紫色土上大葉女貞苗接種叢枝菌根真菌后對干旱脅迫的響應

黎 蕾，湯玉喜，李永進，唐 潔，梁軍生，楊 艷

(湖南省林業科學院，湖南 長沙 410004)

紫色土是發育于亞熱帶紫色砂頁巖的一種巖性土，其土層薄、顏色較深、吸熱性強、導熱性差、保水能力差，在高溫干旱環境下極易形成季節性干旱，從而限制植物的生長發育[1]。干旱脅迫會造成植物光合能力下降、降低植物水勢、阻礙植物生長，嚴重時會造成植物死亡[2]。近年來，通過接種叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)解決植物干旱脅迫問題越來越受到重視，相關技術的應用也越來越多[3]。AMF能與絕大多數的陸生植物形成共生體系，在植物應對脅迫時發揮重要作用[4]。大量研究表明，接種AMF能促進植物生長發育，提高植物的抗旱性[5-7]。在干旱脅迫條件下，AMF根外菌絲體依靠其在土壤中形成的龐大菌絲網絡改變植物體水分的進出速率，增強了宿主植物對養分和水分的吸收效率，提高了植物的凈光合速率和光合水分利用效率[8-10]。在干旱脅迫下，葉片是植物對環境變化最敏感的部位，具有極強的可塑性[11]，其結構特征能反映植物對不同環境變化所形成的生存策略，最能體現植物對環境的適應性[12-13]。因此，研究葉片形態特征對揭示植物的抗旱機理具有重要意義。大葉女貞(LigustrumLucidum)為木犀科(Oleaceae)女貞屬(Ligustrum)植物，是南方地區常見的鄉土樹種，具有較強的耐旱性[14]。目前關于大葉女貞的研究主要集中在其抗寒性、重金屬富集、耐鹽性、滯塵效應等方面[15]。大葉女貞在綠地土壤修復方面發揮著重要作用，目前在湖南省衡陽地區紫色土坡地上廣泛種植，但受限于紫色土保水保肥能力差，通常存在生長遲緩、葉片小且葉色發黃、幼苗極易缺水而難以存活等問題。本研究分析了接種AMF對紫色土干旱脅迫環境下大葉女貞葉片生長與生理特性的影響，以期為紫色土區大葉女貞抗旱和菌根調控技術的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試大葉女貞種子于2021年11月采自衡陽市祁東縣紫色土區。供試的2種AMF購置于廣西農業科學院微生物研究所“亞熱帶叢枝菌根(AM)真菌資源保藏中心”，分別為摩西斗管囊霉(Funneliformismosseae，FM)、幼套近明球囊霉(Claroideoglomusetunicatum，CE)菌劑。菌劑由菌根真菌孢子、根外菌絲、菌根化根段及砂土組成。摩西斗管囊霉、幼套近明球囊霉菌劑中分別含有孢子65±5、50±5個·g-1。供試土取自衡陽市祁東縣紫色土區0～25cm的表層紫色土，經自然風干并過篩(孔徑<4mm)后混合土樣，帶回實驗室測定其基本理化性質。測定結果見表1。

表1 紫色土土壤基本理化性質Tab.1 Basic physical and chemical properties of purple soil有機質含量/(g·kg-1)全氮含量/(g·kg-1)全磷含量/(g·kg-1)全鉀含量/(g·kg-1)pH田間持水量/%土壤容重/(g·cm-3)15.001.050.8526.98.2326.23%1.67

1.2 研究方法

1.2.1 試驗設計

采取完全隨機區組試驗設計。設置W1(正常供水，盆內土壤相對含水量為田間持水量的75%±5%)、W2(干旱脅迫，盆內土壤相對含水量為田間持水量的40%±5%)2種水分條件，N0(接種滅菌菌劑10 g)、FM(接種摩西斗管囊霉菌劑10g)、CE(接種幼套近明球囊霉菌劑10g)等3種接種方法，共6種處理，分別為W1N0(CK，接種滅菌菌劑10g和正常澆水)、W1FM(接種FM菌劑10g和正常澆水)、W1CE(接種CE菌劑10g和正常澆水)、W2N0(接種滅菌菌劑10g和干旱脅迫)、W2FM(接種FM菌劑10g和干旱脅迫)、W2CE(接種CE菌劑10g和干旱脅迫)。每種處理接種9盆，共接種54盆。

采用盆栽方式育苗。盆栽用花盆直徑15cm，深14cm，每盆裝供試紫色土1.7kg。挑選外觀均勻一致的大葉女貞種子，使用 10%(V/V)的H2O2溶液對種子表面消毒10min，以無菌水沖洗多次，再浸泡1d后進行催芽處理，然后種植于經高溫高壓滅菌處理的土中，3d正常澆水1次，直至地上部分長出15cm，根系完整形成時接種AMF菌劑。接種方法是將10g菌劑或滅菌菌劑施于根系部位[8]。試驗在人工氣候室中進行，氣候室中光強為700μmol·m-2·s-1，溫度為26℃，光照時間12～14h·d-1。各種處理的植株隨機排列，定植1a后，自2023年5月20日開始選取一半的植株進行干旱脅迫，另一半植株仍按正常供水。脅迫開始前充分澆水，土壤相對含水量達飽和后停止澆水，待盆內水分自然消耗至所設定的土壤相對含水量后，開始進行干旱脅迫?？厮椒▍⒖寂Ｋ刎懙萚16]的方法，根據土壤含水量、田間持水量和設定的土壤相對含水量計算每處理每重復達到所設定的相對含水量時的盆土質量。隨后每2d稱量盆土質量并補水，采用稱量質量法保持土壤相對含水量穩定，使土壤相對含水量控制在各干旱脅迫處理的范圍內，連續控水90d，至2023年8月20日結束干旱脅迫。干旱脅迫結束后測定大葉女貞葉片的光合參數、葉綠素相對含量及葉綠素熒光參數，并采集各處理植株中上部成熟葉片15片，置于冰盒內，迅速帶回實驗室，測量葉片表型性狀和測定葉片干物質含量與相對含水量等。

1.2.2 葉片表型性狀測量及生理特性測定

(1)葉片表型性狀測量。每份葉片樣品選取3～5片健康完整的新鮮葉片，用LI-3000C便攜式葉面積儀(LI-COR，美國)測定葉片寬度(最大寬度和平均寬度)、葉片長度、葉面積(LA)。

(2)干物質含量和相對含水量測定。將采集的新鮮葉片浸入去離子水中，放置8h后稱量其飽和質量，然后將葉片置于烘干箱內烘48h至恒質量，稱量葉片干質量，并計算葉片干物質含量(LDMC)和葉片相對含水量。LDMC=葉片干質量/葉片鮮質量(g·g-1)。葉片相對含水量=(葉片鮮質量-葉片干質量)/(土壤相對含水量達到飽和時的葉片鮮質量-葉片干質量)×100%[17]。

(3)光合參數測定。采用便攜式光合作用測定系統Licor-6400(LI-COR，美國)測定光響應曲線，每種處理選擇3株，每株選擇2片葉片測定。CO2濃度設定為400 μmol·mol-1，CO2由系統自動控制注入。測定前，用1800μmol·m-2·s-1的光強對所測葉片進行15 min光誘導。設置光強梯度由高到低依次為2000、1800、1600、1400、1200、1000、800、600、400、200、100、80、60、40、20、0 μmol·m-2·s-1，每個梯度光強值設定數據采集時間3min，測定凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)、氣孔導度(Gs)等參數。利用Pn、Tr計算植物水分利用效率(WUE=Pn/Tr)。

(4)葉綠素相對含量測定。使用便攜式葉綠素測定儀SPAD-502 Plus(Konica-Minolta，日本)測定葉片的葉綠素相對含量(SPAD值)。每種處理選擇3株，每株選擇5片葉片測定，每片葉片測定4個部位的SPAD值，4個部位SPAD值的平均值為葉片總體SPAD值。

(5)葉綠素熒光參數測定。使用手持式葉綠素熒光儀FluorPen FP 110(PSI，捷克)測定葉綠素熒光參數，每種處理選擇3株，每株選擇3片葉片測定。測定方法為葉片暗適應20min后檢測葉片葉綠素熒光，記錄葉綠素熒光關鍵參數PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)、光化學猝滅系數(qP)和非光化學猝滅系數(NPQ)。

1.2.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2016和OriginPro 2017軟件進行數據處理及作圖，運用SPSS 18.0 軟件對各參數進行單因素方差分析和Duncan多重比較。

2 結果與分析

2.1 大葉女貞苗接種AMF后葉片生長特性對干旱脅迫的響應

由表2可見：干旱脅迫對紫色土上大葉女貞的葉片數、葉面積、葉長、最大葉寬、平均葉寬、葉片相對含水量、葉片干物質含量等都有顯著影響(P<0.05)。干旱脅迫使大葉女貞的葉片數顯著減少(P<0.05)，使葉長、平均葉寬及葉面積均顯著減小(P<0.05)；使葉片相對含水量顯著降低(P<0.05)，其中接種滅菌菌劑、接種FM和接種CE處理的葉片相對含水量比正常供水處理的分別降低了9.81%、1.76%和2.54%，接種AMF處理的降低較少，可見接種AMF提高了大葉女貞對水分變化的適應能力。葉片相對含水量反映了葉片的持水能力，植物受到干旱脅迫時葉片相對含水量通常會降低，降低值越大說明植物對水分的適應性越差[17]。3種處理的葉片干物質含量受干旱脅迫后反而都提高，其中接種滅菌菌劑處理和接種FM處理的葉片干物質含量受干旱脅迫后都顯著提高(P<0.05)。這些反映了大葉女貞為更好地適應干旱環境形成的生存策略。

表2 不同處理大葉女貞的葉片性狀均值Tab.2 Effects of different treatments on leaf traits of Ligustrum lucidum處理葉片數葉面積/cm2葉長/cm最大葉寬/cm平均葉寬/cm葉片相對含水量/%葉干物質含量/(g·g-1)W1N021±3 bc15.31±4.52 d6.52±0.95 c3.24±0.44 b2.24±0.38 b84.88±0.9 d0.28±0.01 bW1FM67±9 a29.57±2.53 a10.18±1.08 a4.2±0.18 a3.16±0.18 a92.81±0.63 b0.21±0.01 dW1CE56±13 a23.45±4.35 b8.41±0.19 b4.08±0.48 a2.94±0.28 a94.83±0.17 a0.25±0.02 cW2N017±3 c7.65±0.92 e4.13±0.9 d2.28±0.37 c1.43±0.33 c76.55±0.6 e0.32±0.01 aW2FM31±5 b21.39±0.7 bc8.03±1 bc3.72±0.19 ab2.18±0.14 b91.18±0.51 c0.28±0.01 bW2CE26±3 bc16.55±2.16 cd6.42±0.81 c3.61±0.26 ab2.42±0.04 b92.42±0.21 b0.27±0.02 bc 注: 同列不同字母表示差異顯著(P<0.05水平)。下同。

由表2還可以看出：在兩種水分條件下，接種AMF都能顯著提高(P<0.05)紫色土上大葉女貞的葉片數及葉片相對含水量，顯著增大(P<0.05)其葉面積。正常供水時，接種FM處理的大葉女貞葉片數、葉面積、葉長、最大葉寬、平均葉寬和葉片相對含水量比接種滅菌菌劑處理的分別提高了219.05%、93.14%、56.13%、29.63%、41.07%和9.34%；接種CE處理的比接種滅菌菌劑處理的分別提高了166.67%、53.17%、28.99%、25.93%、31.25%、11.72%。干旱脅迫時，接種FM處理的大葉女貞葉片數、葉面積、葉長、最大葉寬、平均葉寬和葉片相對含水量比接種滅菌菌劑處理的分別提高了82.35%、179.61%、94.43%、63.16%、52.45%和19.11%；接種CE處理的比接種滅菌菌劑處理的分別提高了52.94%、116.34%、55.45%、58.33%、69.23%和20.73%。在2種水分條件下，與接種滅菌菌劑的處理相比，接種AMF處理的大葉女貞葉片干物質含量都降低了；接種FM對大葉女貞的葉片數增多和葉長、葉寬、葉面積增大等的促進效果都優于接種CE的，其中，葉面積、葉長、葉片相對含水量的差異均顯著(P<0.05)。

2.2 大葉女貞苗接種AMF后葉片光合特性對干旱脅迫的響應

在干旱脅迫下，紫色土上大葉女貞葉片的凈光合速率(Pn)對光合有效輻射強度(PAR)的響應曲線如圖1所示。圖1顯示：所有處理都表現為隨著PAR的加大，大葉女貞葉片的Pn均呈先增大再趨于平穩的變化趨勢。當PAR為0～200 μmol·m-2·s-1時，葉片的Pn快速升高；當PAR為200～800 μmol·m-2·s-1時，葉片的Pn上升緩慢；當PAR超過800 μmol·m-2·s-1時，葉片的Pn趨于平緩或下降?？梢?，過高的PAR甚至可能會抑制大葉女貞的光合作用。大葉女貞在受到干旱脅迫時，其葉片的凈光合速率會受到抑制，其中接種AMF處理的抑制程度有所減輕。

圖1 不同處理大葉女貞葉片的凈光合速率-光合有效輻射強度響應曲線Fig.1 Response curves of net photosynthetic rate-light intensity of Ligustrum lucidum leaves under different treatments

由圖2可知：干旱脅迫顯著降低(P<0.05)了大葉女貞葉片的氣孔導度、胞間CO2濃度和蒸騰速率，顯著提高(P<0.05)了接種AMF處理大葉女貞葉片的水分利用效率。正常供水時，接種FM處理的大葉女貞葉片氣孔導度和水分利用效率均顯著提高(P<0.05)，與對照相比分別提高了31.27%和21.12%，胞間CO2濃度及蒸騰速率沒有顯著變化；接種CE處理的大葉女貞葉片氣孔導度和水分利用效率均顯著提高(P<0.05)，與對照相比分別提高了34.65%和29.58%；胞間CO2濃度及蒸騰速率沒有顯著變化。干旱脅迫時，接種FM處理的大葉女貞葉片胞間CO2濃度和水分利用效率均顯著提高(P<0.05)，分別比對照的提高了26.70%和64.90%；接種CE處理的大葉女貞葉片胞間CO2濃度和水分利用效率均顯著提高(P<0.05)，分別比對照的提高了18.72%和35.39%。在兩種水分條件下，與接種滅菌菌劑的處理相比，接種AMF處理的大葉女貞葉片的水分利用效率均顯著提高，特別是在干旱脅迫的環境下，提高效果更明顯。雖然在兩種水分條件下接種兩種AMF處理的大葉女貞氣體交換參數和水分利用效率的差異均不顯著，但在干旱脅迫時，接種FM處理的胞間CO2濃度、蒸騰速率、水分利用效率均大于接種CE的。

圖2 接種不同AMF的大葉女貞在不同水分條件下葉片氣體交換參數及水分利用效率Fig.2 Leaf gas exchange parameters and water use efficiency of Ligustrum lucidum inoculated with different AMF under different water conditions

2.3 大葉女貞苗接種AMF后葉片的SPAD值及葉綠素熒光參數對干旱脅迫的響應

由表3可知：干旱脅迫對大葉女貞葉片的SPAD值影響顯著(P<0.05)，使葉片的SPAD值反而增大，尤其是接種了AMF的2種處理，其SPAD值均顯著增大(P<0.05)。正常供水時，接種FM和CE處理的大葉女貞葉片的SPAD值都顯著(P<0.05)大于接種滅菌菌劑處理的，分別比接種滅菌菌劑處理的大6.50%和19.70%；在干旱脅迫時，接種FM和CE處理的大葉女貞葉片的SPAD值也都顯著大于(P<0.05)對照處理的，分別比對照處理的大18.10%和23.74%。在干旱脅迫條件下，接種AMF顯著提高(P<0.05)了大葉女貞葉片的Fv/Fm值，接種FM和CE處理的Fv/Fm值分別比接種滅菌菌劑處理的提高了1.22%和2.44%。在正常供水條件下，不同AMF接種處理的Fv/Fm差異不顯著。Fv/Fm代表PSⅡ反應中心的光能轉換效率，反映了植物是否受到光抑制，當植物處于逆境中或被傷害時，該指標會下降[19-20]。干旱脅迫顯著降低(P<0.05)了大葉女貞葉片的qP。在干旱脅迫下，接種AMF能顯著提高(P<0.05)大葉女貞葉片的qP，其中接種FM和CE處理的分別比接種滅菌菌劑處理的提高16.67%和7.14%。qP代表著PSⅡ天線色素吸收的光能用于光化學電子傳遞的部分，反映PSⅡ反應中心的開放程度，qP越大，PSⅡ的電子傳遞活性越大[21]。干旱脅迫顯著提高(P<0.05)了大葉女貞葉片的NPQ，其中，接種滅菌菌劑處理的NPQ提高最多，增量為0.56。NPQ代表PSⅡ天線色素吸收的光能以熱能形式耗散的部分，反映了植物在強光環境下的自我保護機制[22]。

表3 不同處理大葉女貞葉片的SPAD及熒光參數Tab.3 SPAD and fluorescence parameters of L.lucidum under different treatments處理SPAD值PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)光化學猝滅系數(qP)非光化學猝滅系數(NPQ)W1N048.03±0.53 d0.83±0.02 ab0.55±0.05 a1.38±0.33 bcW1FM51.15±0.72 c0.84±0.01 a0.58±0.05 a1.16±0.23 cW1CE57.49±1.78 b0.84±0.01 a0.58±0.04 a1.25±0.3 cW2N049.24±0.03 cd0.82±0.02 b0.42±0.01 c1.94±0.21 aW2FM58.15±2.08 b0.83±0.01 a0.49±0.01 b1.66±0.18 abW2CE60.93±2.53 a0.84±0.01 a0.45±0.01 bc1.67±0.08 ab

3 結論與討論

(1)干旱脅迫使紫色土上大葉女貞的葉片數顯著減少，使葉面積、葉長、平均葉寬等均顯著減小，使葉片相對含水量顯著降低，但葉干物質含量受干旱脅迫后反而提高。干旱脅迫下，植物可通過改變葉片性狀來適應環境變化，紫色土上大葉女貞通過減少葉面積來適應干旱環境。在正常供水和干旱脅迫時，接種AMF都能使大葉女貞葉片數增多，使葉片相對含水量提高，使葉面積增大。其中，接種FM對大葉女貞的葉片數增多和葉長、葉寬、葉面積增大等的促進效果都優于接種CE的。

(2)紫色土上大葉女貞在受到干旱脅迫時，其葉片凈光合速率會受到抑制，接種AMF后抑制程度有所減輕。干旱脅迫顯著降低了大葉女貞葉片的氣孔導度、胞間CO2濃度和蒸騰速率。接種AMF顯著提高了紫色土上大葉女貞的水分利用效率，特別是在干旱脅迫的環境下，促進作用更顯著，且接種FM對大葉女貞水分利用效率的提升效果優于接種CE的。已有研究表明，接種AMF可以提高很多植物，如云南藍果樹(Nyssayunnanensis)、迷迭香(Rosmarinusofficinalis)等植物的葉片水分利用效率(WUE)[23-24]。

(3)干旱脅迫對紫色土上大葉女貞葉片葉綠素相對含量(SPAD值)的影響顯著，大葉女貞葉片的SPAD值在干旱脅迫下反而增大?？灼G菊等[25]的研究結果顯示，干旱脅迫下，黃櫨(Cotinuscoggygriavar.cinereus)葉片中的葉綠素含量會升高，這與本研究的結論一致，可能是由于干旱脅迫使得葉片相對含水量降低，葉片擴展生長受限，葉片單位面積的葉綠素含量升高，這樣雖然葉綠素含量升高了，卻因水分相對含量減少又使得葉綠素的活性降低。本試驗結果表明，在紫色土區的大葉女貞接種AMF后顯著促進了葉綠素的合成，這與賀學禮等[26]關于檸條錦雞兒(Caraganakorshinskii)在水分脅迫下接種AMF對其葉綠素合成的效果一致。

(4)干旱脅迫顯著降低了紫色土區大葉女貞葉片的qP，但顯著提高了大葉女貞葉片的NPQ。在受到干旱脅迫時，接種AMF能顯著提高大葉女貞葉片的PSⅡ最大光化學效率(Fv/Fm)。這與馬坤等[27]對干旱脅迫下木棉(Bombaxceiba)葉綠素熒光參數的研究結果一致。