靶向突變p53蛋白的抗腫瘤藥物*

王若亞 張鴛 張繼虹 俞飛

（昆明理工大學醫學院，昆明 650500）

p53蛋白是由TP53基因編碼的53 ku蛋白，與p63蛋白和p73蛋白同屬于p53樣轉錄因子家族，其活性對于預防腫瘤的發生和發展至關重要［1］。自1979年p53蛋白首次以癌蛋白抗原被報道以來，經過40多年的研究，人們不僅重新發現了p53蛋白的抑癌功能，而且認識到TP53基因是迄今為止發現與人類腫瘤相關度最高的基因。p53蛋白在生物體內可以暫停細胞周期進程，啟動分子應答機制對損傷的DNA進行修復，并參與細胞分化、細胞凋亡等多種途徑［2-3］。同時，野生型p53蛋白調控著生物三大物質的代謝［4］，通過限制細胞核酸物質的合成與對葡萄糖的攝取等作用抑制細胞生長?？傊?，p53蛋白可以看作是細胞內一個復雜而龐大的信號轉導與調控網絡的中心樞紐，在使細胞能夠各司其職發揮正常功能方面起著重要的作用。在無應激的哺乳動物細胞中，p53蛋白通過不斷的泛素化和26S蛋白酶體系的降解維持在較低水平，在應激狀態下，p53蛋白可經過一系列如磷酸化、乙?；?、甲基化等蛋白質加工過程后被激活［5-6］。

正因為p53蛋白有著難以取代的重要作用，因此它一旦發生突變對細胞正常功能的影響是巨大的。突變后的p53蛋白不僅會喪失原本抑癌功能，同時還會進一步促進腫瘤的發生發展［7-8］。研究表明，約50%的人類癌癥中發現了突變p53蛋白，其主要突變類型為錯義突變?？茖W家們嘗試了多種靶向突變p53蛋白治療癌癥的策略，目前以恢復突變p53蛋白野生型構象及MDM2與p53蛋白相互作用抑制劑為代表的藥物研究取得了較大突破。

1 p53蛋白的結構與功能

1.1 p53蛋白的結構

p53蛋白在人體內以四聚體的形式發揮作用，單體間通過反向α螺旋和反向β折疊相互作用形成二聚體，二聚體借助平行的螺旋-螺旋接觸面形成四聚體，其結構類似一個十字架。每個單體由393個氨基酸殘基組成，從N端到C端依次可分為反式激活結構域（TAD）（1~61）、富脯氨酸結構域（PXXP）（62~94）、DNA結合域（DBD）（95~292）、低聚結構域（OD）（326~356）、羧基端結構域（CRD）（357~393）［9］（圖1）。TAD區包含TAD1（1~40）和TAD2（41~61），介導p53蛋白的轉錄活性。TAD1和TAD2不僅可以共同調節一些常見基因的轉錄，也可以相互獨立介導不同基因的反式激活［10］。此外，p53蛋白N端還包含泛素連接酶MDM2的結合位點，MDM2可以與p53蛋白相結合并對其進行泛素化標記，進而使p53蛋白被蛋白酶體降解。富含脯氨酸的結構域（62~94）以PXXP序列重復多次（P，脯氨酸；X可以是任何氨基酸），該區域與p53蛋白介導的細胞凋亡和生長抑制有關。DBD可以與DNA進行序列特異性結合（95~292），它包含1個中央樣免疫球蛋白β夾層支架、環狀片螺旋結構和2個大環狀結構，該區域在整個進化過程中高度保守，大約80%的TP53基因突變都發生在該區域。DBD后面是連接區域（293~325）以及OD（326~356），其中OD是p53蛋白四聚體化從而發揮功能所必需的，此外OD還包含一個核輸出信號序列。CRD（357~393）是高度非結構化的，涉及多個不同的作用，如DNA結合、賦予蛋白質穩定性、輔助因子招募等［9］。

Fig. 1 Schematic diagram of p53 protein structure圖1 p53蛋白結構示意圖

1.2 p53蛋白的功能

p53蛋白是人體內十分重要的抑癌轉錄因子。正常情況下，細胞中的p53蛋白維持在一個較低的水平，這主要是由體內E3泛素連接酶MDM2介導完成的。p53蛋白與MDM2形成的反饋調節通路［11］，導致細胞內p53蛋白的半衰期為6~20 min。各種各樣的細胞應激如DNA損傷、端粒侵蝕、代謝改變、缺氧、有絲分裂紡錘體功能異常以及幾種不同的致癌基因如Ras、Myc和Ets的突變激活等均可以引起機體針對MDM2和p53蛋白的修飾，這些修飾抑制了MDM2的活性，導致p53蛋白水平升高并激活，啟動了一系列不同的轉錄程序［12］。每一種應激壓力都由一組不同的蛋白質檢測，這些蛋白質向MDM2和/或p53蛋白發出信號并對其進行修飾。根據修飾（磷酸化、乙?；?、甲基化等）和細胞類型（如分化狀態、細胞是否轉化或正常、細胞是否正在分裂或休眠），啟動一個p53蛋白介導的信號通路（圖2）。

Fig. 2 Function of p53 protein圖2 p53蛋白的功能

激活狀態下的p53蛋白通過與DNA序列（稱為p53反應元件或p53結合位點）特異性結合誘導下游靶基因p21、PUMA、NOXA的表達，促進細胞凋亡、衰老、細胞周期阻滯、代謝改變、血管生成等多種作用，此外p53蛋白并非所有功能都是通過充當轉錄因子來實現的，比如細胞質中（尤其是定位于線粒體）的p53蛋白也參與調節糖酵解、氧化磷酸化、活性氧和自噬等［13］。除了直接調節腫瘤細胞代謝外，p53蛋白還可以通過影響腫瘤微環境抑制腫瘤的發生，其中很重要的一點是調節微環境中的免疫細胞，目前大量證據表明，p53蛋白可以影響免疫系統功能，通過調節腫瘤相關免疫細胞的代謝活動進而影響腫瘤發展［14］。

2 p53蛋白主要突變類型與特征

自從在人類結腸癌中首次發現TP53突變基因以來，大量DNA測序項目已經檢測了所有人類癌癥中TP53基因的突變頻率?？偟膩碚f，TP53基因突變的頻率通常取決于癌癥的類型［15-16］，睪丸畸形癌中突變最少（1%~3%），漿液性卵巢癌中突變最多（100%）。組織和細胞類型都影響TP53基因突變的頻率，多種突變類型導致p53蛋白原本功能的喪失。在整個TP53基因突變類型中，缺失、插入、移碼和無義突變的發生率為10%，大多數情況下導致蛋白質不能產生或迅速被降解。其余90%的突變類型為錯義突變［17］，在這些突變中，90%定位于DBD，其中175、245、248、249、273和282氨基酸位點是其熱點突變［18］，p53R175H與p53R273H分別為p53蛋白錯義突變的第一和第三大類型，其β片層結構都被很好地保存了下來，疏水表面變大，環的靈活性變高，從而易于在細胞內積聚［19］。其次作為p53蛋白第二大錯義突變類型的p53R248Q，熱穩定性較低，可通過與STAT3結合并使其磷酸化，從而持續激活STAT3信號通路促進癌細胞的遷移［20］。事實上與野生型p53蛋白相比，大多數突變p53蛋白除喪失與DNA結合及調控轉錄的能力最終導致抑癌功能喪失外，還會獲得新的致癌活性以促進癌癥的進展，稱為功能獲得性效應（gain of function，GOF），突變p53蛋白的GOF活性在1993年首次得到證實，當時Dittmer等［21］報道了p53R175H和p53R273H的異位表達賦予了p53蛋白缺失細胞在軟瓊脂中形成集落和在裸鼠中形成異種移植瘤的能力，此后，包括使用細胞培養系統和小鼠模型以及臨床研究在內的大量證據表明，許多p53蛋白錯義突變均具有GOF活性以促進癌癥的發生。到目前為止，已經報道了多種突變p53蛋白GOF活性，包括促進細胞增殖、轉移、基因組不穩定性、代謝重編程、腫瘤微環境重塑、免疫抑制和癌癥治療抵抗［5，22］。

3 靶向突變p53蛋白治療腫瘤的策略

尋找靶向突變p53蛋白的藥物一直是治療癌癥的研究熱點。然而，野生型p53蛋白和大多數突變p53蛋白缺乏結合口袋或變構位點，阻礙了常規的藥物設計，因此經常被認為是“不可成藥的”靶點。更重要的是，在人類腫瘤中已經發現2 000多種p53蛋白的突變形式，它們的結構、穩定性和生物學功能各不相同，幾乎不可能用單一藥物靶向所有p53蛋白的突變形式，對于每一種p53蛋白突變體，可能需要專門的藥物治療［23-24］。

本文主要梳理了兩種靶向突變p53蛋白以治療癌癥的策略：a. 恢復突變p53蛋白野生型構象；b. 降解突變p53蛋白（圖3）。并簡要介紹了3種間接靶向突變p53蛋白治療癌癥的策略。盡管幾十年來科學家們提出了各種各樣針對突變p53蛋白治療癌癥的方式，但截至目前仍沒有開發出一款療效較為理想的藥物，也正因如此，科學家們對p53蛋白的研究熱情持續未減，未來無論哪種治療策略及藥物，若可以有效靶向突變p53蛋白治療癌癥，都將對人類醫學產生劃時代意義。

Fig. 3 Strategies for cancer therapy targeting degradation or restoration of wild-type conformation of mutated p53 protein圖3 恢復或降解突變p53蛋白治療癌癥的策略

3.1 恢復突變p53蛋白野生型構象

p53蛋白屬于熱敏蛋白，突變后具有折疊與去折疊兩種狀態轉換的能力，因此是否可以利用一些小分子化合物逆轉突變構象，使突變p53蛋白重新恢復其野生型構象或功能呢？通過計算機對數千種化合物進行高通量篩選，發現極少數化合物似乎有這一能力，通過恢復突變p53蛋白的特定野生型功能，如誘導凋亡、促進細胞周期阻滯和抑制癌細胞增殖，證實了這種“突變體再激活”。

3.1.1 COTⅠ-2

COTⅠ-2是通過計算機高通量篩選發現的一種具有口服活性的第三代胺苯硫脲化合物［25］（圖4）。已被證明能與突變p53蛋白結合，恢復突變p53蛋白野生型活性，并使野生型p53蛋白靶基因表達正?；?6-28］。除此之外，COTⅠ-2似乎也能獨立于p53蛋白發揮作用，該化合物可激活AMPK、抑制mTOR通路、誘導腫瘤細胞DNA損傷引起復制應激。COTⅠ-2的這些不依賴p53蛋白發揮的效應可能進一步促進其抗癌作用，因為研究發現，誘導DNA損傷和復制應激會引起細胞凋亡，而抑制mTOR信號傳導是一種成熟的治療癌癥的策略。

Fig. 4 Schematic diagram of reactivator structure of mutated p53 protein圖4 突變p53蛋白重激活劑結構示意圖

與上述活性一致，Synnott等［26］發現COTⅠ-2可抑制多種惡性腫瘤細胞系和動物模型中腫瘤的生長，并且在研究的動物模型中具有良好的耐受性，沒有發病或體重減輕的不良現象出現［26-27］。Salim等［25］發現，COTⅠ-2可作為單一藥物通過兩種途徑對多種頭頸部癌細胞發揮明顯的抗腫瘤作用，一方面COTⅠ-2顯著增強了對順鉑和/或輻射出現耐藥性的頭頸部癌腫瘤細胞對這些治療的敏感性，另一方面COTⅠ-2可在TP53基因缺失或突變的頭頸部癌細胞中誘導凋亡，而在含野生型p53蛋白的頭頸部癌細胞中，COTⅠ-2誘導衰老而非凋亡，這可能是由于COTⅠ-2可增強含野生型p53蛋白的細胞中p21表達，而p21是這些細胞中已知的衰老誘導物［29］。除此之外，Maleki等［30］還發現，在乳腺癌細胞系中表達突變p53蛋白的細胞系比含有野生型p53蛋白的細胞對COTⅠ-2更敏感。目前，COTⅠ-2正在進行一項針對復發性婦科癌癥治療的臨床Ⅰ期試驗，初步藥代動力學評價顯示，口服該化合物的藥峰時間（Tmax）在15~90 min之間，半衰期為8~10 h，并且其耐受性良好，最常見的不良反應為惡心、嘔吐、疲勞和腹痛。在接受治療的24名患者中，只有2名（8%）需要減少劑量。然而，到目前為止在參與試驗的婦科癌癥患者中，還沒有腫瘤消退的證據［31］。

總之，COTⅠ-2在多種含突變p53蛋白的腫瘤細胞中具有非常有效的治療效果，即使這些腫瘤細胞對順鉑和輻射具有固有的耐藥性，此外，該藥物似乎以一種新穎的方式發揮其作用，包括重新激活野生型p53蛋白靶基因，誘導腫瘤細胞凋亡等。事實上，COTⅠ-2在含野生型TP53基因的腫瘤細胞中同樣誘導許多凋亡基因上調，但細胞凋亡并不明顯，很可能是因為這些促凋亡基因并沒有在蛋白質水平上被COTⅠ-2誘導［26］。

3.1.2 2-磺酰嘧啶

p53Y220C突變是p53蛋白第9大突變類型，位于p53蛋白S3/S4環和S7/S8 環之間的220位酪氨酸突變成為半胱氨酸。p53Y220C突變不僅直接破壞突變氨基酸與周圍氨基酸Leu145和Thr155之間的氫鍵，而且降低了p53Y220Ccluster區域的折疊片S3和S8之間的氫鍵數量，使p53Y220C突變所形成的親水性空腔變大，加速了水分子進入該蛋白質內部，大大降低p53蛋白的熱穩定性［32］。為了能夠找到具有較好靶向這種特殊突變活性的小分子化合物，Bauer等［33］通過差示掃描熒光法（DSF）篩選了一個旨在結合p53Y220C突變誘導產生的空腔配體文庫，發現了一個2-磺酰嘧啶小分子PK11000（5-氯-2-甲磺酰吡啶-4-羧酸）（圖4），它可將突變p53Y220C蛋白融化溫度明顯提高（ΔTm>1.2K）［34］，并且根據光散射法測定蛋白質聚合動力學懷疑PK11000與突變p53蛋白屬于共價結合。然而后期發現PK11000還可以使細胞內其他突變類型的p53蛋白融化溫度升高，證實其穩定突變p53蛋白活性不是通過與p53Y220C突變腔結合而實現的。

Synnott等［35］發現，2-磺酰嘧啶在生物環境條件下僅與高度親核的半胱氨酸發生SNAr反應，因此是選擇性化學修飾蛋白質的有用工具。通過HSQC NMR數據及ESⅠ質譜，證實了PK11000對p53Cys182和p53Cys277的特異性烷基化作用，PK11000對Cys182和Cys277的特異性修飾可在不損害p53蛋白與DNA親和力的情況下提高蛋白質穩定性。

PK11007為PK11000的類似物，是溫和的硫醇烷基化劑（圖4），相對于PK11000具有更好的抗癌活性，這可能與其膜透性改善（疏水性更強）、巰基反應活性提高（吸電子取代基更強）和烷基化選擇性增加（4-氟苯取代導致親核芳香族取代的空間位阻）等有關，此外PK11007還可通過兩條途徑發揮抗癌作用，即p53蛋白依賴和p53蛋白非依賴途徑［33］。PK11007可選擇性結合暴露于突變p53蛋白表面的兩個半胱氨酸即Cys182和Cys277從而穩定突變p53蛋白，并不損害其DNA結合活性。在一些癌細胞系中，不穩定的突變p53蛋白被PK11007重新激活，導致p53蛋白靶基因如p21和PUMA的上調從而引起細胞凋亡。然而更普遍的是，PK11007可獨立于p53蛋白通過消耗細胞內的谷胱甘肽，誘導細胞內活性氧水平的高度升高及內質網（ER）應激造成細胞凋亡［36］，PK11007和其他2-磺基嘧啶化合物作為抗癌藥物的先導具有很大的潛力。

3.1.3 異硫氰酸苯乙酯（PEⅠTC）

PEⅠTC大量存在于豆瓣菜和十字花科蔬菜中［37］（圖4），對多種腫瘤細胞表現出生長抑制活性，尤其對表達突變p53R175蛋白的腫瘤細胞具有優先抑制活性［38］。p53R175H突變是人類癌癥中最常見的p53蛋白錯義突變，估計為5.6%的發生率。事實上，PEⅠTC已經在臨床Ⅰ期和ⅠⅠ期試驗中進行了研究，作用機制包括恢復突變p53蛋白野生型構象、抑制腫瘤細胞遷移、誘導ⅠⅠ期解毒酶、細胞周期阻滯［24-25］和誘導氧化應激促進凋亡［39］等。

此外，PEⅠTC處理還會使突變p53R175蛋白對MDM2依賴的蛋白酶體降解敏感。Lam-Ubol等［40］將蛋白酶體抑制劑MG132或特異性MDM2抑制劑Nutlin-3與PEⅠTC分別或共同處理SK-BR-3細胞。發現與單獨PEⅠTC處理相比，MG132或Nutlin-3均可以使SK-BR-3細胞全裂解液（WCL）中突變p53蛋白顯著積累。這一結果表明，突變p53R175蛋白穩定性降低是由于MDM2依賴的蛋白酶體的降解。這可能是由于PEⅠTC將突變p53R175蛋白恢復為野生型構象，而野生型p53蛋白在細胞內受MDM2的調控［41］。

Choudhury等［42］用PEⅠTC處理SK-BR-3細胞時，發現高濃度（≥8 μmol/L）的PEⅠTC會引起突變p53R175蛋白發生聚集。由于蛋白質聚集物會引發自噬清除，Bommareddy等［43］便研究了突變p53R175蛋白的降解是否經歷自噬。他們將8 μmol/L PEⅠTC和氯喹（CHQ）共同處理SK-BR-3細胞，在細胞裂解液中發現突變p53R175蛋白水平較單獨PEⅠTC處理時明顯升高，而用4 μmol/L PEⅠTC做相同處理時突變p53R175蛋白水平并無明顯差異，這表明了高濃度PEⅠTC可能誘導突變p53R175蛋白發生聚集并自噬。PEⅠTC誘導的自噬，突變p53R175蛋白的再活化及其隨后對降解途徑的敏感性均有助于其依賴突變p53蛋白發揮抗癌活性。

近年來科學家們的研究方向主要集中于從化學文庫中尋找能重新激活突變p53蛋白的小分子化合物。然而，以膳食為基礎預防或治療突變p53蛋白的研究仍然很少。PEⅠTC的發現提供了第一個突變p53蛋白被飲食中化合物激活的例子［44］，對癌癥預防和治療具有重要意義。

3.1.4 三氧化二砷（ATO）

p53蛋白突變類型高達數千種，多為錯義突變［15］，由于在其DBD缺乏廣泛適用的變構調控位點，這就使得針對突變p53蛋白的治療顯得尤為棘手。盡管Zinc（NSC319726）靶向鋅配合位點已經顯示了具有拯救突變p53蛋白的活性，但其對突變p53R175蛋白具有高度特異性并影響p53蛋白DNA結合活性［45］。還有一個值得注意的結合位點，涉及到一個遠離DNA結合表面的裂縫，目前已經開發出多種可插入這個縫隙的小分子如PK083、PK15796等，從而穩定突變p53蛋白。然而遺憾的是，這種結合裂隙是p53Y220C突變所特有的，并不適用于其他p53蛋白突變體。因此還需不斷尋找靶向突變p53蛋白新的變構位點化合物。

ATO是一種治療急性早幼粒細胞白血病的藥物，可通過與半胱氨酸反應拯救結構突變型p53蛋白。砷結合突變p53蛋白的晶體結構揭示了一個隱藏的變構位點，該位點位于遠離突變p53蛋白DBD區的ABP口袋，涉及三個砷配位半胱氨酸。砷結合并穩定了突變p53蛋白DBD區的環-片-螺旋基序和整個β夾層結構，賦予結構突變型p53蛋白熱穩定性和轉錄活性［46］，值得注意的是，砷與ABP口袋中的半胱氨酸三聯體的特異性結合不同于其他作用于突變p53蛋白半胱氨酸的小分子化合物，如APR-246，后者雜亂地結合暴露于蛋白質表面的半胱氨酸［47］。但砷結合的半胱氨酸三聯體同樣可能存在于其他蛋白質中，從而使ATO產生獨立于突變p53蛋白的抗癌活性或細胞毒性［48］。在細胞和小鼠異種移植模型中，ATO重新激活了突變p53蛋白野生型活性并抑制腫瘤的發生。在對ATO介導拯救的25個人類癌癥中最常見突變p53蛋白實驗中發現，所有的結構突變型p53蛋白都可以被拯救，盡管程度不同。有趣的是，接觸突變型p53蛋白p53S241F、p53R248W也顯示出被拯救的跡象，這說明某些接觸突變型p53蛋白活性喪失也是由于構象改變引起的。盡管ATO對結構突變型p53蛋白具有普遍的拯救作用，但它們的野生型活性并不總是被有效地恢復，因為除了整體折疊外，局部p53蛋白DNA結合表面的完整性也決定了ATO拯救轉錄活性的效率［49］。

ATO聯合維甲酸治療APL為癌癥治療提供了新思路［50］。令人鼓舞的是，ATO的治療潛力在血液［51］和一些實體腫瘤［52］的臨床實驗中已有報道。目前一項針對含有突變p53蛋白的血液系統惡性腫瘤的Ⅰ期臨床試驗正在進行。

3.2 降解突變p53蛋白

TP53基因的錯義突變產生異常蛋白質，其抑癌功能被取消的同時也可獲得促進腫瘤細胞侵襲、轉移和化療耐藥的能力（GOF）［53］，最近的研究結果表明，突變p53蛋白的敲除降低了攜帶突變p53蛋白的腫瘤細胞的致癌特性。因此，確定突變p53蛋白穩定/降解的特異機制以及識別不改變野生型p53蛋白水平而使突變p53蛋白降解的化合物是至關重要的。靶向降解突變p53蛋白可能是開發新型抗癌藥物的一種有前景的方法。

3.2.1 藤黃酸（GA）

GA是從甘草干乳膠中分離出來的一種黃酮（圖5），在體內外均表現出強大的生物活性，如激活凋亡途徑、誘導細胞周期阻滯、抑制端粒酶和拓撲異構酶ⅠⅠ活性以及抑制血管生成等［54-55］。迄今為止的所有研究都表明，GA是一種有效的抗癌劑，通過不同的機制具有不同的分子靶點。作為抗腫瘤候選藥物，GA目前正在進行中國食品和藥物管理局批準的ⅠⅠ期臨床試驗。

Fig. 5 Schematic diagram of small molecular compounds degrading mutated p53 protein圖5 降解突變p53蛋白的小分子化合物結構示意圖

GA可以抑制含有野生型p53蛋白的腫瘤細胞生長，這是由于其可以抑制MDM2表達，增加腫瘤細胞內野生型p53蛋白水平，從而發揮抑癌作用［56］。然而，半數以上的人類癌癥中發現了突變型p53蛋白，有趣的是，GA對MDM2的影響在含有突變型p53蛋白的細胞中是不同的，Qin等［56］發現在GA處理后的MDA-MB-435細胞中，MDM2蛋白水平和p53-MDM2相互作用均未受到顯著影響，盡管已有報道MDM2可促進突變型和野生型p53蛋白的降解，但越來越多的研究表明，作為E3泛素連接酶的MDM2在突變型p53蛋白的降解中并不那么重要。而另一種突變p53蛋白降解途徑，涉及分子伴侶Hsc70和Hsp90以及泛素/蛋白酶體系統的密切合作，這種降解途徑的重要點在于伴侶相關泛素連接酶CHⅠP，CHⅠP通過與Hsc70和Hsp90的羧基端結合，與E2酶一起介導分子伴侶結合目標蛋白的泛素化，并誘導蛋白酶體降解目標蛋白。Hsc70和Hsp90在內的多種分子伴侶可特異性識別突變型p53蛋白［57］，并在增強突變p53蛋白的穩定性中發揮重要作用。Liu等［58］發現，GA可以通過調節這些分子伴侶進而達到降解突變p53蛋白的目的，GA可以上調Hsc70，下調Hsp90的表達，而對CHⅠP的蛋白質水平沒有顯著影響，進一步的免疫沉淀表明，GA改變了突變p53蛋白和分子伴侶之間的相互作用，呈濃度依賴性地破壞Hsp90與突變p53蛋白相互作用，并促進Hsc70/突變p53蛋白和CHⅠP/Hsc70/突變p53蛋白復合物的形成。隨后Wang等［59］在MDA-MB-435細胞中轉染CHⅠP siRNA后，用GA處理相關細胞時發現伴侶相關泛素連接酶的消失導致突變p53蛋白水平的增加，這一發現強調了GA降解突變p53蛋白的機制，即GA通過上調與突變p53蛋白特異性結合的分子伴侶，并與CHⅠP、E2酶、26S蛋白酶體一起介導突變p53蛋白的泛素化降解。

除此之外GA還可以增加攜帶突變p53蛋白的癌細胞對化療藥物的敏感性［60］。這可能是由于突變p53蛋白本身就是克服腫瘤耐藥性的藥物開發潛在靶點［61］，GA顯著降低了腫瘤細胞中突變p53蛋白水平，從而使其對化療藥物的敏感性增加。

3.2.2 YK-3-273

YK-3-237為combretastatin a4（CA-4）的硼酸查爾酮類似物［62］（圖5），是SⅠRT1酶激活劑并對廣泛含突變p53蛋白的腫瘤細胞表現出抗增殖活性。

SⅠRT1酶是針對p53K382殘基上的一個眾所周知的去乙?；?。無論是野生型還是突變p53蛋白的去乙?；济黠@依賴于SⅠRT1酶的催化。野生型p53K382殘基的乙?；徽J為是其保持穩定［63］的重要決定因素，突變p53蛋白高度穩定的機制目前尚不清楚，但Alves-Fernandes等［64］發現，在TNBC細胞中，小分子化合物YK-3-237激活了SⅠRT1酶活性降低了突變p53蛋白的乙?；?，使突變p53蛋白水平明顯下降。Rozenberg等［65］通過real-time PCR定量分析發現，YK-3-273在肝癌細胞系HUH-7中可誘導GADD45、PTEN和PERP mRNA的表達，在乳腺癌細胞系T47D中，可誘導GADD45和p21 mRNA的表達，在鼻咽癌細胞系CNE-2中，誘導p21 mRNA的表達，在3種不同的TNBC細胞株HS578T、MDA-MB-468和SUM149PT中誘導野生型p53靶基因PUMA和NOXA的表達［66］，這些結果提示，YK-3-237介導的去乙?；梢种仆蛔僷53蛋白在多種腫瘤細胞中的功能，并特異性釋放突變p53蛋白對野生型p53靶基因的轉錄抑制。然而，YK-3-237激活SⅠRT1酶的分子機制需要進一步闡明。最近報道稱，YK-3-237只有在蛋白質被7-氨基-4-甲基香豆素（AMC）標記的情況下才能激活其SⅠRT1酶活性，不能針對新生p53蛋白發揮作用［67］。此外，YK-3-237還能激活人SⅠRT2酶活性，降低了細胞中α微管蛋白水平。通過SⅠRT2酶脫乙酰作用減少α微管蛋白可能與降解突變p53蛋白，上調野生型p53蛋白靶基因的表達共同發揮抗腫瘤作用［66］。

但是目前SⅠRT1酶在人類癌癥中的作用還存在爭議［64］，已有報道稱SⅠRT1酶抑制劑和激活劑（如白藜蘆醇）都能抑制人類腫瘤細胞株的生長［68］。雖然最近已經開發了幾種SⅠRT1酶激活劑，但這些化合物的抗癌作用尚未見報道。鑒于SⅠRT1酶在癌癥、衰老、糖尿病和神經元疾病等許多生物過程中的作用日益增加，YK-3-237可能會是一個很有研究和開發價值的小分子化合物。

3.2.3 他汀類（Stains）

突變p53蛋白在腫瘤細胞中的穩定存在對其GOF活性至關重要［53］，然而目前對突變p53蛋白穩定/降解的特異機制還知之甚少。通過高通量篩選，發現了Stains降膽固醇藥物可作為結構突變型p53蛋白的降解誘導物，并且對野生型p53蛋白和接觸突變型p53蛋白的影響很小。

突變p53蛋白本質上是不穩定的，因為細胞中E3泛素連接酶MDM2及CHⅠP均可以誘導其降解［69］，但是在腫瘤細胞中，突變p53蛋白卻可以與多種分子伴侶如Hsp90、Hsc70、DNAJA1等相互作用從而保持穩定的狀態［70］。甲羥戊酸途徑在結構突變型p53蛋白的穩定以及GOF活性中發揮重要的作用。結構突變型p53蛋白可以結合并激活SREPB轉錄因子，從而上調參與甲羥戊酸途徑的多種酶合成大量的5-磷酸甲羥戊酸（MVP），而5-磷酸甲羥戊酸的上調又可以反過來促進結構突變型p53蛋白與DNAJA1等多種分子伴侶的相互作用，從而使結構突變型p53蛋白在腫瘤細胞中保持穩定的狀態，就這樣形成了一個正反饋循環［71］。并且5-磷酸甲羥戊酸還可以通過調節蛋白質的異戊二烯化，促進腫瘤細胞黏附、遷移和增殖過程中靶蛋白的膜附著［72］。HMG-CoA還原酶是催化甲戊酸途徑的第一步限速酶［73］，Stains藥物通過抑制HMG-CoA還原酶活性，特異性減少細胞內5-磷酸甲羥戊酸的生成，抑制結構突變型p53蛋白與分子伴侶DNAJA1相互作用，從而使結構突變型p53蛋白被細胞內E3泛素連接酶MDM2及CHⅠP介導的泛素化標記并降解。

Stains藥物可以抑制對癌癥進展至關重要的兩種細胞活動——蛋白質異戊二烯化和突變p53蛋白的穩定化，它是一款較為理想的靶向結構突變型p53蛋白的小分子抑制劑。此外，Stains藥物還可使含突變p53R172H蛋白的腫瘤細胞對阿霉素敏感，這表明了Stains藥物可作為獨立或與其他化療藥物聯合治療腫瘤的潛在作用［74］。然而，Moon等［75］發現在小鼠模型中只有阿托伐他汀和瑞舒伐他汀的日劑量分別達到30 mg/kg和10 mg/kg時才會有較好的抗腫瘤效果，這相當于約140 mg和約50 mg的人體劑量，高于成人規定的臨床劑量，這也是為什么Stains藥物治療癌癥的臨床試驗結果存在爭議。因此目前最重要的是發現降低Stains藥物劑量的同時仍保留其誘導突變p53蛋白降解能力的方法。

通過Stains藥物抑制甲羥戊酸途徑-DNAJA1軸誘導結構突變型p53蛋白降解可能代表了一種有希望的治療癌癥的策略。

3.3 間接靶向p53蛋白治療腫瘤的策略

3.3.1 重新激活被抑制的野生型p53蛋白功能

在保持野生型TP53基因表達的腫瘤細胞中，最廣泛采用的治療方法是抑制野生型p53蛋白的降解。野生型p53蛋白降解的機制涉及E3泛素連接酶MDM2對其泛素化標記，最終導致野生型p53蛋白被細胞自身蛋白酶體所降解。MDM2介導的泛素化依賴其與野生型p53蛋白的直接結合，促使人們尋找抑制MDM2-p53結合的小分子作為穩定野生型p53蛋白并使其恢復效力的工具。于是大量靶向MDM2蛋白以重新激活野生型p53蛋白功能的小分子應運而生（表1）。

Table 1 MDM2/MDMX-p53 inhibitors and their mechanisms of action表1 MDM2/MDMX-p53抑制劑及其作用機制

3.3.2 利用miRNA抑制含突變p53蛋白的腫瘤發生

miRNA是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的單鏈RNA分子［79］，主要功能為抑制其靶mRNA的轉譯或促進其降解，因此，miRNA水平的改變可以通過轉錄后機制進一步影響蛋白質水平。野生型p53蛋白可通過直接激活轉錄或促進成熟來調節miRNA水平［80］，而突變p53蛋白會導致p53/miRNA軸的失調和其他miRNA的上調，從而賦予額外的致癌能力，如體細胞重編程等（表2）。此外，最近一些研究聚焦于循環miRNAs，探索其診斷和預后潛力，表明miRNAs的潛在臨床應用價值。miRNAs可能是一種有效的癌癥治療工具。

Table 2 miRNA agonists and their mechanisms of action表2 miRNA激動劑及其作用機制

3.3.3 利用合成致死抑制含突變p53蛋白的腫瘤發生

與直接靶向突變p53蛋白藥物相比，合成致死方法對p53蛋白結構的依賴較小，這表明它可以廣泛作用于多種p53蛋白突變類型。根據腫瘤細胞中所含突變p53蛋白功能喪失（loss of function，LOF）和GOF的不同，可使用不同的策略（表3）。

Table 3 Inhibition of tumorigenesis containing mutated p53 proteins based on synthetic lethal effects表3 基于合成致死效應抑制含突變p53蛋白的腫瘤發生

4 總結與展望

p53蛋白是人體內天然免疫和抗腫瘤反應的重要組成部分。其突變不僅會造成原本抑癌功能的喪失，甚至還會出現一些促進癌癥發生的新功能。幾十年來，科學家們為了戰勝突變p53蛋白提出了各種各樣的觀點，除上文提到的幾種策略外，還提出從水解的突變p53蛋白中提取特異性肽作為新抗原由抗原提呈細胞（antigen presenting cell，APC）提供給B細胞和T細胞以激活免疫反應［87］，利用靶向突變p53蛋白的小分子設計蛋白質水解靶向嵌合體（proteolysis-targeting chimeras，PROTAC）化合物以降解突變p53蛋白等多種方式，達到治療癌癥的目的。然而目前絕大多數針對突變p53蛋白的藥物仍處于初級階段，沒有一款上市，因此現在就斷定針對突變p53蛋白的治療會對癌癥有效還為時過早，但是一旦有針對突變p53蛋白療效較好的化合物出現，就有可能開創癌癥治療新時代，特別是在p53蛋白功能障礙在人類癌癥中如此普遍存在的情況下。

總的來說，突變p53蛋白是一個有吸引力的癌癥治療靶點，隨著針對突變p53蛋白的治療策略及藥物不斷開發，根據患者的TP53基因突變情況設計個性化的治療方案將成為可能。