基于RPA的病原體快速診斷策略

許淑瑩，王冬梅，歐陽松應，2

(1.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350117；2.福建師范大學南方生物醫學研究中心，福建 福州 350117)

核酸檢測是病原體快速檢測的重要方法之一，對于在實驗室中難以培養或生長速度不理想的病原體來說，基于核酸擴增的檢測技術具有明顯優勢[1]。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)[2]可以擴增特定核酸序列片段，廣泛應用于檢測中，迄今為止，大多數核酸檢測是通過PCR或實時熒光定量PCR (real-time quantitative PCR，qPCR)進行的[3]，但PCR需要變溫熱循環過程，需要專業人員配備專業儀器進行操作，檢測時間長，限制其在現場檢測的應用。為了滿足現場診斷需求，近年來研究學者們開發了多種等溫核酸擴增技術，包括環介導等溫擴增技術(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)[4]、依賴核酸序列性擴增技術 (nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)[5]、單引物等溫擴增(single primer isothermal amplification，SPIA)[6]、鏈置換擴增技術(strand displacement amplification，SDA)[7]、依賴解旋酶的等溫擴增技術(helicase-dependent amplification，HDA)[8]、滾環擴增技術(rolling circle amplification，RCA)[9]和重組酶聚合酶擴增技術(recombinant enzyme polymerase amplification，RPA)[10]等。等溫擴增技術在恒溫條件下進行，減少了對變溫儀器的需求，其中，RPA在37～42 ℃之間反應15～20 min即可完成，具有更大的應用潛力。

1 RPA的原理及技術流程

1.1 原理

RPA是由英國TwistDx公司于2006年提出的核酸擴增技術[10]。該技術利用多種酶在體外模擬T4噬菌體內的DNA復制系統，在恒溫條件下實現擴增。傳統PCR反應無法在恒溫條件下實現擴增，近幾年發展較快的LAMP、NESBA等可以在65 ℃恒溫條件下完成擴增反應，而RPA可以在37～42 ℃的條件下實現恒溫擴增。RPA與PCR具有相似的一點是利用兩個相反引物實現擴增，這使其在引物設計上相比較于恒溫擴增技術更具優勢，其他的等溫擴增技術如LAMP需要設計復雜的引物，這也成為非特異性擴增出現的原因之一。PCR反應依賴耐高溫的DNA聚合酶，反應過程需要復雜的變溫程序來實現擴增，而RPA恒溫擴增反應過程需要更多的酶參與。以重組酶(Uvs X)、DNA單鏈結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶作為核心酶[10]，其擴增原理是重組酶Uvs X蛋白在加載因子(T4 Uvs Y)協助下與寡核苷酸引物形成核蛋白絲復合物，該復合物在雙鏈DNA模板尋找同源序列并通過引物在同源位點進行鏈交換形成 D環，D環一側為引物與模板鏈雜交形成的雙鏈結構，另一側為解開的互補鏈，單鏈結合蛋白隨即結合互補鏈，防止引物解離，隨后重組酶從核蛋白絲結構上解體后，在dNTPs存在下新引物啟動另一條鏈置換反應，DNA聚合酶結合引物的一端進行延伸，并通過循環過程實現指數擴增[3](見圖1)。

圖1 RPA擴增原理圖Fig.1 RPA amplification schematic

1.2 反應條件和引物探針設計

RPA反應體系包括Tris、乙酸鉀、乙酸鎂、二硫青素醇(DTT)、Carbowax20M(或聚乙二醇)、dNTPs、ATP、磷酸肌酸、肌酸激酶等[10]，同時需要加入引物探針組合以及反應關鍵酶，整個反應在37 ℃條件下進行。需要提出的是，體系成分的添加[11]和反應條件[12]對擴增有影響，如加入甜菜堿可以有效避免非特異性擴增出現[13]，表明RPA體系成分并不固定，可根據情況進行調整。RPA引物長度在30～35個堿基范圍內較為合適[14]，但是比較長的引物給設計帶來了一定難度，為避免形成二級結構或是導致非特異性擴增，應避免核苷酸長重復或多次小重復，引物GC含量在30%～70%之間[15]。RPA一般使用的探針有exo、fpg和nfo等。反應結合側流測定需要nfo探針，在5′端帶有FAM熒光團標記，內部帶有堿基類似物用于核酸內切酶IV(Nfo)的識別和切割，同時反向引物帶有5′端生物素標記，與探針形成雙標記擴增子[14]，在側流系統中金納米粒子與抗FAM抗體偶聯，雙標記擴增產物被特異性抗體捕獲[10]，檢測線的固定抗體捕獲生物素，也可以通過利用地高辛和生物素分別標記的引物，不使用nfo探針也能夠保留特異性[16]。實時RPA可使用exo或fpg探針。exo探針兩側帶有熒光團和淬滅劑，并由內部堿基類似物分離，探針與靶序列結合時，外切核酶進行切割將熒光團與其淬滅劑分離，攜帶淬滅劑的部分被釋放，另一帶有熒光團的片段可以通過聚合酶進行延伸，導致熒光與擴增成比例放大[17]，在5～10 min可產生檢測信號[10]。fpg探針的5′端攜帶淬滅劑，熒光團結合在淬滅劑下游的內部位置[17]，在探針結合靶基因時，DNA糖基化酶識別切割產生2個不可擴展的序列片段[14]，熒光團和淬滅基團分離導致熒光放大。

1.3 產物檢測

1.3.1 瓊脂糖凝膠電泳測定

與其他的擴增技術類似，RPA可通過瓊脂糖凝膠電泳進行產物檢測，電泳比較簡單且可以提供產物大小的信息，在實驗室研究階段經常使用。不足的是，電泳過程需要轉移樣品可能會導致氣溶膠污染，致使假陽性結果出現，并且反應過程需要在相應儀器中進行，應用于現場還存在限制。相關的設備如手持式凝膠電泳設備的開發，將電泳過程集中在一個手掌大小的工具中，同時與基于FIA卡的直接采樣工具相結合，可以滿足現場檢測需求[18]。

1.3.2 橋式絮凝測定

橋式絮凝測定一般用于DNA片段的純化過程，可作為核酸擴增產物檢測的手段。橋式絮凝測定依據羧基官能化的磁珠的可逆絮凝過程[19]。在磁場存在的情況下，磁珠與RPA擴增產物聚集纏繞形成絮狀物，阻止兩者在去除磁場之后重新分散開。在沒有擴增產物時，磁珠在去除磁場后重新分散存在于溶液中，不存在絮狀物。因而可以通過體系中反應絮凝狀態的存在情況，無需設備，依靠肉眼觀察對結果進行判讀。

1.3.3 濁度或比色測定

核酸擴增過程可以產生焦磷酸根離子，可與溶液中的鎂離子結合形成焦磷酸鎂沉淀，通過反應管的濁度變化進行結果的判讀，這一特性被應用于恒溫核酸擴增技術的結果報告中。常用的檢測染料有SYBR Green I[20]、Celfinder、鈣黃綠素、孔雀石綠等。辣根過氧化物酶(HRP)/H2O2與3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺(TMB)底物偶聯是廣泛使用的比色系統之一，可用于RPA擴增產物檢測，利用被生物素或是生物素標記的dNTPs修飾的引物擴增靶標基因，再加入鏈霉親和素-HRP，隨后加入TMB和H2O2產生顏色變化，可通過肉眼或紫外可見光度計進行結果判讀，還可以利用TMB的電化學性質進行電化學安培定量[21]。相關研究表明，基于該比色系統的RPA結合酶聯免疫吸附檢測技術在特異性、靈敏性、重現性等方面表現較好[22]。

1.3.4 通過pH值的定量測定

通過擴增體系pH值變化可為核酸檢測提供更簡便的終點檢測方法[23]，擴增過程的副產物產生及積累可以使反應混合物的pH值發生變化[24]，目前已有利用pH變化和RPA反應結合的檢測方案[25]。需要注意，RPA體系的緩沖液和其他成分有緩沖作用，以及擴增過程中多種分子機制可能影響pH變化，相關的檢測策略的應用需確定體系的緩沖能力，盡可能降低RPA試劑盒的緩沖能力[24]，同時避免緩沖能力改變對于相關酶以及DNA擴增過程的影響。

1.3.5 側向流動檢測

側流測定(LFA)因具有成本低、操作簡便的優勢而受到關注。LEA在核酸檢測上有兩種不同結合原理的選擇，涵括核酸側流檢測(LF)和核酸側流免疫檢測(LFIA)[26]。核酸與側向流動LF結合需對特異性引物進行修飾，在擴增過程產生特殊標記產物，產物中間有互補的雙鏈片段，兩側有單鏈的部分，單鏈尾部片段作為設計片段，與捕獲探針上的互補單鏈片段實現雜交，從而實現產物檢測。LFIA也需要進行特異性引物修飾設計，正向和反向引物通常用生物素和另一種具有高抗體親和力的抗原進行標記[27]，最后擴增產物帶有標記，并通過標記物的高親和力結合或抗原抗體免疫反應形成復合物，可以實現對靶標或靶標產物的檢測。相較于凝膠電泳與擴增熒光信號的檢測，側向流動檢測更具有現場應用的潛力，RPA技術所需要的擴增溫度在沒有任何加熱儀器的條件下也可以達成，同樣具有現場應用的高潛力，RPA結合側向流動檢測的側向流動試紙條(RPA-LFD)被提出并應用于不同的病原體檢測，可以實現現場即時檢測[28]，減少了檢測對于設備的需求。

1.3.6 實時檢測

RPA可結合熒光探針進行實時檢測[29-30]，實時熒光定量RPA中探針兩側分別標記熒光團和淬滅團，當探針與靶序列DNA 結合，相應酶識別切割位點，熒光團和淬滅團分開使熒光變強，產生與擴增DNA數量成正比的熒光信號，熒光信號強度可由熒光信號檢測器或掃描儀識讀，結果易于判斷。目前的實時監測以熒光應用為主，還可以用無標記的環形諧振器對固相重組酶聚合酶擴增進行實時監測，擴增片段與固定在環形諧振器表面上的互補捕獲探針雜交[31]，并通過諧振波長的變化進行檢測。

2 RPA的應用策略

2.1 常規RPA的應用

食源性病原體會導致嚴重的健康問題?？焖贆z測食源性病原體有重要意義，基于RPA的檢測方案已經被提出用于大腸桿菌O157∶H7[32]、金黃色葡萄球菌[33-34]、沙門氏菌[35]、單核細胞增生性李斯特菌[36]等食源性病原體的檢測(表1)。需要注意的是，存在少量病原體感染的食物等樣品可能在隨后保存過程出現病原菌迅速繁殖的情況，因此，食源性病原體的檢測靈敏度更受關注。在實際操作過程中可以通過菌體預富集[35]進一步提高檢測靈敏度。

表1 食源性病原體的RPA檢測Tab.1 RPA detection of foodborne pathogens

RPA也被用于其他病原體的檢測，如結核病分枝桿菌[20]、布魯氏菌[37]等。研究表明，RPA的檢測靈敏度不亞于傳統PCR及其他擴增技術，并在時間和溫度上具有優勢。RPA不需要在擴增反應前進行DNA純化過程，在對臨床樣本的檢測中表現良好。在COVID-19大流行期間，各種等溫擴增技術應用于SARS-CoV-2的診斷[38]。RPA在研究報告中被證明是SARS-CoV-2的診斷工具之一[39](表2)，檢測不需要提取病毒RNA，可以防止污染問題。RPA也被用于其他病毒的檢測，如HIV[40]、腺病毒[41]。已有研究提出通過非儀器化孵育結合RPA技術對HIV-1進行快速檢測，在環境溫度或者使用簡單的化學加熱器孵育[40]，檢測HIV-1與檢測儀器的結果相近。RPA還被應用于致病真菌如隱球菌[42]、產毒鐮刀菌[43]、黃曲霉[44]、大豆疫霉病菌[45]的感染檢測，還有應用于原生動物寄生蟲的檢測[46-47]，RPA顯示出了其在分子診斷方面的巨大潛力。

表2 SARS-CoV-2的RPA檢測Tab.2 RPA detection for SARS-CoV-2

2.2 逆轉錄RPA(RT-RPA)

RT-RPA的提出為RPA的進一步應用提供基礎，通過逆轉錄酶的作用，實現樣品中RNA到DNA的轉換過程，將逆轉錄反應與DNA擴增在一個步驟中完成。RT-RPA已經被應用于SARS-CoV-2[48，50-51]的檢測過程，對于一些高致病性的RNA病毒，RT-RPA提供了更多的現場檢測方法(表3)，如H7N9[52]、H9N2[53]、塞卡病毒[54]、登革熱病毒[55]等。

表3 病毒RPA診斷的相關研究Tab.3 Research on virus diagnosis using RPA technology

2.3 實時RPA

實時PCR廣泛應用于病原體診斷，實時RPA也能夠應用于病原體的檢測中。開發用于大腸桿菌O157：H7[57]、副溶血性弧菌[58]、土拉弗朗西斯菌[59]、單核細胞增多性李斯特菌[60]、虹彩病毒[61]、肺炎支原體[62]等病原體的RPA檢測，不同的檢測方案中體現了RPA技術在檢測時間和靈敏度上的優勢。搭配便捷式熒光檢測儀[57]或ESEQuant管掃描儀[59]等設備，在操作和時間上存在明顯的優勢。針對血細胞虹彩病毒的實時RPA檢測限為每個反應11個拷貝[61]，對其他病毒也有低至幾拷貝的檢出限[63]，谷物中黃曲霉的RPA檢測也被證實了不亞于實時熒光定量PCR方法的特異性[44]，不同的報告中展示了實時RPA在疾病監測上替代實時PCR的可能性。

2.4 多靶標RPA

開發多靶標檢測技術方案具有重要意義。多靶標檢測需要建立合適的終點檢測方案，有報告提出了不同類型的RPA多靶標檢測方法，包括針對病原體[64-66]、病毒[41]的檢測，以及針對SARS-CoV-2與其他呼吸道病毒的聯合檢測[67](表4)。一種基于紙芯片的裝置，通過在PES膜上劃分反應區來實現用于3種食源性致病菌多靶標檢測[64]，RPA反應在培養基中進行可以避免污染，紙封閉和膠帶封閉也可避免氣溶膠污染的產生，同時利用試紙閱讀器的終點定量分析[65]，提供了新的可視化方案。一種雙重檢測土拉弗朗西斯菌和鼠疫耶爾森菌RPA方法被成功提出[66]，該技術方案中在引物中加入特殊識別序列，能夠有效捕撈過量引物，最后采用橫向流動法對無過量引物的擴增產物進行檢測。SARS-CoV-2感染與其他呼吸道病毒感染癥狀具有相似性，利用RPA結合測序建立的同時監測SARS-CoV-2和多種呼吸道病毒合并感染的策略[67]，對于在疾病感染期間進行有效診斷起到了促進作用。針對多種原生動物的多重RPA測定方案也具有可行性[68]?？偟膩碚f，基于RPA檢測可以實現從單靶標到多靶標檢測，而且通過檢測設備等方面的不斷創新，利用重新設計引物和探針序列實現不同靶標的檢測。但多重檢測中還需考慮靶標負擔問題，需要針對檢測目的進行條件優化以提高反應的靈敏度。

表4 多靶標的RPA檢測Tab.4 Multi-target RPA detection

2.5 側流RPA

利用重組酶聚合酶擴增聯合側流系統的病原體檢測是一個重要趨勢，用于HIV檢測的紙和塑料裝置[69]可以儲存RPA反應所需凍干酶以及促進反應所需組分的混合，這是RPA側流檢測在設備上的突破之一。目前針對不同病原菌，包括假單胞菌[70-71]、大腸桿菌[57]、金黃色葡萄球菌[72]、副溶血性弧菌[73]、沙眼衣原體[74]、鯉科皰疹病毒2[75]、惡性瘧原蟲[76]等的RPA側流檢測都顯示了檢測特異性，有望被開發應用于現場檢疫站甚至是居家檢測。產毒素真菌大多數具有比較強的致癌或致畸能力，是病原體監測中的重要關注對象。側流RPA也被開發用于產毒鐮刀菌[43]、大豆疫霉病菌[45]、隱球菌病[42]的檢測，諸多報告表明了RPA具有重要的應用潛力。在側流測定中比較重要的材料就是金納米粒子，其在樣品檢測線和對照線顯色上起到關鍵作用，但金納米粒子存在局限，比如在靈敏度和分辨率上存在不足。為了避免該不足，一種納米銪粒子橫向流動免疫結合RPA同時檢測單核增生李斯特菌、副溶血性弧菌和大腸桿菌O157∶H7等致病菌的方法[77]被成功開發，該研究用熒光壽命長、熒光強度高的納米銪粒子代替膠體金作為標記材料，有效提高了結果分析的靈敏度與定量分辨率。

2.6 RPA-CRISPR/Cas系統

CRISPR是生物體基因組編輯的強大工具之一，結合不同類型Cas內切酶能準確識別核酸序列，但對低水平序列無法做到有效識別，若結合上游核酸擴增技術，再通過CRISPR/Cas對擴增產物或轉錄產物識別切割[78-79]，就能夠實現對低拷貝樣品的檢測，通過熒光團和淬滅劑分離實現肉眼或儀器的結果判讀。RPA的擴增溫度與Cas內切酶的工作溫度接近，在上游擴增技術中RPA無疑是一個良好選擇。RPA-CRISPR/Cas系統目前已被應用于多種病原體檢測(表5)，包括寄生蟲[80-81]、致病菌[82-83]、病毒[49，84]等。

表5 RPA-CRISPR/Cas系統的病原體檢測Tab.5 Pathogen detection of RPA-CRISPR/Cas systems

利用RT-RPA-CRISPR/Cas12a的SARS-CoV-2檢測方法已被開發[49]，用DNA修飾金納米微粒比色，靶向ORF1 ab和N區，在擴增時dsDNA結合激活Cas12a反式切割，被包裹的DNA底物被AuNPs水解表現為表面等離子體共振，通過紫外-可見光光譜和肉眼觀察，RPA-CRISPR/Cas12a協同檢測能有效避免出現其他冠狀病毒引起的假陽性。一種結合微推進反應器(Cas12a-MPR)[83]的檢測方案被成功建立，通過體系條件優化，可以實現在同一反應器中進行CRISPR/Cas12a切割和RPA擴增過程。從現有研究看，RPA-CRISPR/Cas系統應用快速、靈敏且具有良好的特異性，顯示出在病原體現場檢測的前景。

2.7 集成與微型化RPA檢測

大規模篩查能夠有效控制高傳染性疾病的傳播，而檢測過程的試劑消耗、檢測樣品量不足等問題有待解決?；赗PA的集成微型化設備如微芯片、微流控裝置提供了多樣化的檢測平臺，結合數字方法、生物傳感器在檢測中表現出不同優勢?；赗PA的手提箱式實驗室也被成功開發用于檢測SARS-CoV-2[50]，該檢測具有良好擴增性能，適用于資源有限的地區現場即時檢測。其他更加小巧便捷的設備也被開發用于SARS-CoV-2的檢測，Liu等[51]利用微流整合側流RPA設計了檢測設備，將RT-RPA與試紙檢測系統集成微流控芯片，在簡單的核酸提取之后反應30 min就可得到結果，檢出限可達1拷貝。Fu等[85]成功建立了一種基于鏈霉親和素包被的金納米顆粒結合RPA的側流條狀生物傳感器檢測方案，該檢測利用智能手機和筆記本電腦就可以完成實驗結果數據的收集以及定量分析，可用于腸道沙門氏菌的臨床定量檢測。一種稱為PADLOCK的方法利用微流體實現液滴數字RPA(ddRPA)進行核酸絕對定量[86]，微流體注射與液滴發生器耦合，通過MgOAc注射觸發反應過程避免過早擴增，實現精準的定量，結合CRISPR/Cas13a系統表現出單分子檢測能力，體現出核酸定量的巨大前景。Luo等[87]報告了一種利用水凝膠納米流控芯片的數字RPA系統，能夠對病原體進行絕對定量，應用于單核細胞增多性李斯特菌的檢測限可達單拷貝，且能夠避免體系預擴增導致的錯誤結果，并且提出了新的“隨機重疊理論”對核酸精準定量。該操作相對簡單，整個過程快速(<10 min)，具有高靈敏度、高特異性以及抗抑制能力。集成與微型化設備的研究發明是RPA技術應用于現場的關鍵，不同POC診斷工具應用于現場檢測模式是否具有可行性還需要證明，但RPA本身對于環境條件的低需求以及擴增上的優勢使其在現場應用上具有較大的潛力。

3 展望

基于核酸的病原體檢測技術在不斷發展，相較傳統的PCR技術及其他核酸等溫擴增技術，RPA不需要昂貴裝置，對溫度要求低，反應時間短，可以在資源有限的地區實現快速檢測的目的，但目前RPA技術在現場即時檢測的實際應用還比較少，未來還可能在以下方面有進一步突破：①結合RPA技術的特點，設計更為巧妙的裝置實現對于病原體的單重和多重檢測，使結果判定更簡便、直觀，例如類似于保溫杯的加熱裝置或者一些手提式設備等都可以為未來的相關研究提供思路；②最重要的是成本問題，任何需要被普遍利用的技術都需要考慮成本效應，目前的RPA技術大多直接利用商品化的試劑盒進行反應，在成本上是一個比較大的問題，因此，如果能夠在未來研發出更為低廉、高效的相應試劑和酶制劑，就能夠解決根本上的商業成本受限問題等，給病原體核酸檢測帶來新的可能。