時，其OD 和酶活最高，達到了185 和1 076 U/mL。該菌在發酵條件優化后，酶活提高了40%左右。同時最終利用其合成異煙酸，異煙酸生成達到了285 g/L。因此該菌在催化4-氰基吡啶合成異煙酸的生產中具有積極作用，對生物合成異煙酸具有重要意義。