熒光探針在蛋白磷酸化和糖基化檢測中的應用

常永新，李軍榮，2，邵 娟，楊新迪，卿光焱*

（1．中國科學院大連化學物理研究所 中國科學院分離分析重點實驗室，遼寧 大連 116023；2．大連理工大學精細化工國家重點實驗室，遼寧 大連 116023）

蛋白質翻譯后修飾（PTM）調節幾乎所有的細胞過程，是細胞內調控生物功能和信號傳導的重要機制之一［1］。蛋白翻譯后修飾的研究不僅有助于揭示細胞信號傳導［2］、基因表達和細胞周期等生命現象的調控機制，還為研究疾病的發生和發展過程提供了重要線索。越來越多的研究表明異常的PTM 與多種人類疾病密切相關［3-4］，這使得特定疾病與基因突變的關聯變得非常復雜，甚至使基因組學驅動的個性化治療無效。PTM 蛋白質組學有潛力提供對疾病生物學更全面的理解，并正在成為后基因組時代精準醫學的新突破之一。作為兩種最重要的PTM，磷酸化和糖基化吸引了學術界對癌癥發病機制、生物標志物和治療靶點的發現以及工業界對靶向藥物和疫苗開發的廣泛研究興趣［5-6］。盡管獲得了豐厚的回報，但由于磷酸化和糖基化的豐度極低以及糖基化的巨大異質性和結構復雜性，目前的磷酸化和糖基化分析仍然面臨著一些挑戰。

近年來，熒光探針在研究蛋白質翻譯后修飾中的應用取得了顯著進展［7］。熒光探針具有化學結構簡單、熒光特性穩定、靈敏度高以及可視化能力強等優勢［8］，因此成為研究蛋白質修飾的重要工具。它們能夠通過與特定的修飾位點發生相互作用，實現對蛋白質翻譯后修飾的監測、定量和成像。本綜述將重點介紹熒光探針在蛋白磷酸化［9］和糖基化檢測中的應用。在磷酸化方面，熒光探針通過與磷酸化位點的特異性相互作用，實現對磷酸化修飾的定量檢測和成像以及通過對磷酸化產物檢測實現對蛋白激酶活性的實時監測。在糖基化方面，熒光探針通過與糖基化位點發生特異性相互作用，實現對糖基化修飾的定量分析和可視化。熒光探針在研究蛋白質翻譯后修飾中的應用方面具有廣泛的前景。通過使用這些探針，研究人員能夠實時、準確地監測和分析蛋白質翻譯后修飾的動態變化，揭示細胞信號通路的調控機制以及相關疾病的發生和發展過程［10］。此外，熒光探針還為藥物研發和疾病診斷提供了新的途徑，例如通過篩選小分子抑制劑可發現特定的治療藥物，為精確藥物設計提供指導。然而，盡管熒光探針在研究蛋白質翻譯后修飾中的應用已取得了令人矚目的成果，但仍然存在一些問題。首先，特異性識別不同修飾狀態的挑戰性任務仍然存在，而探針的選擇性與靈敏度密切相關，需要在設計過程中兼顧這兩個方面；其次，熒光信號的穩定性和光學性質對于可視化和定量分析非常重要，因此需要開發更穩定、高亮度的探針。此外，探針的細胞透過性和毒性等問題也需要進一步研究和解決。

本綜述總結了近些年熒光探針在蛋白磷酸化和糖基化檢測中的一些代表性工作。重點介紹探針對不同磷酸化肽的響應情況以及在蛋白激酶活性監測中的應用，通過對比不同探針的結構、發光性能和對磷酸化肽響應的特異性、靈敏度來評價探針的性能以及總結探針的設計理念；在對蛋白糖基化的總結中重點介紹了探針在唾液酸傳感和成像中的應用以及在糖苷酶和糖基轉移酶活性監測中的實例，通過總結這些代表性的工作深入挖掘熒光探針在蛋白質翻譯后修飾中的應用潛力。最后，進行了進一步的總結和展望：熒光探針為深入了解蛋白質翻譯后修飾的機制和功能提供了新的工具和方法，未來應致力于多學科多領域的交叉研究，開發出更加多元化的熒光探針以推動對蛋白質翻譯后修飾的深入理解，并促進其在藥物研發和疾病診斷中的應用。

1 熒光探針在蛋白磷酸化檢測中的應用

蛋白磷酸化是一種常見且重要的蛋白質翻譯后修飾方式，它通過添加磷酸基團來改變蛋白質的結構、功能和性質（圖1A）［11］。蛋白磷酸化參與調控細胞的信號傳導、細胞周期、細胞凋亡、細胞分化和細胞增殖等多種生物學過程［12］。許多重要的細胞信號通路，如MAPK、PI3K/AKT 和Wnt信號通路，都依賴于蛋白磷酸化來傳遞信號并調控細胞功能［13］，對蛋白磷酸化的研究具有重要的科學和臨床意義。磷酸化是細胞信號傳導的核心機制之一，深入了解磷酸化修飾對于揭示細胞信號通路的調控網絡和分子機制非常重要［1］。其次，磷酸化在許多疾病的發生和發展中發揮著關鍵作用，例如，許多癌癥的發生與蛋白質磷酸化異常緊密相關［14］，了解磷酸化修飾的異常調控機制有助于癌癥的早期診斷和治療。此外，磷酸化修飾還與神經系統疾?。?5］、心血管疾?。?6］和代謝性疾?。?7］等多種疾病的發生和進展密切相關。因此，發展高效、可視化的方法和工具來研究和監測蛋白磷酸化，對于揭示其在細胞和生理過程中的作用至關重要。熒光探針通過特異性識別和結合磷酸化位點，實現對磷酸化過程的監測和定量分析。這些探針可以通過熒光共振能量轉移（FRET）、熒光信號開關等機制，實現對磷酸化的高靈敏度檢測。

圖1 激酶（Kinase）和磷酸酶（Phosphatase）催化下的可逆磷酸化反應示意圖（A）［11］，磷酸化殘基的種類（B）及具有單、二、三和多位點磷酸化肽的示意圖（C）［20］Fig.1 Schematic diagram of the reversible phosphorylation reaction catalyzed by kinase and phosphatase（A）［11］，types of phosphorylated residues（B），peptides with single，di，triple and multi-site phosphorylation schematic diagram（C）［20］

1.1 探針在磷酸化肽傳感中的應用

在蛋白磷酸化的研究中，與熒光傳感相關的工作大都集中于對磷酸化肽的檢測［18-19］。磷酸化肽主要指肽鏈中絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）、半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）殘基的側鏈羥基被修飾成酸式磷酸酯的多肽（圖1B），其中還包含一個或多個位點被磷酸化的肽（圖1C），是研究蛋白質磷酸化過程必不可少的靶標［20］。發展高靈敏度、高特異性、強抗干擾能力的合成受體是研究蛋白磷酸化的核心工具。例如，Hamachi 課題組發展了一種以Zn2+-二吡啶甲胺1（圖2）作為磷酸鹽結合單元的熒光探針［21］，其在單磷酸化肽、三磷酸腺苷（ATP）等各種磷酸鹽物種存在的情況下，對特定的雙磷酸化肽顯示出很強的結合親和力和高傳感選擇性。此外，Gunning 團隊開發了一種基于芘的Zn2+探針2（圖2），該探針可以實現單磷酸化肽和近端二磷酸化肽的精確區分，其原理是兩個芘分子互相靠近時會形成激基締合物從而產生一個新的準分子發射峰，基于該原理只需監測準分子發射峰即可實現單磷酸化肽和近端二磷酸化肽的精確區分［22］。為了得到更強的結合親和力并將探針應用于體內磷酸化傳感，Hamachi 教授團隊又發展了一種雙核Zn2+復合物熒光探針3（圖2），用于檢測阿爾茨海默?。ˋD）的代表性標志物—過度磷酸化tau 蛋白的神經原纖維纏結［23］。該探針包含一個BODIPY 熒光團和兩個Zn2+-2，2'-二吡啶甲胺配體用于結合磷酸化氨基酸殘基。結果顯示所構建的探針可以特異性結合磷酸化的tau蛋白（p-tau），對AD 患者的海馬組織切片進行組織學成像發現，該探針可以可視化神經炎斑塊和神經纖維纏結（NFTs）沉積物，并清楚地區分NFTs 和由淀粉樣蛋白-β肽組裝而成的淀粉樣蛋白斑塊。田陽教授在此基礎上進一步發展了近紅外探針4（圖2）用于p-tau 蛋白熒光成像［24］，通過合理設計一種花菁標記的雙核鋅配體熒光探針實現了p-tau 蛋白的壽命成像，該探針對p-tau 蛋白表現出很強的親和力，并成功通過熒光壽命（FLIM）成像在單個神經元水平監測了p-tau蛋白濃度的波動。

圖2 探針1~4的結構［21-24］Fig.2 Structures of probes 1-4［21-24］

在所有的磷酸化修飾中，酪氨酸磷酸化的豐度最低且最為重要（圖1B），其與癌癥的發生密切相關［25］。為了實現對酪氨酸磷酸化的特異性響應，Sumaoka團隊發展了一種對酪氨酸磷酸化肽（pTyr）具有特異性熒光響應的鋱離子（Tb3+）復合物熒光探針5（圖3）［26］。當pTyr 通過其磷酸基團與該Tb3+復合物結合時，Tb3+和pTyr 苯環（天線）之間的距離足夠短允許發生共振能量轉移，因此，Tb3+的發射顯著增加。相反，非磷酸化Tyr 無磷酸基團與Tb3+結合，且pSer/pThr 無芳香環作為天線。因此，非磷酸化Tyr 和pSer/pThr均不能產生明顯的信號，因此pTyr可以被選擇性且清晰地檢測到。除此之外，基于鋱離子還發展了一些其他類型酪氨酸磷酸化肽檢測探針。如：Appelblom 課題組利用鋱離子對酪氨酸磷酸基團的特異性響應，研制了一種可以實時監測Abl 蛋白激酶和T 細胞蛋白磷酸酶活性的探針6（圖3）［27］。對于不同底物的肽序列，在探針存在的情況下均能被蛋白激酶催化發生磷酸化，磷酸化后的熒光強度最大變化達320%，因此可以實時監測酶動力學。Komiyama 等［28］開發了另外一種Tb2-Lc1yne復合物探針7（圖3），其在磷酸化酪氨酸存在時，會發出明顯熒光。由于Tb3+復合物標記位置不影響信號強度，因此Tb2-Lc1yne可以通過點擊化學與多種肽底物共價結合，進而監測酪氨酸的酶促磷酸化反應。

除此之外，基于主客體的超分子探針8（圖3）也可用于蛋白磷酸化的監測［29］。該探針以一種超分子空腔作為主體，幾種熒光分子和金屬離子作為客體，通過改變客體熒光分子，可實現對賴氨酸三甲基化和磷酸化的區分。并且還可通過調節客體金屬離子的比例選擇性檢測絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化。卿光焱課題組還發展了一種基于可逆構型凍結機制的Cu2+配體熒光探針9（圖3），用于蛋白磷酸化傳感和激酶活性的實時監測［30］。探針的工作原理是，Cu2+的添加會猝滅探針的熒光；而磷酸化肽與Cu2+結合會觸發探針分子內部的解離并導致熒光開啟。利用熒光的“OFF-ON”轉換，該探針對修飾在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸上的磷酸化肽顯示出高度敏感和選擇性響應。通過執行簡單的邏輯門操作和引入Ca2+干擾作為輸入，該探針還可實現對多位點磷酸化中酪氨酸磷酸化的特異性識別。

1.2 探針在蛋白激酶活性監測中的應用

蛋白激酶（Kinase）是一類催化蛋白質磷酸化反應的酶，能將三磷酸腺苷（通常是ATP）上的γ-磷酸轉移到蛋白質分子的氨基酸殘基上［31］（如Ser、Thr、Tyr）。蛋白激酶是細胞功能的關鍵調節分子，構成了最大且功能最多樣的基因家族之一［32］。通過添加磷酸基團到底物蛋白，可指導許多蛋白的活動、定位以及總體功能，并且參與編排幾乎所有細胞活動［33］。因此，對于蛋白激酶活性的監測具有重要意義。另一方面，構筑蛋白激酶活性監測的方法還可以篩選激酶抑制劑。激酶抑制劑是一種非常有代表性的抗腫瘤藥物，主要通過抑制細胞信號轉導抑制腫瘤細胞的生長和增殖，促進細胞凋亡［34］。因此，開發用于蛋白激酶活性檢測的熒光探針具有非常重要的價值。

Butler團隊最早發現基于Eu3+的熒光探針10（圖4）可用于蛋白激酶活性的實時監測。該探針可以可逆地結合ATP、二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP），產生獨特的發射光譜，然后基于ADP/ATP 的比率熒光信號實現磷酸化反應過程的監測［35］。2022 年徐茂田課題組發展了一種新型納米探針11（圖4）用于蛋白激酶活性的監測［36］。該探針由金屬有機配位聚合物納米顆粒（Tb/ATP-Zn）自組裝構成，探針本身不發光。當探針被蛋白質激酶A（PKA）催化后，Tb/ATP-Zn 納米粒子內的ATP 被轉化為ADP，從而可有效地敏化Tb3+的發光?；谠摍C制，探針Tb/ATP-Zn 可輕松實現蛋白激酶活性的監測。另一種監測蛋白激酶活性的策略是在底物肽的末端進行熒光標記，如，Lawrence 團隊將熒光團化學添加到兩個肽（Aoc-GRTGRRFSY-酰胺和KRRRLASLAA-酰胺）的N 末端得到探針12（圖4）［37］，帶正電的熒光激酶底物在暴露于帶負電的猝滅劑染料（Q）時被猝滅。當底物被激酶催化發生磷酸化時，由于新引入的磷酸鹽和帶正電的底物殘基之間有利的分子內靜電相互作用，使得染料Q 被釋放?；谶@種策略，添加激酶和ATP到測試溶液中，可觀察到顯著的熒光增強，由此實現了體外的蛋白激酶活性監測。

圖4 探針10~12的結構［35-37］Fig.4 Structures of probes 10~12［35-37］

2 熒光探針在蛋白糖基化檢測中的應用

2.1 探針在糖的識別中的應用

蛋白糖基化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾方式，通過糖苷酶和糖基轉移酶的調控，蛋白可以進行可逆的糖基化或去糖基化（圖5A），這些過程可以精確地調控蛋白質的穩定性、功能和識別性能［38］。熒光探針通過與糖基化位點的特異性識別和結合，實現對糖基化修飾的定量檢測和可視化。這些探針可以通過高分辨率成像技術，揭示細胞內糖基化修飾的空間分布和動態變化［39］。在蛋白質糖基化的研究中，對于唾液酸（SA）的研究最為深入，因為檢測細胞表面的SA 對癌癥的研究至關重要，越來越多的證據表明SA的過表達與腫瘤的發生密切相關［40-41］。SA是一種酸性單糖，以N連接的形式存在于人腦和體液中（圖5B）［42］。近幾十年來，設計作用于SA 的小分子探針一直是一項具有挑戰性的任務，主要是因為糖結構的復雜性和構型的多樣性（圖5C）以及其他糖對探針的干擾。因此，將SA 與其他糖進行區分是一項具有挑戰性的任務?；诖?，Kikkeri等［43］將苯硼酸與短肽共價結合，發展了一種多肽探針13（圖6）用于SA 的傳感。將設計的多肽探針通過生物素與熒光鏈霉親和素綴合，還可實現對細胞表面SA的成像。這種多肽探針具有低毒性和良好的生物相容性，有利于實際應用。

圖5 在糖基轉移酶（GTase）和糖苷酶催化下的酶促反應過程（A），唾液酸的結構式［42］（B），一般聚糖的結構表示（C）Fig.5 Enzymatic reaction process catalyzed by glycosyltransferase（GTase） and glycosidase（A），structural formula of sialic acid［42］（B），structural representation of general glycans（C）

圖6 探針13~18的結構［42-46，48］Fig.6 Structures of probes 13-18［42-46，48］

2023 年Bandyopadhyay 團隊報道了一種雙組分聚集誘導發射（AIE）探針14（圖6）［42］，該探針以四苯基乙烯作為核心發光團通過非共價相互作用與SA和其他糖類發生相互作用，能夠在其他糖類存在的情況下可靠地檢測和清晰地區分SA。此外，作者還通過MDA-MB-231 乳腺癌細胞的熒光成像和表面增強拉曼散射，探索了該探針在細胞表面聚糖成像中的應用。除了SA的識別外，糖組學正在成為研究復雜糖蛋白和糖鏈的一個新領域。然而，由于缺乏通用的糖鏈標記方法，在細胞水平上進行糖蛋白和糖鏈的動態跟蹤非常困難。為了解決這個問題，Wong團隊開發了一種基于Cu+催化的［3+2］環加成或點擊化學的熒光標記方法（探針15，圖6）［44］，該方法允許對帶有疊氮基團的細胞聚糖進行快速、通用和特異性的共價標記?；谠摲椒ㄗ髡邔崿F了細胞巖藻糖基化的動態成像。此外，上官棣華團隊報道了一種新的環辛炔連接的熒光探針16（圖6）［45］用于實時監測活細胞中聚糖的動態分布。該探針可以自由擴散到細胞中并通過生物正交無銅點擊反應選擇性地標記疊氮基聚糖，并可通過比率熒光信號指示聚糖的分布。

此外，楊朝勇課題組開發了一種用于可視化外泌體上特定蛋白質的糖基化熒光探針17（圖6）［46］，該探針的原理是基于結合在外泌體程序性細胞死亡配體（exoPD-L1）上的Cy3 熒光適配體與聚糖上Cy5熒光標簽之間發生的分子內熒光共振能量轉移（FRET），對外泌體PD-L1的糖基化進行原位成像。作者通過一系列表征手段驗證了該探針在外泌體糖基化成像中的適用性并證實了外泌體PD-L1的糖基化不僅在免疫抑制中發揮重要作用，而且可能作為新的免疫治療靶點。

除上述糖基化的研究外，ADP-核糖基化也是一種可逆且高度動態的翻譯后修飾，在從細菌到真核生物的許多細胞通路中都發揮了重要作用［47］。為了深入研究蛋白質ADP-核糖基化，Marx 教授引入了兩種新的攜帶熒光團或親和標簽的腺嘌呤二核苷酸衍生物18（圖6），并結合作者開發的細胞遞送方法，對活體細胞中的ADP-核糖基化進行了研究［48］。該方法不僅可對活細胞中的ADP-核糖基化進行成像，還可對環境變化導致的蛋白質ADP-核糖基化進行細胞適應性的蛋白質組學分析。

2.2 探針在糖基轉移酶活性監測中的應用

除了單糖和糖鏈的檢測和成像外，對于糖基轉移酶活性的監測也是蛋白糖基化研究的重要組成部分。O-GlcNAc 轉移酶（OGT）是一種對蛋白質進行N-乙酰氨基葡萄糖（O-GlcNAc）修飾的酶。它是一種重要的細胞調節因子，研究發現多種疾病與O-GlcNAc 修飾的變化有關，例如癌癥、心血管疾病和神經退行性疾病?；诖?，Vocadlo 報道了一種熒光標記的尿苷5'-二磷酸-N-乙酰葡糖胺類似物19（圖7）。通過使用人類OGT作為目標分析物，作者證實該探針可在體外直接監測OGT催化蛋白質底物發生糖基化的過程［49］。此外，糖苷酶也是一種重要的糖基轉移酶，其中最具代表性的β-半乳糖苷酶是一種通過中間體半乳糖催化乳糖水解為葡萄糖的酶。文獻顯示，β-半乳糖苷酶在原發性卵巢癌中過度表達，可被用作重要的生物標志物［50］用于可視化卵巢癌的腹膜轉移以及區分受影響的細胞和正常細胞。因此，有效檢測和實時監測天然形式的β-半乳糖苷酶的活性具有重要意義。

圖7 探針19~23的結構［49，51-54］Fig.7 Structures of probes 19-23［49，51-54］

Urano等［51］提出了一種監測β-半乳糖苷酶活性的策略，作者將羅丹明熒光團與半乳糖共價偶聯得到探針20（圖7），當探針與β-半乳糖苷酶作用時糖苷鍵被裂解，導致具有強吸電子能力的羥基形成，熒光顯著增強?；谶@種策略作者成功實現了細胞內內源性β-半乳糖苷酶活性的監測。對于不表達β-半乳糖苷酶的細胞，未觀察到這種細胞內發光，而β-半乳糖苷酶過度表達的細胞熒光顯著增強。Ma等［52］采用相同的策略開發了一種基于銥（Ⅲ）的熒光探針22（圖7），該探針也可以成功區分卵巢癌細胞系和正常細胞系，并將研究體系擴展到SKOV3、OVCAR3、HUVEC和HEK-293T細胞系。

韓克利等［53］報道了一種雙光子激發的萘甲酰胺衍生物21（圖7），探針的設計原理是β-d-吡喃半乳糖苷鍵的水解裂解有利于探針的分子內電荷轉移（ICT）過程。探針與β-d-吡喃半乳糖苷酶反應后會形成相應的苯氧基衍生物，其具有強的ICT 過程，可導致顯著的熒光增強和大的斯托克斯位移變化。此外，β-半乳糖苷酶也被認為是細胞衰老的重要生物標志物。采用以萘甲酰亞胺為基體的方法，Sancenón 團隊又開發了另一種雙光子熒光探針23（圖7）用于監測衰老現象［54］。該探針在衰老細胞中被β-半乳糖苷酶水解轉化為游離熒光團，導致熒光發射強度增強。作者使用哌柏西利（一種細胞周期素依賴性激酶（CDKs）4 和6 抑制劑）處理的SK-MEL-103 癌細胞系驗證了探針在體內靶向衰老細胞的效果，與SKMEL-103對照細胞相比，經哌柏西利處理的SK-MEL-103細胞的熒光發射顯著增強。

3 總結與展望

熒光探針作為一種重要的分析工具，在生物醫學領域中得到了廣泛的應用。在蛋白磷酸化和糖基化兩個重要的細胞信號傳導過程中，熒光探針展現出獨特的優勢，為研究者們提供了非常有價值的工具，從而加深了對這些生物學過程的理解。熒光探針在蛋白磷酸化和糖基化檢測領域的研究正在不斷深入。一方面，研究者們正在努力開發更加靈敏和特異性的熒光探針，以實現更精確的蛋白磷酸化和糖基化檢測；另一方面，結合納米技術和成像技術，研究者們也在探索將熒光探針應用于活體細胞和動物模型中，實現對這些生物學過程的原位觀察。此外，多模態探針的研究也在逐漸興起，有望通過整合多種成像技術，獲得更全面的生物學信息。隨著技術的不斷發展，熒光探針在蛋白磷酸化和糖基化檢測領域有望取得更多突破。未來，我們可以期待更加智能化的熒光探針設計，以實現對多個信號通路的同步監測，從而更全面地了解細胞的生理狀態。同時，基于人工智能和機器學習的方法也有望在數據處理和分析方面發揮作用，幫助研究者更好地解讀多重熒光信號產生的復雜信息。此外，跨學科的協作，化學、生物學、物理學等領域的專家們的共同努力，將推動熒光探針技術在生物醫學領域的應用不斷創新和拓展。