類器官芯片在臨床醫學中的應用進展

王欣晨 ，陳友國

（1.蘇州大學附屬第一醫院，江蘇 蘇州 215000；2.浙江省立同德醫院，浙江 杭州 310000 ）

在過去的幾十年中，人類通過生物技術不斷創造出像治療性的單克隆抗體，腺相關病毒基因載體，小干擾RNA 等生物療法，這些新型的治療方法正在逐步改變人類對疾病治療的傳統認知。對于新型治療有效性的檢驗則需要更加可靠的臨床前模型。目前，臨床前模型主要為細胞及動物模型，尤其是基因工程小鼠，在細胞及動物模型上先確定藥物的潛在靶標位置。然而結果卻不盡如人意，盡管在實驗中疾病的細胞及動物模型可能會出現與人類相似的表型，但是人類和動物的潛在分子機制大相徑庭，在這些模型中出現的潛在靶向治療位點最后往往缺乏臨床相關性[1-2]。在美國，各大制藥與生物技術公司每年花費數十億美元去研究某一藥物以獲得美國食品和藥品管理局（FDA）批準上市。但是，許多研究表明，動物實驗結果不能很好的預測人類使用后的結果，很多藥物和疫苗在臨床前的小鼠及非人類靈長類動物模型實驗中都獲得了較好的結果，但是進入臨床后卻未顯示出預期的效果。例如結核分枝桿菌MV85a疫苗、HIV-1DNA/rAdr5疫苗和丙肝疫苗等[3]。還有一些藥物或生物療法可能對人類有效，但是在動物模型實驗中被證明無效或是有一定危險性而被剔除[4]。那么構建能有效模擬人類生物學特性，對疾病及藥物均有良好預測能力的實驗模型，以解決現有的生物學及醫學難題迫在眉睫。

類器官是在體外培養的人多能干細胞（hPSCs）或來源于健康個體或患者成體干細胞（AsSCs）產生的三維（3D）微型結構，可以再現人體器官的細胞結構，功能及組織特異性。由于類器官具有原始器官的遺傳及生物學特性，在生物學及醫學研究和臨床前藥物測試中具有巨大的應用前景，目前已被應用于個性化、再生醫學、基因修復及器官移植等治療［5］。以往類器官的培養需要不同的生長因子的序貫添加，這種培養方法雖然簡單易行，但是該培養方法無法做到精準調控類器官生長及其微環境變化［6-7］。使得類器官無法更好地模擬體外人體器官生物學功能，從而限制其在生物學及醫學領域的使用及發展。為了解決類器官培養技術上的局限性，從事干細胞及生物發育學的研究人員與工程師和物理學家等科學家聯合構建有效的類器官體外模型，一種更新穎的類器官芯片技術應運而生［8］。

2016 年，世界經濟論壇就以將類器官芯片評為十大新興技術。組織工程及微加工技術的發展推動了類器官芯片技術的發展，這些新興的技術更加注重培養細胞時的微環境及細胞幾何排列，實現了細胞培養技術從傳統的2D 單一培養模式轉變為3D 共同培養模式。從而能夠獲得更加穩定的細胞功能，觀察細胞與細胞之間化學及電信號交流等生物學過程［9-12］。此外，微系統技術推動了類器官芯片微流控及微型化驅動器及傳感器的發展，是一個具有里程碑意義的重要技術，該技術是基于集成電路原理而設計，并利用軟光刻技術來實現納米及微米級的類器官芯片［13］。其次，細胞系是類器官芯片實現應用價值的基礎部分，怎樣使類器官芯片具有個性化患者特征，目前可利用多能誘導干細胞技術（iPSC）將不同患者細胞整合到類器官芯片中，構建不同種類類器官芯片，研究疾病之間表型的差異及對藥物的特異性反應等［14-16］。除了上述各大技術日新月異的進步，材料學的快速發展也為類器官芯片的構建創造了條件。例如，聚二甲基硅氧烷（PDMS）目前廣泛應用于利用軟光刻技術構建的類器官芯片，PDMS 制作簡單，成模性、彈性及滲透性好等優點［17］。類器官芯片是依據集成電路的原理并利用計算機微芯片微加工制作技術，根據靶器官最小生物學功能單元，對靶器官功能單元進行檢測，以確定這些功能單元的不同細胞組成類型及特異性的生化及物理微環境，以此為基礎構建體外組織細胞解剖微模型的體外培養技術，從而代替傳統細胞及動物模型，進行機體不同生理過程模型及疾病病理過程模型的構建，藥代和藥效動力學及藥物敏感，再生醫學及器官移植等機制研究。

本文將重點介紹類器官芯片培養材料和技術上的更新，培養時所遇到的問題及臨床醫學研究上應用進展等內容。

1 類器官和類器官芯片

類器官和類器官芯片是兩種完全不同但又互補的技術，其共同目標就是構建有效的體外靶器官模型，以實現各種生物學及醫學用途。類器官是利用組織干細胞的自身生長發育程序，在體外進行人工培養。傳統的類器官培養方法有深層液體培養法、氣液共培養法，以深層液體培養法舉例，如：腸道類器官的建立可以以純化的成人小腸隱窩或是分選純化的LGR5+腸道干細胞（ISCs）為細胞系，并在生長因子的誘導下模擬干細胞龕形成。該培養條件包含有Wnt 通路，表皮生長因子（EGF），骨形態發生蛋白（BMP）抑制劑Noggin 等，使得ISCs 能夠長期自我更新并分化為靶細胞譜系，最終形成高度極化的3D 上皮結構，腸道隱窩-絨毛室［18］。人體器官在生長發育，分化發展過程中保持著高度可重復性。但是，類器官是在體外培養的靶細胞3D 微結構，其無法實現高度可重復性。類器官在生長發育過程中，會出現大小、組織結構、生物學功能及基因表達的巨大差異。類器官批次間的差異，會限制其在疾病模型應用，藥物篩選及器官移植等醫學領域的轉化應用［8］。類器官僅依靠被動擴散來接受營養物質及氧氣，并排出代謝產物，但是當類器官代謝加快時，這種被動擴散方式就無法支持類器官的生長發育［19］。與之相比，類器官芯片是利用現有人體器官生物解剖微結構，來構建組織細胞微結構及微環境，并精準調控細胞生長及微環境變化。盡可能去還原解剖微結構，模擬正常組織器官能量攝取及代謝產物的排出模式，使得細胞及組織能夠正常生長發育，完成原有生物學功能。例如肺的最小解剖功能單元是肺泡，肺泡-毛細血管單元即氣-血屏障是由Ⅰ型肺泡上皮細胞、基膜、薄層結締組織、毛細血管基膜及內皮細胞組成。肺泡壁是由Ⅰ型肺泡上皮細胞（扁平細胞，其基膜緊貼毛細血管），Ⅱ型肺泡上皮細胞（分泌上皮，可以分泌肺泡表面活性物質），隔細胞（位于肺泡間隔中）和肺泡隔（是相鄰兩個肺泡間的結構，有結締組織和豐富的毛細血管組成）。值得注意的是，人在呼吸運動時，肺泡-毛細血管單元會在呼吸誘導下會被周期性機械性牽拉，這是在制作類器官芯片時應注意的特異性微環境。該細胞培養裝置應模擬氣-血屏障，該裝置由多個獨立微腔室構成，微腔室被分為上下兩層的雙通道，中間有一層柔性微孔膜結構分隔。上層可供氣體自由流通；中間層的微孔膜可供肺泡上皮細胞及肺微血管上皮細胞在膜兩側共培養，模擬氣體交換屏障；下層可供液體流通，模擬血流系統。為了更好地模擬呼吸過程中肺泡的機械性牽拉作用，該裝置兩側設置了真空腔，以模擬呼吸過程中的肺泡-毛細血管單元受到的機械性牽拉作用。最后根據此設計，利用軟光刻等微加工技術來完成類器官芯片的制作［8,20-21］。

2 類器官芯片的材料分類及技術上的更新

2.1 類器官芯片制作材料分類

根據不同組織細胞的特性，類器官芯片的制作可能需要依賴各種不同的材料。根據材料的不同，可以將材料大致分為合成材料，合成材料又分為彈性合成材料、熱塑性合成材料；雜化材料；天然材料；無機材料等。下面列舉了一些常用的材料特性［22］。見表1、表2。

表1 常見彈性合成材料的優缺點及應用模型

表2 常見熱塑性合成材料的優缺點及應用模型

雜化材料是同時具有天然及合成材料優勢的新型材料，對細胞有更好的親和性，其降解產物屬于天然成分。雜化材料的可控性及可降解性為類器官芯片提供了更好的材料［22］。天然材料主要包括膠原蛋白［42］、明膠［43］、纖維蛋白［44］、透明質酸［45］、甲殼素和殼聚糖［46-47］、藻酸鹽［48］，這些天然材料來自人體組織，生物兼容性較好，能為干細胞的生長發育、增殖、遷移提供更加穩定的環境。無機材料主要包括玻璃、硅和紙等材料。

2.2 類器官芯片制作的技術更新

2.2.1 生物仿生膜工程 類器官芯片是一種能夠模擬器官功能的仿生系統，在類器官芯片各個組成部分中，生物仿生膜是一種可控的模仿生物系統的重要組成部分。生物仿生膜可以模擬細胞外基質，并用于微流控仿生生物膜工程［49］。在體內，生物膜參與各種生理過程，如細胞間電化學信號傳導，物質交換及運輸等。生物仿生膜有利于我們可能更加清晰地去了解細胞膜的生物學功能，為疾病的治理提供有效方法［50］。例如，生物仿生膜可利用粒子被動擴散原理來模擬細胞膜功能，來評估經皮給藥的藥物擴散模型［51］。

2.2.2 生物打印技術 目前，雖然已有多種先進的技術和設備用來制造類器官芯片，但是在制作過程中仍出現很多問題?，F有的主要技術難題是類器官芯片中細胞導入量低。最初，類器官芯片的制備及注入細胞的過程需要人工手動操作。研究人員人工將細胞懸液或是負載細胞的水凝膠吹打入所需要培養的芯片部位，這個操作過程無法做到標準化。此外，類器官芯片中的細胞數量應是真正靶器官成比例的縮減，正常比例的存活細胞才能體現靶器官的生理功能，對各種刺激的反應才具有真實性及準確性［52-53］。細胞及組織的生物3D 打印技術的快速發展，逐漸使上述生產過程標準化且自動化。生物打印技術是將先進的3D 打印技術與生物材料相結合，從而構建復雜且精密的類器官芯片［54］。生物打印技術從1984 年開始迅速發展［55］。目前生物打印技術主要分為噴嘴方法和基于光學設備的光輔助方法。后者是一種新興的高分辨率生物打印技術［56］。生物3D 打印機可安裝于無菌環境中，有效避免了傳統人工操作過程中可能的污染［57］。因為生物3D 打印技術的標準化及自動化，可以有效節約構建類器官芯片的時間成本［58］。普通移液器接種細胞時，需要24 h才能使細胞固定，而生物3D 打印技術可以快速固定細胞，允許直接引入流動液體。生物3D 打印技術具有高通量，可重復性特點，其過程標準化且自動化，可實現類器官芯片批量生產［54］。

2.2.3 微流控技術 類器官芯片是一種能夠模擬人體內組織細胞微環境的微流控體外細胞培養裝置［59］。類器官芯片主體由流體電路板構成，流體電路板是通過開放標準接口來微流控制多種組件，如傳感器等［59］。微流控技術就是一種模擬人體循環系統的技術。循環系統是人體完成各種生理及病理過程不可缺少的部分，其包含血液、淋巴液、尿液等，承載著氣體，營養物質及代謝產物等的運輸及交換，并將人體各大器官緊密連接，所以大部分的類器官芯片中都有一個主動灌注的管腔系統［60］。微流控控制系統保證了類器官芯片有恒定及脈沖式循環系統，更好地模擬人體內組織細胞微環境。

3 類器官芯片中組織細胞培養的問題

3.1 微環境中生物機械力作用

人體從胚胎發育起會經歷各種類型的生物機械力，如血液的流體剪切力，單細胞的牽拉力和大細胞群（心臟收縮、呼吸運動等）的協調機械活動產生的生物機械力［61］。越來越多的研究表明，如果在組織細胞培養中缺乏這些生物機械力的作用會影響類器官芯片中的組織細胞正常生理功能的形成［8］。目前微工程技術已經可以解決這一問題，并可以模擬應用類似的生物機械力。例如LEE 等［62］制造了一種胃模型類器官芯片，該裝置是將人多能誘導干細胞（PSCs）培養在管腔中，管腔兩側與一對微電流套管連接。管腔中有液體流動，模擬胃內容物，管腔兩側的微電流予以管腔刺激，模擬胃的節律性舒張運動。

3.2 微環境中營養物質

培養組織細胞時需要運送氧氣及營養物質并排出代謝產物，但是隨著組織細胞的不斷增殖及分化，氧氣和營養物質可能無法滿足組織細胞的需求［19］。這是類器官芯片壽命縮短，無法長期培養的原因。人類的胚胎發育過程中，需要大量的脈管系統參與輔助完成，依據這一思想原理，我們在培養類器官芯片時也應模擬大量血流的灌注［63］。例如SHIRURE 等［64］制造了一種腫瘤模型類器官芯片，一個腫瘤腔室與三個中央腔室相聯通并通過微流控來控制血流灌注，腫瘤腔中的腫瘤細胞來自乳腺癌患者，中央腔室中的血管是由血管內皮細胞與成纖維細胞共培養而形成。雖然這種血管形成方式與胚胎中血管形成方式不同，但是微流控平臺可以模擬腫瘤周圍的血管生理灌注，使中央腔中的血管長入腫瘤腔中，最終完成腫瘤血管化。通過這種培養模式，腫瘤細胞可以維持長達22 d 之久。

3.3 微環境中化學信號

在培養類器官時，需要以特定的時間順序給予合適濃度的形態生成素刺激干細胞，以激活下游的細胞信號通路，從而使干細胞生長分化為目的靶器官［65］。在傳統類器官培養過程中，以人工方式在特定的時間加入外源性形態生成素，外源性形態生成素與細胞自分泌的細胞因子就可在類器官局部微環境中形成化學梯度濃度，以誘導細胞特定的生長分化。形態生成素是以濃度依賴的方式來影響組織細胞生長發育的，組織細胞暴露在不同梯度濃度的信號水平，會產生出不同的轉錄水平及細胞結局等的變化。但是這種人工模擬化學梯度濃度是不穩定的，且不可控的，往往不能很好地模擬人體內器官生長發育所需要的局部微環境化學信號變化［66］。目前研究人員正在利用微工程技術來嘗試解決這以問題，例如基于微流控系統構建神經管體外發育模型，這個模型包括一個中央控制室，兩側各有一個微通道，該模型中的細胞系為胚胎干細胞（ESC），將其培養于中央控制室中。兩側微通道中分別循環流動混有不同比例濃度的sonic hedgehog（Shh）和bone morphogenetic protein（BMP）細胞因子，在中央控制室腔外形成濃度梯度差，以模擬神經管背腹軸不同生長分化趨勢［67］。

3.4 多器官系統共培養

人體內各種復雜的生理及病理過程往往需要多器官系統共同合作完成。為了更好地模擬人體內真實的器官間互作時的過程，研究人員利用微工程技術平臺在體外構建多器官共培養芯片，模擬體內多器官相互作用［68］。例如：JIN 等［69］利用微流控矩陣來模擬肝臟和胃腸道多器官共培養模型。不同的組織分別培養在不同腔室，腔室之間利用搖床誘導介質來模擬不同臟器系統之間的物質交流。該模型被用于探究體內肝腸互作調節膽汁酸穩態機制。當對該模型予以外源性膽汁酸刺激時，腸道類器官通過旁分泌因子作于肝臟類器官，肝臟類器官中膽汁酸合成酶表達減少，該模型證明了對于體內某一信號變化，可能需要多器官互作，只對某一器官單獨造模不能很好的模擬體內生理及病理過程。

4 類器官芯片在臨床醫學中的應用

4.1 肝臟類器官芯片

目前臨床上已構建了多種肝臟類器官芯片，用于肝炎、肝毒性、肝臟藥物代謝等機制研究。中國是乙型肝炎感染大國，目前利用乙型肝炎患者來源肝細胞制作的肝臟類器官芯片已經成功復刻了乙型肝炎病毒在體內的生命周期，主要包括乙型肝炎病毒的復制和乙型肝炎病毒共價環狀DNA 的維持等。此外，該芯片模擬自然免疫反應與乙型肝炎患者中自然免疫反應相似［70］。肝臟類器官芯片的另一用途是模擬人類的肝毒性反應，由微工程多空屏障技術（模擬內皮細胞通透性屏障）分離出的原代人肝細胞構建的類器官芯片較好的模擬出肝竇狀隙生物學功能，可以進行大分子物質運輸，重現了抗炎藥雙氯芬酸的代謝肝毒性［71］。臨床上還可利用不同來源的供體肝細胞構建多個類器官芯片研究不同人種對肝臟藥物代謝的影響。分別對六種不同藥物進行損耗普分析發現，不同供體之間基因表達水平，藥物代謝及肝細胞生物學功能均存在較大差異，且芯片預測的藥物清除率與實際觀察的藥物清除率有良好的相關性［72］。

4.2 心臟類器官芯片

目前臨床上應用的心臟類器官芯片模型大致分為兩種。一種是在單通道微流控裝置中培養多能誘導干細胞來源的心機細胞，其細胞外基質上連接了多電極陣列，用于實時檢測組織水平的電生理反應，該模型已被用于心臟毒性藥物的研究，如特非那頂和其無毒性代謝產物非索非那定之間的差異［73］。另一種心臟類器官芯片則是利用微加工聯合3D 打印技術構建多能誘導干細胞來源的心機細胞和內皮細胞的微界面，重現臨床上抗癌藥物阿霉素對心臟心機的毒性作用［74］。

4.3 腸道類器官芯片

臨床上，已構建了多種大小腸模型用于各種腸道疾病、藥物代謝及毒性的研究。腸道模型構建應注意生物機械力：一是管腔內動態流動流體，這對小腸的絨毛形成及大腸中杯狀細胞及雙側黏液的形成均起到至關重要的作；另一種是類似于腸道的蠕動機械牽拉力，這樣才能更好地模擬腸道微環境變化，該模型類似于上述的肺部類器官芯片模型，分為上下兩層的雙通道，中間層培養上皮細胞［4］。近期，研究人員利用腸道類器官芯片模擬了一種在落后國家流行的兒童腸道炎癥疾病，即環境腸道功能障礙（EED）。該疾病最主要的病理改變為腸道絨毛變鈍及腸道屏障受損，導致對營養物質吸收受阻，如：脂肪酸攝取障礙和氨基酸轉運受損。在構建該腸道疾病模型時，研究人員利用EED 患者來源的腸上皮細胞，并將其培養于煙酰胺和色氨酸缺乏的微環境中。該模型較好地重現了EED 患者的疾病狀態及轉錄水平的變化［75］。在腸道類器官芯片中灌注外周血單核細胞共培養模型，可用于檢測目前尚處于臨床研發階段的靶向人癌胚抗原的T 細胞雙特異性抗體的藥物毒性。既往的動物實驗模型無法進行準確評估［76］。

4.4 胎盤類器官芯片

由于孕婦是較為特殊的群體，臨床醫師在選擇治療性藥物時會格外謹慎。如何篩選出安全有效的藥物就要構建能夠有效模擬人體內胎盤屏障的模型。胎盤類器官芯片利用滋養細胞和內皮細胞共培養模擬妊娠期胎盤屏障，主要用于預測妊娠期用藥的安全性，篩選藥物以了解其穿透胎盤的能力。以妊娠期糖尿病格列本脲為模型藥物，該類器官芯片可以重現外排轉運體介導的胎盤屏障主動轉運功能，從而避免胎兒暴露于母體藥物環境中［77］。

5 總結

目前藥物研發是類器官芯片最具前景的醫學臨床應用。類器官芯片融合了現代微工程，微系統及微流控等先進技術和靶器官精準解剖微結構，比傳統的細胞動物模型更好地模擬了人體內靶器官生物學功能，又彌補了類器官在造模時的不穩定因素。類器官芯片也可為患者提供個性化治療，并可模擬構建人類特異性疾病模型［78-79］。此外，由于類器官具有再生潛能，可有望應用于再生醫學領域，但是類器官的移植成功率和安全性卻使得其進行醫學轉化變為難題。類器官芯片可提供高通量分析平臺，為類器官在體外培養創造條件［19］。類器官芯片作為一種新興的融合技術擁有無限未來，但其也面臨著諸多的挑戰。一是PSCs可用于構建類器官芯片的細胞系，該細胞系簡單易得，且構建的類器官芯片性能穩定，可進行高通量檢測。但是人多能誘導干細胞在培養過程中不能完全分化為成熟組織表型［80］。另一個問題是藥物有效吸收率，PDMS 是多用于構建類器官芯片的生物材料，但是PDMS 具有高疏水性，所以僅具有高疏水性的藥物會被顯著吸收［81］。

由于類器官芯片建模具有可重復性、精準性和穩定性，可進行高通量平臺檢測，且結果數據穩定，其未來可能會改變傳統醫學研究方式，替代細胞及動物實驗，構建更加理想的生長發育及各種疾病模型，為藥物篩選提供臨床前模型及器官移植提供可靠供體等。