氚水長期暴露對斑馬魚子代生長發育影響的研究

顧鵬 誠 羅發堅 薛惠元 陳娜 孫亮 萬駿 崔鳳梅 涂彧

蘇州大學蘇州醫學院放射醫學與防護學院，放射醫學與輻射防護國家重點實驗室，蘇州 215123

氚是氫的同位素之一，隨著核技術的應用與發展，核試驗、核反應堆、核燃料后處理、核事故的發生等會導致大量的氚排放到環境中[1-3]。氚的理化性質決定了其在環境中大多以氚水的形式存在，且可以經皮膚、傷口、呼吸道、消化道等多種途徑進入生物體內造成內照射損傷[4]。高劑量氚的相對生物效能（relative biological effectiveness, RBE）值為1[5]，但近年來的一些研究結果表明，低劑量氚（＜100 mGy）的RBE 值可能＞1，且RBE 值在一定范圍內隨氚水劑量的降低而升高[6-7]。低劑量氚水所致的生物效應不易觀察，需要通過構建合適的動物模型才可以檢測[8]。

斑馬魚是一種模式生物，其具有體型小、養成周期短、產卵量大、胚胎透明、成本低等優點[9]，是國際標準化組織（ISO）認可的5 種魚類實驗動物之一，被經濟合作與發展組織（OECD）推薦用于各種類型的生態毒理學試驗[10-11]。

本研究擬通過斑馬魚構建氚水長期暴露動物模型，并在此基礎上檢測斑馬魚子代發生的改變[12]，初步探討斑馬魚長期氚水暴露可能導致的子代生物效應。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用成年AB 品系野生型斑馬魚購自國家斑馬魚資源中心。本實驗經蘇州大學動物保護和使用委員會批準，符合《實驗動物護理和使用指南》的要求。

1.2 試劑與儀器

氚水購自美國PerkinElmer 公司；培養基（5 mmol/L NaCl，0.17 mmol/L KCl，0.33 mmol/L CaCl2，0.03 mmol/L MgSO4，0.01%亞甲基藍和1 L 去離子水）為本實驗室自行配制；PBS 購自美國AXYFEN 公司；總超氧化物歧化酶（total superoxide dismutase，T-SOD）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒、活性氧（reactive oxygen species，ROS）測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；三卡因（Tricaine）購自蘇州格瑞特醫藥技術有限公司；高氯酸購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；過氧化氫購自上海凌峰化學試劑有限公司。5 ml 可立凍存管購自蘇州科技有限公司；斑馬魚養殖系統購自青島金水海洋生物設備有限公司；低本底液閃計數器（Tri-Carb 2910TR 型）購自美國PerkinElmer 公司；MoticSMZ-168 型體式顯微鏡購自廈門麥克奧迪實業集團有限公司；十二孔細菌培養板購自上海賽默爾世飛科技（中國）有限公司；MF52-N 型熒光顯微鏡購自廣州明美光電技術有限公司；KZ-Ⅲ型研磨儀購自武漢賽維爾生物科技有限公司；DK-S22 型電熱恒溫水浴鍋購自上海精宏實驗設備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 氚水長期暴露斑馬魚模型的建立

將正常斑馬魚所產胚胎分別暴露于0、1×102、1×105Bq/L 的氚水中3 個月以上作為親代（記作F0代），待其性成熟后進行繁殖得到子代（記作F1代）并繼續飼養在對應濃度的氚水中。按照斑馬魚的發育階段，分別選取合適的指標對胚胎期、幼苗期、幼魚期、成魚期斑馬魚進行相關檢測。

1.3.2 F1 代斑馬魚孵化率的檢測

采用簡單隨機方法分別從0、1×102、1×105Bq/L的3 組氚水暴露F0 代斑馬魚成魚所產胚胎中選取50 枚胚胎，繼續暴露在與F0 代對應的0、1×102、1×105Bq/L 氚水中，第7 天時統計每組50 枚胚胎的孵化數并計算孵化率（孵化率=孵化的斑馬魚數量/50×100%），期間及時去除死卵。上述實驗至少重復3 次。

1.3.3 F1 代斑馬魚自主運動、心率、體長的檢測

在F1 代受精后24、36 h，采用簡單隨機方法分別從1.3.2 中的3 組F1 代斑馬魚胚胎中各選取10 枚胚胎，使用體式顯微鏡對斑馬魚胚胎1 min內的自主運動次數計數；受精后48、60 h，采用簡單隨機方法分別從上述3 組胚胎中各選取10 枚胚胎，使用體式顯微鏡對斑馬魚胚胎20 s 內的心臟跳動次數計數；受精后72、84 h，采用簡單隨機方法分別從上述3 組斑馬魚胚胎中各選取10 條斑馬魚幼苗，在體式顯微鏡下拍照，應用麥克奧迪圖像軟件（Motic Images Plus，廈門麥克奧迪實業集團有限公司）計算3 組斑馬魚幼苗的體長。上述實驗均至少重復3 次。

1.3.4 F1 代斑馬魚幼苗ROS 含量的檢測

將F0 代3 組斑馬魚所產胚胎繼續暴露于與F0代對應的0、1×102、1×105Bq/L 3 組不同濃度的氚水中，在斑馬魚胚胎受精4～5 h 時加入0.003% 苯基硫脲（PTU）溶液以抑制斑馬魚體內黑色素的生成。在斑馬魚幼苗魚齡達4 d 時，采用簡單隨機方法從0、1×102、1×105Bq/L 的3 個濃度氚水暴露組中各選取10 條斑馬魚魚苗進行實驗。每組斑馬魚魚苗分別加入12 孔板中，用PBS 清洗3 次，隨后加入1 ml 含10 μmol/L DCFH-DA（2, 7-二氯熒光素二乙酸酯）的PBS，于28.5℃、避光環境中孵育1 h。孵育結束后，用PBS 清洗3 次以去除多余的探針，在熒光顯微鏡下拍照記錄3 組斑馬魚體內的ROS 熒光強度。采用簡單隨機方法從3 組中分別選取4 條斑馬魚，采用Image J 軟件（美國NIH 公司）對其全身的熒光強度進行定量分析。

1.3.5 F1 代斑馬魚幼魚T-SOD、MDA 含量的檢測

采 用 簡 單 隨 機 方 法 選取F1 代0、1×102、1×105Bq/L 3 個濃度氚水暴露組斑馬魚幼魚中魚齡達45、60 d 的各3 條，準確稱量體重后按照體重（g）∶生理鹽水（ml）=1∶9 的比例在研磨儀上研磨制成10%的組織勻漿，再使用生理鹽水稀釋為5%的組織勻漿。吸取5%的組織勻漿30 μl，使用生理鹽水稀釋為1%的組織勻漿檢測T-SOD 的含量；吸取5%的組織勻漿100 μl，使用二喹啉甲酸（BCA）法對蛋白濃度進行定量分析；吸取5%的組織勻漿100 μl 檢測MDA 的含量。實驗步驟均嚴格按照對應試劑盒的說明書進行。

1.3.6 F1 代斑馬魚成魚產卵量的統計

采用簡單隨機方法分別選取0、1×102、1×105Bq/L 3 個濃度氚水暴露組中4 月齡以上性成熟的F1 代斑馬魚雌、雄魚各1 條，在交配前1 天晚上放入配魚缸，中間用隔板隔開。第二天上午9 點，自動光照系統（本實驗室自制）開啟后將隔板拿開，雌魚開始產卵2 h 后收集斑馬魚胚胎并計數。上述實驗至少重復3 次。

1.3.7 F1 代斑馬魚體內氚含量的檢測

采用簡單隨機方法分別選取0、1×102、1×105Bq/L 3 個濃度氚水暴露組中魚齡為45、60 d的斑馬魚幼魚各3 條，使用三卡因將其麻醉后用純凈水沖洗3 次，擦干幼魚體表水分后稱量體重，按照體重（g）∶生理鹽水（ml）=1∶9 的比例在研磨儀上研磨制成10%的組織勻漿。吸取10%的組織勻漿500 μl 于5 ml 可立凍存管中，加入500 μl 消解液（HClO4∶H2O2=2∶3），在70℃電熱恒溫水浴鍋中消解至少1 h，待消解完全后吸取全部液體于20 ml液閃瓶中，加入7 ml 純凈水混合均勻。對照組為8 ml 純凈水。在避光條件下，向液閃瓶中加入12 ml 閃爍液并充分振蕩，加蓋密封暗化12 h 以上至液體澄清后，使用低本底液閃計數器對斑馬魚體內的總氚含量進行檢測。檢測過程全程避光，檢測時間10 min，檢測設置內循環1 次，外循環3 次。

1.4 統計學方法

采用Graphpad Prism 9 軟件對數據進行統計學分析。符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組間的比較采用t檢驗（方差齊）。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 F1 代斑馬魚孵化率的比較

由圖1 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組斑馬魚的孵化率分別為（90.66±0.05）%、（85.63±0.10）%、（78.06±0.15）%。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚孵化率的差異均無統計學意義（t=0.785、1.370，P=0.462、0.220）。

圖1 不同濃度氚水長期暴露F1 代斑馬魚孵化率的比較Figure 1 Comparison of hatching rate of F1 generation zebrafish after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

2.2 F1 代斑馬魚自主運動、心率、體長的比較

由圖2 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組斑馬魚受精后24 h 的自主運動次數分別為（12.93±2.70）、（11.30±0.78）、（10.50±0.80） 次/min。與0 Bq/L氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚受精后24 h 自主運動次數的差異均無統計學意義（t=1.008、1.499，P=0.370、0.208）。3 組斑馬魚受精后36 h 的自主運動次數分別為（3.63±1.43）、（4.50±1.15）、（5.40±3.55） 次/min。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚受精后36 h 自主運動次數的差異均無統計學意義（t=0.817、0.799，P=0.460、0.469）。

圖2 不同濃度氚水長期暴露F1 代斑馬魚受精后不同時間自主運動次數、心率、體長的比較Figure 2 Comparison of autonomous movement, heart rate and body length of F1 generation zebrafish at different times after fertilization after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

3 組斑馬魚受精后48 h 的心率分別為（59.43±6.93）、（65.00±3.30）、（61.23±4.55） 次/20 s。與0 Bq/L氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚受精后48 h 心率的差異均無統計學意義（t=1.256、0.376，P=0.278、P=0.726）。3 組斑馬魚受精后60 h 的心率分別為（69.87±2.71）、（66.17±6.97）、（69.77±9.08） 次/20 s。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚受精后60 h 心率的差異均無統計學意義（t=0.857、0.018，P=0.440、0.986）。

3 組斑馬魚受精后72 h 的體長分別為（3.20±0.22）、（3.32±0.08）、（3.29±0.06） mm。與0 Bq/L氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚受精后72 h 體長的差異均無統計學意義（t=0.614、0.178，P=0.525、0.868）。3 組斑馬魚受精后84 h 的體長分別為（3.42±0.07）、（3.46±0.11）、（3.40±0.04） mm。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚受精后84 h 體長的差異均無統計學意義（t=0.527、0.496，P=0.626、0.646）。

2.3 F1 代斑馬魚幼苗體內ROS 熒光強度的比較

由圖3 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組斑馬魚的ROS 熒光強度分別為（21.07±4.74）、（23.71±7.73）、（23.19±5.32）。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚幼苗ROS 熒光強度的差異均無統計學意義（t=0.582、0.593，P=0.582、0.575）。

圖3 不同濃度氚水長期暴露F1 代斑馬魚幼苗活性氧熒光強度的比較Figure 3 Comparison of reactive oxygen species fluorescence intensity of F1 generation zebrafish seedlings after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

2.4 F1 代斑馬魚幼魚體內T-SOD、MDA 含量的比較

由圖4 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組斑馬魚45 d 的T-SOD 含量分別為（41.84±4.91）、（42.30±5.04）、（36.97±5.26） U/mgprot。與0 Bq/L氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚45 d T-SOD 含量的差異均無統計學意義（t=0.112、1.171，P=0.916、0.307）。3 組斑馬魚60 d 的T-SOD 含量分別為（36.93±1.91）、（34.07±3.02）、（33.54±1.87） U/mgprot。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚60 d T-SOD 含量的差異均無統計學意義（t=1.397、2.195，P=0.240、0.093）。

圖4 不同濃度氚水長期暴露F1 代不同魚齡斑馬魚幼魚體內T-SOD、MDA 含量的比較 a 表示與0 Bq/L 氚水暴露組比較，差異有統計學意義（t=2.831，P=0.047）。T-SOD 為總超氧化物歧化酶；MDA 為丙二醛Figure 4 Comparison of total superoxide dismutase and malondialdehyde content in F1 generation zebrafish of different age after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

3 組斑馬魚45 d 的MDA 含量分別為（3.60±1.56）、（3.59±0.44）、（2.95±0.58） nmol/mgprot。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚45 d MDA 含量的差異均無統計學意義（t=0.007、0.677，P=0.995、0.536）。3 組斑馬魚60 d 的MDA 含量分別為（4.00±0.52）、（4.19±1.37）、（3.01±0.32） nmol/mgprot。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚60 d MDA 含量的差異無統計學意義（t=0.229，P=0.830），1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚MDA含量的差異有統計學意義（t=2.831，P=0.047）。

2.5 F1 代斑馬魚產卵量的比較

由圖5 可知，0、1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組斑馬魚產卵量分別為（188±88）、（204±22）、（220±40）枚。與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L氚水暴露組F1 代斑馬魚產卵量的差異均無統計學意義（t=0.400、0.757，P=0.700、0.477）。

圖5 不同濃度氚水長期暴露F1 代斑馬魚成魚產卵量的比較Figure 5 Comparison of eggs laid by adult F1 generation zebrafish after long-term exposure to different concentrations of tritiated water

2.6 F1 代斑馬魚體內總氚含量的比較

1×105Bq/L 氚水長期暴露條件下，F1 代斑馬魚的魚齡達60 d 時，測得其體內總氚含量為（32.23±1.97） Bq/g。

3 討論

在研究低劑量氚水長期暴露所致生物效應時需要選取合適的暴露濃度與實驗動物模型。目前對于氚水濃度高低劃分的標準尚未統一，且不同國家之間差異顯著。以飲用水中氚含量的限值為例，歐盟大部分國家的標準為1×102Bq/L，加拿大為7×103Bq/L，俄羅斯為7.7×103Bq/L，芬蘭為3×104Bq/L，澳大利亞為＞7.6×103Bq/L[13]。同時，核電站排放的氚水濃度通常為1×106Bq/L[14]。對于在內陸建造的核電站，我國要求其排放口下游1 km 處受納水體中氚濃度不超過1×102Bq/L[15]。因此，本文綜合環境因素選取低劑量氚水暴露濃度為1×102和1×105Bq/L。

由于低劑量氚水的生物效應不易被觀察到，一些研究者通過構建更為敏感的動物模型，如轉入Rev1 基因的C57BL/6N 小鼠、轉染人源X 染色體的Hprt 基因缺失的倉鼠細胞等對低劑量氚水的生物效應進行研究[16-17]。然而這些模型目前并不適用于低劑量氚水長期暴露的生物效應研究。斑馬魚作為一種理想的實驗動物模型被廣泛應用于氚水的毒性效應研究中，且由于其體型小、養成周期短、產卵量大、胚胎透明、成本低等優勢十分適合用于氚水長期暴露的生物效應研究[18-19]。Li 等[20]研究發現，氚水對斑馬魚胚胎的行為、生理和基因的表達產生綜合影響。Arcanjo 等[21-22]研究發現，氚水暴露后斑馬魚幼苗參與肌肉收縮、眼晶體透明度、DNA 損傷修復的基因出現錯誤表達。雖然上述研究中的氚水濃度均高于本實驗設置的濃度，但是考慮斑馬魚作為模型動物的優勢，可以對其在低濃度氚水暴露方面的研究進行探索。

本研究中，在低劑量氚水長期暴露的條件下，與0 Bq/L 氚水暴露組相比，1×102、1×105Bq/L 氚水暴露組F1 代斑馬魚的孵化率、自主運動、心率、體長、產卵量等指標的差異均無統計學意義，說明斑馬魚在1×102、1×105Bq/L 濃度的氚水中僅暴露到F1 代并未對其基本生長發育造成影響。目前，氚水長期暴露的生物效應的相關研究較少，一些發現氚水暴露對斑馬魚生長發育指標產生影響的研究中所設置的氚水濃度較高且均為急性暴露[20,23]，因此本實驗結果仍需做進一步研究。

氧化應激相關指標（ROS、SOD、MDA 等）在氚水的毒性效應評價中得到了廣泛應用，但不同濃度氚水暴露的生物效應仍不明確[12]。Huang 等[24]對在3.7×106Bq/L 氚水中暴露96 h 的小球藻和萊茵衣藻的氧化應激相關指標進行檢測，結果表明，小球藻的ROS 熒光強度增加、SOD 含量降低，MDA含量無明顯變化；萊茵衣藻的ROS 熒光強度、SOD含量、MDA 含量均無明顯變化，與之前的研究結果[25]不一致，他們認為可能是由于氚水的暴露濃度與時間不一致所致。Gagnaire 等[26]對在1×108Bq/L氚水中暴露的斑馬魚進行了ROS 檢測，結果表明，魚齡為4 d 的斑馬魚的ROS 熒光強度增加，但是魚齡為7 d 和10 d 的斑馬魚的ROS 熒光強度無明顯變化。本研究中，與0 Bq/L 氚水暴露組比較，1×102Bq/L 氚水暴露組斑馬魚的ROS 熒光強度、T-SOD 含量、MDA 含量的差異均無統計學意義；1×105Bq/L 氚水暴露組60 d 的 F1 代斑馬魚的MDA含量降低。因此仍需就相關指標做進一步研究。

1×105Bq/L 氚水暴露組60 d 的F1 代斑馬魚體內的總氚含量為（32.23±1.97） Bq/g。其他濃度氚水和暴露時間的樣品未檢測到明顯的氚含量積累，其原因可能為樣本中的氚含量過低或低本底液閃計數器的檢測性能不足所致。斑馬魚體內氚含量的明顯積累提示氚水長期暴露可能會對斑馬魚產生一定影響，較多研究結果均表明相同氚含量下有機結合氚比游離氚產生的生物效應更加顯著[23,27-29]。后續需要對氚水的暴露時間、暴露濃度、測量指標等做進一步優化，以更好地觀察氚水長期暴露的毒性。

本研究依據核電站實際排放核廢水的標準及環境水體中氚濃度的變化設置了氚水濃度，并以斑馬魚為實驗模型對該濃度氚水長期暴露所致F1 代斑馬魚的生物效應做了初步探討。未來應對氚水長期暴露斑馬魚子代作進一步研究，觀察F1 代后續子代的各項指標以進一步明確低劑量氚水長期暴露的生物效應，為環境評價和生物健康提供完善的參考數據。

利益沖突 所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明 顧鵬誠負責現場實驗的實施、論文的撰寫；羅發堅、薛惠元負責實驗模型的建立、數據的收集與分析；陳娜、孫亮、萬駿負責實驗思路的提出與實驗設計的指導；崔鳳梅、涂彧負責論文的審閱與修改