維生素E對脊尾白蝦生長及抗氧化酶活性的影響*

李婉瑩,于淼淼,彭豫鵬,牟 華,c,2,高 煥,c,2,閻斌倫,c,2

(1.江蘇海洋大學 a.海洋科學與水產學院; b.江蘇省海洋生物技術重點實驗室; c.江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心,江蘇 連云港 222005; 2.江蘇省農業種質資源保護與利用平臺,江蘇 南京 210014)

0 引言

脊尾白蝦(Exopalaemoncarinicauda)屬于甲殼動物,體長為5～9 cm,體色透明,是我國特有的經濟養殖品種。脊尾白蝦一般生活在泥沙底質的淺海海域,在我國的渤海、黃海、東海和南海等區域的近海區域都有分布[1]。該蝦環境適應力強,具有廣溫和廣鹽的特性,在水溫2～38 ℃,鹽度4～35范圍內均能存活,同時生長周期短,2～3個月即可長到成體,所制成的海產品美味且營養豐富,深受消費者歡迎,已經成為重要的經濟水產動物之一[2]。

維生素是動物體內維持生命所需的一類有機化合物。目前已知的維生素種類很多,如維生素A、維生素B1、維生素C、維生素E等。其中維生素E又稱為生育酚,能有效防止體內紅細胞和細胞膜的氧化,但其在動物體內不能自主合成,動物只能通過外界攝入來獲取[3]。在水產動物營養生理研究方面,維生素E對水產動物的生長性能和抗氧化能力影響情況一直備受研究者的關注,維生素E也是甲殼類動物維持生殖和生理活動必需的營養素[4]。例如在飼料里添加適量的維生素E可以顯著提高羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)的抗氧化能力[5]。作為重要經濟養殖對蝦的脊尾白蝦,目前關于其人工配制飼料中應該添加的最適維生素E量還未見報道,這不利于脊尾白蝦大規模人工養殖活動的開展。因此本文希望通過對不同維生素E添加水平對脊尾白蝦生長和抗氧化能力影響的研究,來為精準研制脊尾白蝦人工飼料提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用脊尾白蝦為健康個體,用電子天平稱量各組蝦平均體質量為(1.31±0.31)g。維生素E添加劑、超氧化物歧化酶(SOD)(批號20230103)、過氧化氫酶(CAT)(批號20230103)、過氧化物酶(POD)(批號20221115)測定所用試劑盒由南京建成生物公司生產。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計 選取大小均勻、體格健壯、活力強的脊尾白蝦450尾,分成5組,每組設置3個平行,每個重復30尾,放入水箱(50 cm×40 cm×30 cm)進行養殖,維生素E添加劑按0 mg/kg(A組,對照)、200 mg/kg(B組)、400 mg/kg(C組)、800 mg/kg(D組)、1 600 mg/kg(E組)加入到配制的基礎飼料中進行投喂。脊尾白蝦基礎飼料配方和成分含量如表1所示。

1.2.2 實驗飼料制備 根據表1,參考王玉等[6]的方法準備材料,用篩子篩過后,于盆中加入各種材料并攪拌混勻,隨后再加入魚油攪拌混勻;混勻之后開始一邊攪拌一邊加入清水,進一步混勻后用擠壓機擠壓成1.0 mm大小的顆粒。擠壓出來的飼料放置于烘干箱中50 ℃烘干3～4 h,烘干完畢后取出進行含水量檢測,當含水量低于10%時即可封裝于袋中,現做現用。

1.2.3 養殖管理 在江蘇省海洋生物技術重點實驗室進行養殖實驗,自然采光,全天24 h充氧,鹽度為25,水溫為25 ℃,在全天曝氣的養殖環境中暫養一周。實驗前將脊尾白蝦饑餓24 h。每天投喂2次,投喂量為蝦體質量的3%,期間及時清理養殖環境里的殘餌和糞便并換水。

1.2.4 樣品采集 飼養結束后,饑餓脊尾白蝦24 h,測定蝦的體質量,每箱隨機取樣3尾,稱取肝胰腺質量;在樣品中按質量比1∶10的比例加入生理鹽水,冷凍勻漿,轉速為2 500 r/min,離心10 min,取上清液,棄沉淀,上清液于-80 ℃冰箱里保存。

1.3 指標測定

1.3.1 生長指標測定 養殖實驗結束后,計算各組脊尾白蝦的生長指標:增質量率(WGR)和特定生長率(SGR)。計算公式分別為

增質量率(%)=(實驗結束時脊尾白蝦的平均體質量-實驗初始脊尾白蝦的平均體質量)/實驗初始脊尾白蝦的平均體質量×100%,

特定生長率(%/d)=(ln(實驗結束時脊尾白蝦的平均體質量)-ln(實驗初始脊尾白蝦的平均體質量))/t×100%。

1.3.2 肝胰腺組織蛋白濃度測定 酶活測定前需要先測定脊尾白蝦肝胰腺組織蛋白濃度,蛋白濃度測定步驟如下。

(1) 首先配制標準液質量濃度為25 mg/mL,保存備用。

(2) 接著吸取標準液到96孔板里,加入適量生理鹽水,稀釋為等梯度的標準品(0,0.025,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mg/mL)。

(3) 然后用移液槍吸取200 μL的BCA工作液(V(A液)∶V(B液)=50∶1)到每個微孔里,在37 ℃恒溫培養箱里靜置30 min。

(4) 利用標準品繪制標準曲線(見圖1)。

1.3.3 肝胰腺組織抗氧化指標測定 取組織上清液用試劑盒進行酶活測定,步驟如表2～表4所示。

表2 ACP活力測定操作Table 2 ACP activity determination operation μL

表3 AKP活力測定操作Table 3 AKP activity determination operation μL

表4 SOD活力測定操作Table 4 SOD activity determination operation μL

(1) 孵育。將準備好的樣品逐一添加至96孔板中,在適當溫度下孵育一段時間。

(2) 讀取結果。使用酶標儀讀取每個孔的顏色強度,顏色強度與組織中酶活性成正比。

(3) 數據分析。根據已知濃度標準曲線,計算樣本中抗氧化酶活性。

1.4 數據統計與分析

使用軟件SPSS進行差異顯著性分析,P<0.05表示存在顯著性差異。

2 結果

2.1 飼料維生素E對脊尾白蝦生長的影響

脊尾白蝦的生長指標變化情況如表5所示?？梢钥闯?生長指標隨著維生素E的水平增加而逐漸增加,脊尾白蝦增質量率和特定生長率呈現先上升后下降趨勢;其中在維生素E添加量為400 mg/kg時,蝦的增質量率和特定生長率最高,超過此質量分數則呈現下降趨勢。

表5 飼料中維生素E水平對脊尾白蝦生長的影響(平均差±標準差)Table 5 Effect of vitamin E level in feed on the growth of Exopalaemon carinicauda (Mean±SD)

2.2 飼料維生素E對脊尾白蝦抗氧化酶活性的影響

本實驗通過對各組脊尾白蝦肌肉中抗氧化酶的活性來反應脊尾白蝦的抗氧化指標情況。具體影響如表6所示,隨著維生素E水平的增加,脊尾白蝦肌肉中SOD酶活性呈現先上升后下降趨勢;在添加量為400 mg/kg時SOD酶活性最高,超過此質量分數則呈現下降趨勢。各組間CAT和POD酶活性并沒有顯著性差異。

表6 飼料中添加維生素E水平對脊尾白蝦抗氧化酶活性的影響(平均值±標準差)Table 6 Effect of vitamin E level in feed on antioxidant enzyme activity of Exopalaemon carinicauda (Mean±SD)

3 討論

3.1 飼料維生素E對脊尾白蝦生長的影響

維生素E可以防止DNA結構變異,促進酶的合成和抑制活性氧(ROS)反應,保證機體各項生理活動正常運行,具有促進生長發育的功能[7]。單凡等[8]研究表明,飼料中維生素E添加量為103.4～631.7 mg/kg組的羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)增質量率(WGR)和特定生長率(SGR)顯著增加?？子星俚萚9]研究表明,隨著飼料中維生素E添加量增加,日本沼蝦(Macrobrachiumnipponense)的WGR呈先升高后下降的趨勢。這與本研究結果相似,與對照組相比,當維生素E添加量為200～400 mg/kg時脊尾白蝦的WGR和SGR增加,添加量為400 mg/kg時達到最高,但添加量為600～800 mg/kg時呈下降趨勢,并在800 mg/kg時顯著低于對照組。說明飼料中添加維生素E量太高反而會破壞蝦體內環境穩定,增加蝦體內代謝負擔,從而抑制蝦的生長發育活動[10]。

3.2 飼料維生素E對脊尾白蝦抗氧化酶活性的影響

由于沒有成對的電子,所以ROS化學活性很強,主要包括O2-,O3和H2O2等,ROS為機體免疫系統的重要組成部分,通過氧化攻擊病原體,達到保護機體的目的[11]。通常,在機體抗氧化酶作用下,過多的ROS可以通過化學反應等方式降低氧化作用,避免其無差別攻擊體內細胞[12],但一旦產生過多自由基,會導致細胞加速衰老并且產生病變[13]。在正常的生理狀態下,機體代謝產生的活性氧可被抗氧化系統控制得以及時清除[14];抗氧化酶可防止細胞組織被氧化損壞[15]。

本次實驗通過提取脊尾白蝦的肝胰腺組織來測定抗氧化酶的酶活。結果表明,維生素E水平為200～400 mg/kg時,脊尾白蝦SOD活性隨著維生素E水平升高而升高,且在400 mg/kg時活性最高,超過這個水平范圍便呈現下降趨勢。這說明維生素E水平過高,可能會增加脊尾白蝦肝胰腺代謝的負擔,導致SOD酶活力下降[16]。已有研究表明,各組日本沼蝦肝胰腺的SOD酶活力隨飼料維生素E水平的增加呈先上升后下降的變化趨勢[10];陳文燕[17]研究發現雜交鱧(Channaargus×Channamaculata)的SOD活性隨維生素E水平的增加呈先升高后降低的趨勢,這與本文實驗結果相似。但本實驗中蝦肌肉中CAT和POD活性并沒有隨著維生素E添加量增加而發生顯著性變化。王海燕[18]研究中發現,在飼料中添加不同水平維生素E的幼蛙肝臟的CAT活力差異不顯著;Wang等[19]研究發現,在黃菇魚(Nibeaalbiflora)飼料中添加維生素E對于CAT活性無影響,但是使SOD活性顯著增加?？子星俚萚9]發現日本沼蝦CAT活性隨著飼料中維生素E水平的升高而下降,原因可能是維生素E作為一種抗氧化劑,可代替多種抗氧化酶來保護機體免受氧化損害。所以在本實驗中脊尾白蝦肌肉中CAT和POD酶活性沒有隨著維生素E的添加而增加,并不能代表飼料中添加維生素E沒有提高脊尾白蝦抗氧化能力。

4 結論

本實驗通過在飼料中添加不同水平維生素E,來探究維生素E水平對脊尾白蝦生長性能和抗氧化酶活性的影響。結果顯示,與對照組相比,飼料維生素E水平在400 mg/kg時,脊尾白蝦增質量率、特定生長率和SOD酶活性最高。