施氮活化根際土壤磷素促進粗齒冷水花的磷素積累

唐 瑞，蒲 勇，戴文穎，余海英，李廷軒，葉代樺*

（1 四川農業大學資源學院，四川成都 611130；2 瀘州市現代農業發展促進中心，四川瀘州 646000；3 成都環境創新科技有限公司，四川成都 610000）

磷是植物生命活動所必需的大量營養元素，然而土壤磷多以植物難以直接吸收利用的形態存在[1]。為滿足植物生長需求，提高作物產量，農業生產中大量磷肥施入土壤[2]，但長期不合理施用會帶來磷礦資源耗竭和水體富營養化風險等系列問題[3]。土壤有效磷含量超過45 mg/kg (以P2O5計)被視為磷素過剩[4]，據統計，我國磷肥施用量已占全球施用總量的52%，全國農田土壤從南到北全磷含量變幅為 0.31～1.72 g/kg，有效磷含量變幅為 91.5～420.0 mg/kg，集約化耕作土壤的磷累積現象嚴重，平均磷累積量高達 242 kg/hm2[5-7]。利用磷富集植物提取土壤過量磷，降低環境污染風險；植物收獲后又可作為綠肥資源，實現資源綠色高效利用[8]。Duo grass、多花黑麥草(Loliummultiflorum)、澳洲狐尾(Ptilotuspolystachyus)等植物因磷含量高(＞1%)或適應高磷環境等特點被認為是較有潛力的磷富集植物[9-11]。但它們植株生物量較小，導致磷積累量較小，磷提取率較低。研究發現，粗齒冷水花(Pileasinofasciata)在高磷處理下，地上部生物量和磷積累量分別可達到31.12 g/plant 和223.73 mg/plant，是修復磷過剩土壤的優勢植物[12]。

氮是植物生長發育所必需的大量營養元素，氮肥的供應對植物生長發育和磷吸收具有重要影響[13]。施氮能顯著提高磷富集植物狗牙草(Cynodon dactylon)[14]、百喜草(Paspalumnatatum)[15]、水蓼(Polygonumhydropiper)[16]等的生物量和磷含量，有效提高植物磷積累能力。據報道，施氮能提高植物葉片光合作用，促進光合產物積累，增加生物量；施氮也能提高植物磷酸鹽吸收相關基因表達，增加植物根際土壤有效磷含量，促進植物磷吸收，從而提高植物磷積累[17-19]。

然而，施氮是否能提高磷富集植物對不同濃度高磷的耐性？施氮提高磷富集植物的磷積累能力和磷提取效率的作用機制是什么？這些問題均有待進一步探討。植物磷提取能力不僅取決于自身生理特性，也受根際土壤磷有效性的影響[20]。土壤磷有效性與土壤不同組分磷含量密切相關[21-22]。連續浸提法將土壤磷劃分為H2O、NaHCO3、NaOH、HCl 提取態有機磷和無機磷，以及殘渣態磷[22]。其中，H2O 和NaHCO3提取態磷為有效性較高的磷形態，易被植物吸收利用；NaOH 提取態磷為植物的潛在磷源，HCl提取態和殘渣態磷較穩定，通常需礦化分解為有效性更高的磷形態才能被植物獲取[23]。含磷化合物的礦化分解過程主要發生在根際土壤中，受根際土壤磷酸酶和微生物的驅動[24]。土壤磷酸酶影響土壤含磷物質的分解率，其活性高低受植物根系和土壤微生物的共同影響[25]。施氮是否通過影響根際磷的形態轉化進而促進植物磷吸收尚不清楚。因此，了解施氮對植物根際土壤磷組分、磷酸酶和微生物活性的影響具有重要意義。

前期研究發現，施氮后粗齒冷水花磷富集能力增強，其生物量和磷積累量隨施氮量增加先升高后降低，且均在施氮量為140 mg/kg 時達到最大[26]。因此，本研究利用已篩選出的磷富集植物礦山生態型粗齒冷水花為材料，探討適宜施氮處理對礦山生態型粗齒冷水花磷積累能力和根際土壤磷素特征的影響，揭示施氮促進粗齒冷水花磷吸收積累的根際過程，為后期合理利用粗齒冷水花提取環境中過剩磷提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植物為粗齒冷水花(Pileasinofasciata)。其中，礦山生態型(mining ecotype，ME)采自四川省什邡市磷礦區(104°50′E，30°25′N)，非礦山生態型(non-mining ecotype，NME) 采自雅安市雨城區(102°59′E，29°58′N)。

供試土壤為灰潮土，采自四川省都江堰市蒲陽鎮，基本理化性質：pH 7.1，有機質含量22.9 g/kg，全氮含量1.03 g/kg，堿解氮含量39 mg/kg，有效磷含量14.4 mg/kg，速效鉀含量46 mg/kg。

供試肥料：尿素(N 46%)、磷酸二氫鉀(P2O552.1%; K2O 34.6%)、硫酸鉀(K2O 54%)。

1.2 試驗設計與處理

盆栽試驗設4 個磷(P) 水平：0、400、800、1200 mg/kg，分別記作P0、P400、P800、P1200；2 個氮(N)水平：0、140 mg/kg，記作N0、N140。每處理重復4 次，共64 盆，完全隨機排列。采用土培盆栽試驗，土壤風干后，壓碎過2 mm 篩混勻，每盆(8 L)裝土8 kg。磷、鉀配成溶液一次性施入土壤(每盆配施相應量的K2SO4以平衡土壤中因施入KH2PO4而帶入的鉀)，充分混勻陳化8 周，幼苗移栽前3 天將氮肥(尿素)配成溶液加入土壤。

粗齒冷水花采用扦插育苗，幼苗的扦插管理采用劉霜等[27]的方法。待幼苗于蛭石中生根培養40 天后，選擇長勢一致的幼苗移栽至塑料盆中，每盆種2 株。每周澆水2～3 次，按田間持水量的70%確定灌水量，及時除草、防治病蟲害，采用自然光照，并記錄植株生長狀況，試驗于四川農業大學教學科研園區有防雨設施的網室中進行。

1.3 樣品采集與制備

于移栽后11 周采樣。植物樣品先用自來水沖洗再用蒸餾水潤洗，洗凈后用吸水紙擦干。將其分為地上部和地下部，分別裝袋后于105℃條件下殺青30 min，75℃條件下烘干至恒重，粉碎后過1 mm 篩用于磷含量測定。土壤樣品采用抖土法收集，收集粘附在根表的土壤作為根際土，其余土壤整盆混勻后采集部分作為非根際土，一部分土壤樣品用保溫箱低溫帶回后存于-20℃冰箱，用于土壤酶活性和微生物指標的測定；一部分土樣經自然風干后磨碎過篩，用于土壤磷組分及其他化學性質的測定。

1.4 測定項目及方法

植株地上部生物量(干重) 采用烘干稱重法測定；植株磷含量采用H2SO4-H2O2消煮—釩鉬黃比色法[28]測定。土壤基本理化性質采用常規分析方法[28]測定；土壤磷組分采用Tiessen-Moir[22]的方法測定；土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性采用對硝基苯磷酸二鈉法測定[28]；植酸酶參考Ramesh 等[29]的方法測定；土壤微生物生物量碳、氮均采用氯仿熏蒸浸提測定[30-31]；土壤微生物基礎呼吸量、基質誘導呼吸量均采用靜態堿液吸收法測定[32]。

1.5 數據處理

磷積累量P accumulation (mg)=生物量Biomass(g) × 磷含量 P concentration (mg/g)。

采用SPSS (22.0)進行統計分析，選擇LSD 法進行多重比較，圖表制作采用Excel (2016)和Origin(2018)完成。

2 結果與分析

2.1 施氮處理對粗齒冷水花磷積累能力的影響

2.1.1 生物量 隨磷濃度增加，兩種生態型粗齒冷水花地上部和地下部生物量均先升高后降低，ME 生物量高于NME (圖1)。高磷條件下，與不施氮相比，施氮顯著增加了兩種生態型粗齒冷水花生物量，ME 和NME 地上部生物量分別增加27.5%～72.5% 和18.7%～80.1%，地下部生物量分別增加29.7%～103.7%和3.6%～75.6%。不施氮處理下，兩種生態型粗齒冷水花地上部和地下部生物量均在高磷800 和1200 mg/kg 處理時受到抑制，生物量降低；施氮處理提高了兩種生態型粗齒冷水花對高磷的耐性，其生物量在高磷800 mg/kg 處理時達到最大，ME 和NME 地上部生物量分別為27.2 和23.0 g/plant，ME 是NME 的1.18 倍。表明施氮處理不僅能提高粗齒冷水花生物量，還能提高植株的高磷耐受能力，且ME 高磷耐受能力強于NME。

圖1 施氮對兩種生態型粗齒冷水花地上部和地下部生物量的影響Fig.1 Effects of N application on shoots and roots biomass of the two ecotypes of P.sinofasciata

2.1.2 磷積累量 隨磷濃度增加，兩種生態型粗齒冷水花地上部和地下部磷積累量均先升高后降低，ME 的磷積累量高于NME (圖2)。高磷條件下，與不施氮相比，施氮顯著增加了兩種生態型粗齒冷水花磷積累量，ME 地上部和地下部磷積累量最大增幅分別為78.7%和63.2%，NME 最大增幅分別為125.6%和113.7%。不施氮處理下，兩種生態型粗齒冷水花磷積累量在高磷400 和800 mg/kg 處理時無明顯差異，而施氮處理下，兩種生態型粗齒冷水花磷積累量在高磷800 mg/kg 處理時最大，ME 和NME 地上部磷積累量分別可達193.8 和155.8 mg/plant，分別是不施氮處理下植株地上部磷積累量的1.69 和1.52倍，而ME 是NME 的1.24 倍。表明高磷條件下施氮顯著提高了粗齒冷水花的磷積累能力，ME 磷積累能力強于NME。

圖2 施氮對兩種生態型粗齒冷水花地上部和地下部磷積累量的影響Fig.2 Effects of N application on shoots and roots P accumulation in two ecotypes of P.sinofasciata

2.2 施氮處理對粗齒冷水花根際土壤磷組分的影響

施氮處理下，兩種生態型粗齒冷水花高磷耐受能力和磷積累能力在磷800 mg/kg 處理時最強。因此，選擇高磷800 mg/kg 處理下的樣品進行檢測，分析其土壤化學特性變化特征。由表1 可知，與不施氮相比，施氮增加了兩種生態型粗齒冷水花根際土壤H2O-P 和NaHCO3-Pi 含量，ME 根際土壤增幅分別為10.24%和20.47%，NME 增幅分別為14.69%和16.71%。此外，兩種生態型粗齒冷水花根際土壤H2O-P 和NaHCO3-Pi 顯著高于非根際，表現為明顯的根際富集；根際土壤NaHCO3-Po 和NaOH-Pi/Po則相反，具有明顯的根際損耗。表明施氮促進了粗齒冷水花根際土壤磷向有效性更高的組分轉化，增加了粗齒冷水花根際土壤磷的有效性，有利于植株對磷的吸收。施氮處理下，ME 根際土壤H2O-P 和NaHCO3-Pi 含量顯著低于NME 根際土壤，分別為NME 根際的90.13%和81.34%，其他磷組分在生態型之間無顯著差異。表明ME 對根際有效性較高的磷組分的吸收能力強于NME。

表1 施氮對種植粗齒冷水花土壤磷組分含量的影響Table 1 Effects of N application on concentrations of P fractions in soils planted with P.sinofasciata

2.3 施氮處理對粗齒冷水花根際土壤磷酸酶活性的影響

由圖3 可知，與不施氮相比，施氮處理顯著提升了兩種生態型粗齒冷水花根際和非根際土壤酸性磷酸酶和堿性磷酸酶及根際植酸酶的活性。施氮處理下，除了 NME 土壤酸性磷酸酶活性外，兩種生態型粗齒冷水花根際土壤磷酸酶和植酸酶活性均顯著高于非根際土壤。此外，ME 根際土壤酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和植酸酶活性均高于NME，分別比NME高7.50%、15.05%和8.93%。表明施氮處理增加了兩種生態型粗齒冷水花對根際土壤磷的礦化能力，ME 對根際土壤磷的有效化能力更強。

圖3 施氮對兩種生態型粗齒冷水花土壤酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和植酸酶活性的影響Fig.3 Effects of N application on activities of acid phosphomonoesterase, alkaline phosphomonoesterase and phytase in the soil of two ecotypes of P.sinofasciata

2.4 施氮處理對粗齒冷水花根際土壤微生物生物量和活性的影響

2.4.1 土壤微生物生物量碳、氮 由圖4 可知，與不施氮相比，施氮處理顯著提升了兩種生態型粗齒冷水花根際土壤微生物生物量碳(MBC)、微生物生物量氮(MBN)含量，ME 與NME 根際土壤MBC 增幅分別為22.33%和25.21%，MBN 增幅分別為52.59%和56.06%。此外，在施氮處理下兩種生態型粗齒冷水花根際土壤MBC、MBN 顯著高于非根際土壤，而不施氮處理下無顯著差異。表明施氮增加粗齒冷水花根際土壤微生物生物量，有利于根際土壤微生物對土壤養分的活化。

圖4 施氮對種植粗齒冷水花土壤微生物生物量碳和微生物生物量氮含量的影響Fig.4 Effects of N application on concentrations of microbial biomass carbon and nitrogen in the soils planted with P.sinofasciata

2.4.2 土壤微生物呼吸作用 由圖5 可知，與不施氮相比，施氮處理顯著提升了兩種生態型粗齒冷水花根際土壤基礎呼吸量和根際及非根際土壤基質誘導呼吸量，ME 增幅分別為15.74%、33.49%和36.80%，NME 增幅分別為15.67%、36.62% 和33.04%。此外，除NME 根際與非根際土壤基質誘導呼吸量無差異外，其余處理下兩種生態型粗齒冷水花根際土壤基礎呼吸量和基質誘導呼吸量均顯著高于非根際土壤，而兩種生態型間無明顯差異。表明兩種生態型粗齒冷水花根際土壤微生物呼吸作用更強，施氮能進一步提高根際土壤微生物的呼吸作用。

圖5 施氮對種植粗齒冷水花土壤基礎呼吸和基質誘導呼吸量的影響Fig.5 Effects of N application on basal respiration and substrate induced respiration in the soils planted with P.sinofasciata

3 討論

3.1 高磷條件下施氮提高粗齒冷水花磷積累能力

磷富集植物耐受高磷的能力是其應用于修復磷過剩土壤的基礎，植物的生長情況是其在脅迫環境下耐受能力的直接體現[33]。供磷水平過高，植物總根長和根際羧化物總量減少，導致植株根系對養分的吸收減少，進而影響植株正常生長發育[34]。施氮可促進植物生長發育，增強其對高磷的耐受能力，磷富集植物水蓼[16]、黑麥草和狗牙草[14]等地上部生物量在施氮后均顯著增加。本研究中，施氮顯著增加了兩種生態型粗齒冷水花的生物量。此外，不施氮條件下，粗齒冷水花生物量在高磷800 和1200 mg/kg 處理時顯著降低，生長明顯受抑制；而施氮后粗齒冷水花在高磷800 mg/kg 處理時未受抑制，生物量顯著提高，并且其在高磷1200 mg/kg 處理時的生長抑制也明顯緩解。表明施氮可提高粗齒冷水花對高磷的耐受能力。

植物磷富集能力主要取決于地上部磷積累總量。適宜施氮能增加水稻[35]、玉米[36]、棉花[37]、番茄[38]、水蓼[16]等植物地上部磷積累量。施氮可通過增加植物根系分泌物量和種類，調節根際土壤pH 等以降低土壤對磷的固定，提高土壤有效磷含量[39]，有利于植物吸收磷；施氮對植物根系活力、根系形態等具有提升作用，可增強植物根系對磷的吸收能力[40]，進而促進植物磷積累。本研究同樣發現，在適宜施氮處理下，ME 與NME 粗齒冷水花地上部磷積累量分別可達193.82 和155.81 mg/plant，分別是不施氮處理下植株地上部磷積累量的1.69 和1.52 倍，表明施氮可顯著提高兩種生態型粗齒冷水花的磷積累能力。

3.2 高磷條件下施氮促進粗齒冷水花根際土壤磷組分轉化

植物根際土壤磷組分變化可反映植物對土壤磷的利用狀況[21-22]。土壤H2O-P 和NaHCO3-P 是活性磷組分，NaOH-P 為中活性磷組分，HCl-P 和Residual-P為穩定性磷組分，植物在生長過程中較易獲取的是土壤H2O-P 和NaHCO3-Pi[41-42]。本研究中，兩種生態型粗齒冷水花根際土壤有效性較高的H2O-P 和NaHCO3-Pi 組分含量增加，根際土壤NaHCO3-Po 含量降低，表明施氮可增加粗齒冷水花根際土壤磷的有效性，有利于植株對土壤磷的吸收利用。

植物根際土壤磷組分變化與植物根系吸收密切相關，有效性較高的磷組分易被植物吸收利用，導致土壤磷含量降低。玉米(ZeamaysL.) 和紫穗槐(Amorphafruticosa)根際土壤H2O-P、NaHCO3-Pi 明顯損耗[43-44]；生長41 天的油菜(Brassicanapus)根際土壤NaHCO3-Pi 含量顯著降低[21]；白羽扇豆(Lupinus albusL.) 根際土壤NaOH-Po 含量明顯升高，而NaOH-Pi 含量有所降低[45]；多年生黑麥草(Lolium perenne)根際土壤NaOH-Pi 和NaOH-Po 含量明顯損耗[46]。而在本研究中兩種生態型粗齒冷水花根際土壤H2O-P 和NaHCO3-Pi 含量高于非根際土壤，根際土壤NaHCO3-Po、NaOH-Pi 和NaOH-Po 含量則低于非根際土壤。這可能是粗齒冷水花根系對土壤H2O-P和NaHCO3-Pi 的吸收量低于其他磷組分轉化為H2OP 和NaHCO3-Pi 的總量，從而其在根際富集；同時，粗齒冷水花根際土壤磷酸酶和微生物活性高于非根際土壤，根際土壤NaHCO3-Po 和NaOH-Po 礦化水解程度劇烈，導致根際有效性較低的磷形態轉化為有效性較高的磷形態。此外，施氮處理下，ME粗齒冷水花根際土壤H2O-P 和NaHCO3-Pi 低于NME，可能是ME 粗齒冷水花對土壤H2O-P 和NaHCO3-Pi吸收能力更強所致。

3.3 高磷條件下施氮提高粗齒冷水花根際土壤磷酸酶和微生物活性

氮是植物和微生物生長代謝的必需營養元素之一，適量施氮能促進植物產生和分配較多的光合產物到地下部，根系分泌物種類和量增加，有助于植物對土壤磷的礦化分解[46]。土壤磷酸酶來源于植物根系和土壤微生物，其活性高低決定土壤有機磷的分解率[10]。土壤植酸酶是一種磷酸單酯水解酶，可專一性礦化分解土壤植酸磷[25]。土壤磷酸酶、植酸酶和微生物活性影響土壤磷的礦化分解速率[47]。前期研究發現，施氮增加了粗齒冷水花根系酸性磷酸酶和植酸酶活性[12]，根系分泌磷酸酶是根際土壤磷酸酶活性增加的原因之一；同時，根系分泌物為根際土壤微生物提供大量能量來源，有利于根際土壤微生物生長繁殖，使根際土壤微生物數量和活性大于非根際土壤，可在根際土壤產生更多的磷酸酶和植酸酶[48]。本研究發現，施氮處理下粗齒冷水花根際土壤酸性磷酸酶、堿性磷酸酶和植酸酶活性均顯著提高，有利于粗齒冷水花根際土壤磷的礦化分解。

土壤微生物在土壤磷循環過程中起重要作用，是土壤磷循環的調節者，土壤微生物活性增強可提高土壤磷周轉率，進而增加磷酸鹽離子向土壤溶液的轉移，促進有機磷的遷移轉化[49-50]。土壤MBC、MBN 和土壤呼吸強度是反映土壤微生物活性的重要指標[51]。施氮有利于土壤MBN 的保蓄，增加MBN的同化量；而對土壤MBC 未產生規律性影響[52]。土壤肥力水平較低時，施氮增加土壤礦化作用，減少土壤有機碳量，此時土壤微生物能量來源受限，土壤MBC 含量減少[53]。種植植物土壤中，施氮可促進植物生長發育，其根系分泌物為微生物提供更多碳源，進而增加根際土壤MBC 含量[54]。本研究中，施氮處理顯著增加了粗齒冷水花根際土壤微生物生物量碳、氮且顯著高于非根際土壤。這可能是施氮有效促進了粗齒冷水花根系生長發育，根系分泌物為根際環境提供了豐富碳源，有利于根際土壤微生物生長繁殖，提高土壤MBC、MBN。土壤呼吸以土壤微生物呼吸為主體[55]，受土壤溫度、水分、施肥、C/N 等因素影響[56]。施氮能改變土壤呼吸強度且存在劑量效應[57]。與不施氮相比，施氮顯著提升草地土壤呼吸強度[58]。施氮150 kg/hm2提高土壤呼吸強度，而施氮250 kg/hm2降低土壤呼吸強度[59]。本研究中，施氮顯著提高粗齒冷水花根際土壤基礎呼吸和基質誘導呼吸強度，根際土壤微生物活性增強，有利于粗齒冷水花根際土壤磷的礦化分解?？赡苁怯捎谑┑黾油寥赖?，降低土壤C/N 值，促進微生物分解更多土壤有機質，從而增加土壤有機質中碳的分解和釋放，激發了土壤呼吸作用。施氮能提高粗齒冷水花根際微生物生物量碳、氮和呼吸強度，說明施氮能提升高磷環境下根際微生物生物量與活性，這可能是施氮后根際土壤磷有效化與植物磷富集能力提升的原因之一。

4 結論

不施氮時，粗齒冷水花的生長和磷積累能力在高磷處理下受到抑制。施氮可提高粗齒冷水花根際土壤磷酸酶、植酸酶和微生物活性，消除高磷抑制生長的現象，進而促進粗齒冷水花的磷積累，且對礦山生態型磷積累的提升作用更明顯。