基于OMWTTFA的豇豆多農藥殘留非靶向檢測方法研究

李跑,蘇光林,黎才婷,楊清華

1.湖南農業大學 食品科學技術學院,湖南 長沙 410128;2.湖南省農業科學院湖南省農產品加工研究所,湖南 長沙 410125;3.中國檢驗認證集團湖南有限公司,湖南 長沙 410021

0 引言

豇豆(Vignaunguiculata)是我國較常見的豆類蔬菜之一,富含多種植物蛋白及維生素,深受消費者喜愛[1-2]。豇豆是一季多茬、花果同期的農作物,種植者為提高產量、控制病蟲害發生,常在采收期施用農藥,導致豇豆中農藥殘留問題較為突出[3-4]。多農藥混合或過量使用、違禁農藥使用等使得豇豆中多農藥殘留非靶向檢測的難度不斷增大[5-6]?，F階段,果蔬中多農藥殘留非靶向檢測手段主要為氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用技術、液相色譜-質譜(LC-MS)聯用技術等。其中,GC-MS聯用技術是豇豆中多農藥殘留檢測較常用的方法之一[7-9],但由于豇豆的基質效應、多農藥復合施用等因素,GC-MS檢測信號中常存在農藥組分譜峰重疊、基線波動等干擾問題。此外,該方法常需結合農藥標準品才能實現準確定性分析,較難實現多農藥殘留的快速非靶向檢測[10-11]。

化學計量學方法可以有效消除GC和MS信號的基線波動并實現復雜信號的解析,已較廣泛地應用于食品中多農藥殘留非靶向檢測,如目標波段熵最小化(Band Target Entropy Minimization, BTEM)算法[12]、目標因子分析(Target Factor Analysis, TFA)算法[13-14]、免疫算法(Immune Algorithm, IA)[15]等。然而,上述方法存在參數較多、計算時間較長等問題,仍難以實現食品中多農藥殘留的快速非靶向檢測[16]。因此,開發快速及高通量的解析算法逐漸成為多農藥殘留非靶向檢測的新趨勢。李跑等[17]提出了一種可實現多農藥殘留非靶向檢測的移動窗口目標轉換因子分析(Moving Window Target Transfer Factor Analysis, MWTTFA)算法,該方法具有“移動窗口”和TFA的優點,可實現多農藥殘留GC-MS數據的快速解析,但在實際食品樣品檢測時存在假陽性的問題,誤判率較高。鑒于此,本文擬提出一種可實現豇豆中多農藥殘留準確非靶向檢測的優化移動窗口目標轉換因子分析(Optimize Moving Window Target Transfer Factor Analysis, OMWTTFA)算法,基于500種常見農藥MS數據庫對豇豆的GC-MS數據進行高通量解析,并將其應用于實際豇豆樣品的多農藥殘留檢測,以期為果蔬中多農藥殘留非靶向檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

豇豆,湖南農業大學東之源超市;農藥混合標準品Ⅰ(甲霜靈、戊唑醇、丁硫克百威、殺蟲脒、烯酰嗎啉和精甲霜靈溶于丙酮溶液,質量濃度為10 mg/L)、農藥混合標準品Ⅱ(甲基對硫磷、敵敵畏、樂果和馬拉硫磷溶于丙酮溶液,質量濃度為100 mg/L),壇墨質檢科技股份有限公司;硫酸鎂、檸檬酸鈉、乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)、乙腈,均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 主要儀器與設備

QP 2010 Ultra型GC-MS聯用儀,日本島津公司;DB-5 MS型色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),安捷倫科技有限公司;TG16 MW型臺式高速離心機,湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品制備豇豆樣品制備:參考文獻[18]的前處理方法,準確稱取10 g豇豆樣品(已置于室溫環境12 h)、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉、4 g硫酸鎂、1 g氯化鈉和10 mL乙腈于離心管中,手動振蕩1 min后,于4200 r/min條件下離心5 min;取上清液6 mL,加入含有0.9 g硫酸鎂和0.15 g PSA的離心管中,渦流振蕩1 min;待溶液澄清后,取上清液過微孔濾膜(有機相,0.22 μm)后用于上機檢測。

豇豆加標樣品制備:取上述處理后的豇豆樣品上清液,加入6 種農藥混合標準溶液混勻,制備農藥質量濃度為4 mg/L的豇豆加標樣品Ⅰ;另取一批次豇豆樣品上清液,與4 種農藥混合標準溶液混勻,制備農藥質量濃度為10 mg/L的豇豆加標樣品Ⅱ。

1.3.2 檢測條件參考文獻[18]方法的測試條件:載氣為He(純度≥99.999%),流速為1.0 mL/min;EI離子源電壓為70 eV;進樣口、離子源及傳輸線溫度均為280 ℃;進樣量為1 μL,采用不分流進樣模式;洗脫升溫程序為95 ℃保持1.5 min,然后以20 ℃/min的速率升溫至190 ℃,再以5 ℃/min的速率升溫至230 ℃,最后以25 ℃/min的速率升溫至290 ℃,保持15 min。

1.3.3 計算步驟在MWTTFA算法基礎上,本文建立了OMWTTFA算法,增加了自適應迭代重加權懲罰最小二乘(Adaptive Iterative Re-weighted Penalized Least Squares, airPLS)計算步驟[19],可扣除不規則基線,消除色譜信號中基線的波動干擾。計算步驟如下:

1)參照文獻[20]中方法,通過NIST和SDBS數據庫收集500種農藥殘留標準MS數據,創建農藥殘留非靶向篩查數據庫。

2)采用airPLS 扣除豇豆GC-MS數據中的基線波動干擾,利用所建立的農藥殘留非靶向篩查數據庫與OMWTTFA算法得到的MS進行匹配,如果匹配度小于匹配閾值(700‰),則判定該農藥殘留組分信息不存在于該GC-MS數據中,如果匹配度大于匹配閾值,則判定該農藥殘留組分信息可能存在于該數據中,進行下一步計算。

3)根據第二步的篩選結果,將大于700‰的匹配區域與總離子流色譜圖的對應保留時間區域進行對比,若該保留時間區域內無明顯色譜峰,則認為該農藥殘留組分信息不存在于該GC-MS數據中;若在該保留時間區域內存在明顯色譜峰與之對應,則判定該農藥殘留組分存在于該GC-MS數據中。

4)如果相同保留時間區域存在多個對應的色譜峰,或同一組分被判定在不同保留時間區域內有多個對應的色譜峰,則需要把匹配度值最大的MS與農藥殘留非靶向篩查數據庫中的MS進行比對,如果兩者相似,則判定該農藥殘留組分存在于該GC-MS數據中。

1.4 數據處理

在個人PC機上采用matlabR2020a軟件實現OMWTTFA算法的程序化。將GC-MS數據轉換為cdf格式數據,代入OMWTTFA程序進行計算,以實現豇豆中多農藥殘留非靶向檢測。

2 結果與討論

2.1 豇豆樣品總離子流圖分析

圖1為豇豆和加標樣品總離子流圖。由圖1可知,所有組分譜峰出現在30.00 min保留時間內。3組樣品的原始總離子流圖信號中均存在基線波動,在4.00～8.00 min和14.00～20.00 min處較明顯;由OMWTTFA算法處理后的總離子流圖的基線基本與0坐標軸重合,基線波動得到有效消除,色譜峰更加清晰;豇豆樣品中待測組分主要分布在10.00～25.00 min保留時間區域,而豇豆加標樣品Ⅰ中待測組分主要分布在5.00～25.00 min保留時間區域,豇豆加標樣品Ⅱ中待測組分主要分布在10.00～20.00 min保留時間區域。然而,由于豇豆樣品成分復雜,其總離子流圖中譜峰繁多,信號較復雜,如果缺少農藥標準樣品,將較難快速找到未知農藥殘留所對應的色譜峰,進而難以實現樣品中農藥殘留的非靶向檢測。

圖1 豇豆和加標樣品總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of cowpea and spiked samples

2.2 基于OMWTTFA算法的非靶向檢測結果

2.2.1 豇豆樣品中農藥殘留非靶向檢測結果經OMWTTFA算法第二步計算后,豇豆樣品中存在13 種組分的匹配度閾值超過了700‰。然而,經第三步和第四步計算后,僅(Z)-8-十二烯基乙酸酯符合篩選要求。圖2為豇豆樣品中(Z)-8-十二烯基乙酸酯匹配度曲線及其MS圖。由圖2a)可知,(Z)-8-十二烯基乙酸酯有明顯超過閾值700‰的匹配區域;由圖2b)可知,在總離子流圖所對應的保留時間13.95～14.11 min區域存在明顯的色譜峰,可判斷該組分信息可能存在于豇豆樣品GC-MS數據中;由圖2c)—d)可知,(Z)-8-十二烯基乙酸酯的標準質譜信息與實驗質譜信息具有較高的相似性,故判定(Z)-8-十二烯基乙酸酯存在于豇豆樣品中。(Z)-8-十二烯基乙酸酯又稱梨小食心蟲信息素,為昆蟲自身分泌的微量化學物質,但在豇豆樣品中未檢出該農藥殘留。

圖2 豇豆樣品中 (Z)-8-十二烯基乙酸酯匹配度曲線及其MS圖Fig.2 Matching curves and mass spectra of (Z)-8-dodecenyl acetate in cowpea samples

2.2.2 豇豆加標樣品Ⅰ中農藥殘留非靶向檢測結果利用豇豆加標樣品Ⅰ對OMWTTFA算法的可行性進行驗證,發現經過OMWTTFA算法第二步計算,豇豆加標樣品Ⅰ中有21 種組分的匹配度閾值超過了700‰。根據OMWTTFA算法第三和第四步篩選后,豇豆加標樣品Ⅰ中 6 種農藥組分均成功檢出。圖3為豇豆加標樣品Ⅰ中甲霜靈匹配度曲線及其MS圖。由圖3a)—b)可知,甲霜靈的匹配度曲線在保留時間11.25～11.35 min區域存在對應的色譜峰;由圖3c)—d)可知,在保留時間11.25～11.35 min區域的實驗MS圖與標準MS圖基本一致,故豇豆加標樣品Ⅰ中檢測出甲霜靈。

圖3 豇豆加標樣品Ⅰ中甲霜靈匹配度曲線及其MS圖Fig.3 Matching curves and mass spectra of metalaxyl in cowpea spiked sampleⅠ

2.2.3 豇豆加標樣品Ⅱ中農藥殘留非靶向檢測結果利用豇豆加標樣品Ⅱ進一步驗證OMWTTFA算法對其他農藥的適用性,經OMWTTFA算法第二步計算,豇豆加標樣品Ⅱ中有21 種組分的匹配度閾值超過了700‰。圖4為豇豆加標樣品Ⅱ中二溴磷、敵敵畏匹配度曲線及其MS圖。根據OMWTTFA算法第三步并結合圖4a)—c)可知,二溴磷與敵敵畏在保留時間4.87～4.96 min區域對應同一色譜峰,將二溴磷、敵敵畏的標準MS圖分別與保留時間4.87～4.96 min區域實驗MS圖對比,結果見圖4d)—f)。由圖4d)—f)可知,二溴磷的標準MS圖與實驗MS圖不一致,可判定豇豆加標樣品Ⅱ中不存在二溴磷;而敵敵畏的標準MS圖與實驗MS圖基本一致,故判定豇豆加標樣品Ⅱ中存在敵敵畏。此外,經OMWTTFA算法計算步驟篩選后,其余3種有機磷農藥均被檢出。由此可知,OMWTTFA算法可實現多種有機磷農藥的非靶向檢測。

圖4 豇豆加標樣品Ⅱ中二溴磷、敵敵畏匹配度曲線及其MS圖Fig.4 Matching curves and mass spectra of 2-dichloroethyl dimethyl phosphate and dichlorvos in cowpea spiked sampleⅡ

2.3 OMWTTFA算法與MWTTFA算法檢測對比結果

表1為 豇豆樣品經OMWTTFA算法與MWTTFA算法的解析結果。由表1可知,在兩種算法解析下,檢出組分的匹配度均超過800‰。經MWTTFA算法解析,豇豆樣品中(Z)-8-十二烯基乙酸酯仍作為農藥殘留中間物被檢出,豇豆加標樣品Ⅱ中檢出4 種加標組分;相較OMWTTFA算法,豇豆加標樣品Ⅰ中僅檢出5 種加標組分,未檢出萎銹靈。以上結果表明,OMWTTFA算法可增加airPLS計算步驟,扣除不規則基線,消除色譜信號中基線的波動干擾,因此其檢測準確性優于MWTTFA算法,可實現豇豆中多農藥殘留的準確非靶向檢測。

表1 豇豆樣品經OMWTTFA算法與MWTTFA算法的解析結果Table 1 Analysis results of cowpea samples by OMWTTFA and MWTTFA algorithm

3 結論

本文提出了OMWTTFA算法,建立了500 種農藥標準MS數據庫,結合GC-MS建立了一種豇豆中多農藥殘留非靶向檢測新方法,并對豇豆樣品及加標樣品進行了檢測。結果表明,該方法可在30.00 min保留時間內實現所有農藥的非靶向檢測,實際豇豆樣品中未檢出農藥,而兩組加標樣品中所有農藥均被檢出;能有效消除基線波動的干擾,實現豇豆樣品及豇豆加標樣品中多農藥組分的準確非靶向檢測,且準確性優于MWTTFA算法,有望為豇豆及其他果蔬中多農藥殘留檢測提供一種新途徑。但該方法目前尚未實現復雜食品基質效應的消除,且依舊較難實現同分異構體農藥殘留的準確檢測,還需作進一步研究。此外,還應采用更多果蔬樣品對該方法進行驗證,從而為果蔬中多農藥殘留非靶向檢測技術的開發提供指導。