生物強化促進餐廚垃圾高溫厭氧消化產甲烷性能的研究＊

杜學勛，史晶晶，張斯穎

（1.上海老港固廢綜合開發有限公司，上海 200237；2.中國科學院上海高等研究院，上海 201210）

0 引言

餐廚垃圾是居民在日常飯后所剩余的各類殘渣的總稱，也是城市生活垃圾的重要組成部分［1］。隨著生活水平的提升，餐廚垃圾的產生量逐年上漲［2］，預計到2025 年我國餐廚垃圾產生量將超過1.7×108t［3］。餐廚垃圾具有高含水量、高有機物含量的特點，如果不及時處理，極易腐爛變質、產生惡臭氣味并滋生細菌和蚊蟲，不僅會造成嚴重的環境污染，還會危害人類健康［4］。但同時餐廚垃圾也具有高有機質的能源屬性，能夠產生生物質能源［5］。因此近年來，如何高效處理餐廚垃圾，將餐廚垃圾的資源與環境屬性相統一，在2060 年基本完成低碳能源轉型目標成為研究的重點。

厭氧消化技術是目前處理餐廚垃圾的主流技術，主要由厭氧微生物經過水解、酸化、乙酸化、產甲烷這4 個階段降解有機物，將其轉化為清潔能源，實現廢棄物再利用，是一種高效可行的技術［6］。然而餐廚垃圾的厭氧消化過程容易受到抑制，這是由于餐廚垃圾低C/N、高油高鹽的特性導致微生物活性低，最終造成了厭氧消化效率低下甚至系統崩潰。而生物強化技術可以通過在厭氧消化系統中加入經過篩選、優化的優勢功能菌種純培養物，提高有機物的生物轉化效率［7］。相關研究發現，加入具有一定功能的微生物能夠在很大程度上提高厭氧消化的效率。在馬纓丹（Lantana camara）厭氧消化體系中接種2 種纖維素降解菌Microbacteriumsp.DSB1、Arthobactersp.DSB12進行生物強化，甲烷產量分別提高了57%和60%［8］。有研究利用在生物炭上生長的嗜熱甲烷單胞菌（Methanosarcina thermophile）對餐廚垃圾進行生物強化，甲烷產率最高增加了37%［9］。另外有研究發現將富集得到的耐丁酸微生物菌群（屬水平主要包括Sporanaerobacter、Proteiniphilum、Syntrophomonas）加入到以餐廚垃圾為原料的酸化發酵罐中進行生物強化后，酸化系統得到明顯恢復，產甲烷量（以VS 計）提高了52.2 mL/g［10］。因此添加功能微生物是提高厭氧消化效率切實可行的方式。

此前，實驗室從餐廚垃圾的高溫厭氧消化反應器中分離出1 株水原脲芽孢桿菌（Ureibacillus suwonensisE11），目前Ureibacillus suwonensis僅被報道在棉花廢棄物堆肥的堆體中分離得到，其功能還未被研究［11］，也沒有將其應用在厭氧消化過程中。因此有必要探究從高溫厭氧消化系統中分離得到的E11 對餐廚垃圾高溫厭氧消化系統的生物強化作用。前期已經通過甲烷潛力測定實驗證實E11 的添加可以有效提高餐廚垃圾的高溫厭氧消化系統的甲烷產量，然而功能微生物的添加量是影響生物強化效果及成本的重要因素，故本研究考察功能微生物E11 對餐廚垃圾高溫厭氧消化生物強化效果的影響，確定最佳劑量，并揭示生物強化的微生物機理，為生物強化提高餐廚垃圾的高溫厭氧消化性能提供理論基礎和指導。

1 材料與方法

1.1 底物與接種物

底物餐廚垃圾取自某單位食堂，主要包括餐后剩余的飯菜、廢棄的菜葉、果皮和生肉等。所有原料經粉碎后于4 ℃儲存。原始發酵污泥取自上海某濕垃圾處置單位穩定運行的餐廚垃圾中溫（37 ℃）濕式厭氧發酵罐。采用一步式啟動法馴化高溫接種物，將厭氧連續攪拌反應器（CSTR）的運行溫度設定至55 ℃，每天投加餐廚垃圾，其OLR（以VS 計）為1 g/（L·d），富集嗜熱厭氧微生物。接種物取自實驗室穩定運行3 個月以上的CSTR。實驗開始前，對接種物進行饑餓處理，完全消耗接種物中的有機物直至不產氣。底物和接種物的基本特征如表1 所示。

1.2 微生物培養

本實驗生物強化使用的微生物取自實驗室前期從餐廚垃圾高溫厭氧消化反應器中分離出的土著微生物E11，鑒定為Ureibacillus suwonensis。在實驗開始之前，將保菌管內的菌體稀釋涂布至固體培養基上活化，放置55 ℃厭氧培養箱培養24 h。隨后將單菌落接至試管中培養24 h 作為一級種子培養液，再按3% 的比例接至125 mL 的液體培養基中擴大培養24 h 得到菌液。

固體培養基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨3 g/L，牛肉粉2 g/L，酵母粉3 g/L，NaCl 4 g/L，（NH4）2SO43 g/L，KH2PO40.75 g/L，K2HPO40.75 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，半胱氨酸0.25 g/L，瓊脂粉15 g/L，自然pH。

液體培養基：葡萄糖5 g/L，蛋白胨3 g/L，牛肉粉2 g/L，酵母粉3 g/L，NaCl 4 g/L，（NH4）2SO43 g/L，KH2PO40.75 g/L，K2HPO40.75 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，FeSO4·7H2O 0.05 g/L，半胱氨酸0.25 g/L，自然pH。

1.3 菌懸液制備方法

本實驗設置實驗組添加菌液的體積為CSTR 工作體積的5%、10%、15%和20%。為了排除菌液中培養基對厭氧消化的影響，本實驗將不同體積的菌液在冷凍離心機中以6 000 r/min、15 min 的條件離心得到菌體沉淀，將不同體積菌液離心得到的沉淀分別重懸至100 mL 的無菌水中，得到不同濃度的菌懸液備用。

1.4 實驗方法

在工作容積為5 L 的CSTR 中進行高溫厭氧消化的甲烷潛力測定實驗。所有反應器均在55 ℃下穩定運行，以60 r/min 的速度攪拌。厭氧消化的接種物和底物比例（ISR），基于VS，設定為2.0。為研究不同添加量條件下餐廚垃圾厭氧消化的產甲烷性能，本實驗設置1 個對照組（CK）和4 個實驗組（R1、R2、R3、R4），實驗組對應的加菌濃度分別為5%、10%、15%、20%。CK 組加入100 mL 無菌水，實驗組加入100 mL 菌懸液。在實驗開始前，用氮氣沖洗頂空15 min 以確保厭氧條件。在厭氧發酵過程中，每天記錄發酵系統的甲烷產量、甲烷含量、pH。定期采集發酵液樣品用來檢測氨氮和VFAs。所有實驗均設置3 組平行樣。

1.5 分析方法

根據產氣情況分別使用規格為10、5、1 L 的沼氣采樣袋（E-switch，上海）收集沼氣，并通過沼氣流量計（VIPPEN HR03，碧臣儀器，中國）測量甲烷體積。所有甲烷產量數據都轉換為標準溫度（273 K）和1 個標準大氣壓（101 325 Pa）下的體積。pH 通過pH 計（賽多利斯PB-10，德國）測定。氣體成分（甲烷、二氧化碳）含量采用日本島津氣相色譜儀GC-2010 Plus 測定，熱導池檢測器（TCD）；色譜柱為TDX-01（2 m×2 mm）填充柱，載氣為高純氬氣，流量40 mL/min；柱溫120 ℃，進樣口和檢測器溫度150 ℃，電流20 mA，進樣量1 mL。揮發性脂肪酸（Volatile Fatty Acid，VFA）采用日本島津氣相色譜儀GC-2010 Plus 測定，氫火焰離子化檢測器（FID），色譜柱為Rtxwax（30 m×0.25 mm×0.25μm）彈性石英毛細管柱，載氣為高純氮氣；檢測器溫度為230 ℃；進樣器溫度為220 ℃；程序升溫80 ℃（保持2 min），升溫速率20 ℃/min，最終溫度200 ℃（保持8 min）；進樣量為0.3 μL。利用Nessler 試劑分光光度法分析總氨氮（Total Ammonia Nitrogen，TAN）。根據式（1） 計算游離氨氮（Free Ammonia Nitrogen，FAN）。

式中：T為溫度，℃。

1.6 宏基因組測序分析方法

使用100 mL 的無菌注射器從反應器中收集后續用于基因組DNA 提取的樣品，置于4 ℃，6 000 r/min、15 min 離心后分離沉淀和上清液，沉淀用液氮速凍后存放于-80 ℃冰箱，用于后續宏基因組分析。

全基因組DNA 提取利用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega Bio-tek，美國）試劑盒進行樣品DNA抽提。之前的研究中詳細報道了雙端文庫構建、宏基因組測序生成、拼接組裝和非冗余基因集構建的方法［12］。使用Diamond 軟件（Version 0.8.35）將非冗余基因集的氨基酸序列與NR 數據庫進行比對（BLASTP 比對參數設置期望值e-value 為1×e-5），并通過NR 庫對應的分類學信息數據庫獲得物種注釋，然后使用物種對應的基因豐度總和計算該物種的豐度。

2 結果與分析

2.1 功能微生物添加量對高溫厭氧消化產甲烷性能的影響

通過添加不同比例的功能微生物對餐廚垃圾的高溫厭氧消化進行生物強化，探究最佳的功能微生物添加量。產甲烷量是評價厭氧消化性能最重要的指標，不同處理組下餐廚垃圾厭氧消化的產氣性能如圖1 所示。接種后，R3 組的日產甲烷量在第1 天就達到峰值，其他處理組日產甲烷量均在第2 天達到最大值，隨后呈整體波動下降的趨勢（圖1）。各組累積產氣量持續上升，在第17天達到最大值，隨后保持穩定。由圖1 中可以看出，生物強化組的累積產甲烷量均高于CK 組。之前有研究指出，嗜熱尿芽孢桿菌（Ureibacillus thermophilus）能夠產生降解復雜有機物的裂解酶，進而有效地降解污泥［13-15］。根據推測，經E11 生物強化后的厭氧消化甲烷產量較高，這可能是因為E11 的添加能夠產生降解有機物的活性酶，或者通過微生物之間的相互作用使其他功能微生物富集，最終表現在有機物水解更加徹底、甲烷產量更高。在生物強化組中累積產甲烷量隨著E11 添加量的增加而增加，R4 組的產甲烷量最高，在第18 天的累積產氣量（以VS 計）達到576.03 mL/g，相比于CK 組（452.86 mL/g）提高27.20%。當菌種添加量為15%時（R3），累積產甲烷量（以VS 計）略低于 R4， 為 575.14 mL/g， 相 比 CK 組 提 高 了27.00%。雖然R4 中E11 的添加量更高但是累計產甲烷量和R3 組幾乎相同，這一現象與張新杰等［16］的研究結果相似，推測可能是由于功能微生物與本土菌株之間的競爭以及營養缺乏所致。結合產甲烷量的結果和經濟性考慮，利用E11 進行生物強化的最佳添加劑量為15%。

2.2 功能微生物添加量對高溫厭氧消化甲烷含量的影響

在厭氧消化的過程中甲烷含量是反映甲烷菌活性和消化性能的重要指標。在本實驗中，不同功能微生物添加量對甲烷含量的影響如圖2 所示。在初始階段，各組甲烷含量先下降，隨后增加，并在第5 天達到最高。在系統穩定運行的情況下，各組的甲烷含量差異不大，波動范圍為50%～70%。相比于文獻中報道的甲烷含量［17-19］，本實驗的甲烷含量均處于較高水平，可能是由于本實驗的運行條件是55 ℃，在高溫條件下水解產酸階段進程更快、效率更高，使產甲烷菌有更多可利用的底物，從而提高甲烷濃度。各組的甲烷含量差異隨著消化進程逐漸增大，CK 組整體的甲烷含量水平低于添加E11 的實驗組，甲烷含量最大值出現在R3 中，達到73.53%。說明E11 的添加可有效提高甲烷產率，其中添加量為15% 時甲烷產生的效果最佳。

圖2 功能微生物添加量對甲烷含量的影響Figure 2 Effect of bioaugmentation dosage on methane content

2.3 功能微生物添加量對高溫厭氧消化pH 和乙酸濃度的影響

對于厭氧消化系統中的產甲烷菌來說，合適的pH 是非常重要的，pH 過高或過低都會直接影響微生物的活性，降低底物的轉化效率，導致厭氧消化失?。?2，20］。而VFAs 是厭氧消化過程中一種非常重要的中間產物，其中乙酸占比最高。乙酸是可以被產甲烷菌直接利用的一種物質，乙酸濃度過高會導致pH 的迅速降低，從而降低厭氧消化效率，但是濃度過低又會造成產甲烷菌可以利用的底物不足，導致產甲烷效率低。因此，pH和乙酸濃度是反映厭氧消化系統穩定性的重要指標。

厭氧消化期間pH 變化如圖3 所示，pH 在所有組之間的變化趨勢相似，每組的pH 均在實驗開始的第1 天迅速下降，隨著消化過程的進行pH 持續升高，第6 天后逐漸穩定，最終穩定在8.5 左右，這與He 等［21］的研究中由于VFAs 的轉化和氨的積累，導致高溫消化系統中的高pH 現象一致。第1 天pH 的迅速降低可能是由于底物的快速水解，產生大量的乙酸，產甲烷菌未將其及時轉化。這一現象在Zhang 等［22］的文章中得到證實。乙酸在消化過程中經過產甲烷菌的代謝生成甲烷和其他產物，導致系統中的pH 升高。

圖3 功能微生物添加量對高溫厭氧消化系統中pH 和乙酸濃度的影響Figure 3 Effects of bioaugmentation dosage on pH and acetic acid concentration in thermophilic anaerobic digestion system

在厭氧消化過程中僅有乙酸和極少量丙酸被檢出，由圖3 中可以觀察到乙酸濃度在不同組中的變化規律。所有組的乙酸濃度變化趨勢相似，均在第1 天達到了最大值，隨著消化的進行乙酸被快速代謝，濃度迅速下降，從第6 天開始趨于穩定。R1、R2、R3 組第1 天的乙酸濃度都比CK組高，但最后穩定階段CK 組的乙酸濃度最高，并且R3 組的乙酸濃度在第9 天降為0，說明R3 組中的乙酸被完全利用，這可能是R3 組累積產甲烷量較高的原因之一。在其他生物強化組中甲烷產量的高低和穩定階段的乙酸濃度成反比，說明添加E11 的生物強化措施可以有效促進乙酸被產甲烷菌利用，提高沼氣產量。

綜上，生物強化可以在一定程度上提高乙酸的利用率。當E11 的添加量為15% 時，乙酸被利用得最徹底。

2.4 功能微生物添加量對高溫厭氧消化TAN 和FAN 濃度的影響

在餐廚垃圾的厭氧消化過程中，由于有機氮化合物的轉化，氨氮含量和pH 會逐漸增加，當TAN 超過閾值濃度時會產生抑制作用。TAN 是FAN 和NH4+測量值的總和，從現有研究來看，FAN 似乎是導致氨氮抑制更為重要的因素，FAN可能直接抑制特定酶的活性或通過被動擴散進入微生物細胞，改變細胞外基質，隨后改變鈉鉀平衡。在本實驗中通過對TAN 和FAN 濃度的監測來評判高溫厭氧消化體系的穩定性。不同生物強化劑量下厭氧消化系統TAN 和FAN 濃度的變化如圖4 所示。圖4 顯示了每組TAN 濃度的變化，5 個反應器的TAN 濃度范圍為880～3 660 mg/L。有文獻報道稱當TAN 濃度高于8 000 mg/L 時，通常會發生完全氨抑制［23］，根據本實驗反應體系中的TAN濃度推測該反應體系相對較為穩定，并沒有明顯的氨抑制現象發生。CK、R1、R2 組的TAN 濃度均在第1 天達到最低值，R3 組和R4 組在第2 天達到最低，隨后各組TAN 濃度開始增加，從第6天開始基本穩定。此外，由圖4 可看出，各組FAN 濃度波動范圍為71～645 mg/L，所有組的FAN濃度變化趨勢與TAN 的變化趨勢基本一致。有研究指出高溫厭氧消化系統中FAN 的濃度會高于中溫厭氧消化，一般波動范圍為400～800 mg/L［24］，本實驗系統中的FAN 濃度均處于正常范圍，消化系統可以穩定運行。

圖4 功能微生物添加量對TAN 和FAN 的影響Figure 4 Effects of bioaugmentation dosage on TAN and FAN

2.5 生物強化對高溫厭氧消化微生物群落結構的影響

根據累積甲烷產量的數據并考慮經濟性，E11 的最佳添加量為15%。為探究生物強化高溫厭氧消化產沼氣的微生物作用機制，本實驗選擇CK 組和R3 組消化達到穩定時（第7 天）的樣品進行宏基因組測序，將得到的序列與NR 數據庫進行比對，其微生物群落差異分析如圖5～圖7所示。

圖5 功能微生物添加量對門水平微生物群落的影響Figure 5 Effects of bioaugmentation dosage on microorganism at phylum level

CK 組和R3 組在門水平上的微生物結構的差異如圖5 所示，添加E11 后雖然E11 所在的厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度并沒有增加，但是反應器中的熱袍菌門（Thermotogae）、廣古菌門（Euryarchaeota）和增效菌門（Synergistetes）微生物的相對豐度明顯增加。熱袍菌門在之前的研究中被報道是嗜熱厭氧消化中的優勢門，可以在高溫下穩定存活并且降解糖產生CO2和乙酸，為產甲烷菌提供可以利用的底物。熱袍菌門微生物的增加說明在添加E11 后糖類物質的降解更加徹底，從而提高甲烷的產率。廣古菌門是厭氧消化系統中非常重要的一類微生物，包含能夠產生甲烷的產甲烷菌，這可能是添加E11 后甲烷產率高的原因之一。在厭氧消化過程中蛋白質被水解為肽和氨基酸，這些肽和氨基酸隨后被發酵為VFAs，最后被混合微生物種群發酵為甲烷和CO2，增效菌門已經被證明可以降解氨基酸［25］，屬于該門的微生物很可能在消化系統中的產酸階段發揮重要作用。添加E11 后增效菌門相對豐度的提升說明厭氧系統的水解效率在一定程度上可能被提高，這與生物強化組的乙酸濃度較高的現象基本一致。VFAs在乙酸生成過程中的氧化通常發生在與產甲烷菌的協同共生關系中，產乙酸菌通常將醇類和VFAs分解成乙酸鹽、甲酸鹽、H2和CO2，這些物質隨后被產甲烷菌利用［26］。因此，這類細菌的豐度增加可以提高甲烷產量。

從屬水平（圖6～圖7）上看，Defluviitoga的相對豐度在R3 組中顯著提高（p＜0.05），Defluviitoga是厭氧消化過程中相對豐度最高的水解細菌，可以產生不同的碳水化合物活性酶，并利用多糖（如纖維素、幾丁質和木聚糖）產生乙酸、H2和CO2，隨后被產甲烷古菌利用產生甲烷［27］。Defluviitoga豐度的提升可以有效促進厭氧消化過程中底物的水解。Hydrogenispora同樣是一種在厭氧消化系統中豐度較高的水解菌，這類微生物可將葡萄糖、麥芽糖和果糖等碳水化合物發酵成乙酸、乙醇和H2。這2 類關鍵水解菌豐度的提高表明生物強化系統中微生物對底物的水解能力加強，底物可以更加充分地被利用。醋微菌屬Acetomicrobium是一類嚴格厭氧的耐高溫細菌，可以將底物中的糖轉化為乙酸鹽、乙醇、CO2和H2，該菌屬的增加有助于厭氧消化過程中有機質的分解和沼氣的產生［28］。Syntrophaceticus是一類共養型乙酸氧化菌，可以將乙酸鹽氧化為CO2和H2，該菌屬是以互養乙酸鹽氧化為主要產甲烷途徑的產甲烷過程中的關鍵微生物，其相對豐度的增加對厭氧消化有促進作用。脲芽孢桿菌屬Ureibacillus在R3 組中也顯著增加，可以認為E11 添加后可以有效在消化體系內定殖。Methanoculleus的相對豐度在R3 組中也被發現明顯升高（p＜0.05），這是一類嗜氫產甲烷菌，其含有以H2和CO2為底物的產甲烷途徑的編碼基因，可以高效利用H2和CO2生成甲烷［29］。在產甲烷代謝途徑中，氫營養型產甲烷途徑能效更高，嗜氫產甲烷菌Methanoculleus豐度的增加可以有效提高甲烷的生成效率。并且Methanoculleus具有很強的耐氨性，其中銨轉運蛋白和甲基銨通透酶的缺失可解釋對富含銨或氨的環境的適應性特征［29］。之前的研究表明當TAN 的濃度維持在1 000 mg/L 以上時，這類產甲烷菌會成為優勢微生物，本實驗的TAN 處于1 000 mg/L 以上，所以這類產甲烷菌在本實驗的反應器中豐度較高［30-31］?？傊?，生物強化使Methanoculleus相對豐度的提升可能是高溫厭氧消化產甲烷效率提高的原因之一。

圖6 功能微生物添加量對屬水平微生物群落的影響Figure 6 Effects of bioaugmentation dosage on microorganism at genus level

3 結論

利用Ureibacillus suwonensisE11 對餐廚垃圾高溫厭氧消化系統進行生物強化可以有效促進甲烷產生，其中15% 的添加劑量最佳，累積甲烷產量（以VS 計） 達到575.14 mL/g，相比 于CK 組（452.86 mL/g）提高了27.00%。功能微生物添加量為15% 時不僅有效提高了乙酸濃度，為產甲烷菌提供可利用的底物，還提高了產甲烷菌對乙酸的利用效率，使乙酸最終被完全利用。微生物群落結構演替規律表明E11 可以在厭氧消化系統內定殖，并且該菌株的添加不僅可以提高重要水解細菌的相對豐度，促進消化系統中的水解步驟，還提高了嗜氫產甲烷菌Methanoculleus的相對豐度，從而提高甲烷產率。