谷胱甘肽酵母水解物對干露脅迫下凡納濱對蝦肝胰腺糖代謝相關基因的影響

陳建東，張 玲，程 濤，胡祥娜，楊 凡，易建華，楊志龍，李兆文，譚北平，遲淑艷，曹愛巧

(1.廣東海洋大學水產學院水產動物營養與飼料實驗室，廣東 湛江 524088；2.深圳市質量安全檢驗檢測研究院，廣東 深圳 518055；3.安琪酵母股份有限公司湖北省酵母功能重點實驗室，湖北 宜昌 443003)

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）又稱南美白對蝦，有生長速度快、肉質細嫩和適應能力強等優點[1-2]，已成為全球最主要的養殖甲殼類動物之一。在捕撈和無水運輸時，凡納濱對蝦會遭遇干露。干露是對蝦在自然環境、繁殖或運輸等過程常見的問題[3]，但會造成對蝦的低氧脅迫，引起氧化應激，擾亂內源性穩態，對肝胰腺組織細胞造成損傷[4]，導致對蝦死亡和肉質下降[5]。因此，提高對蝦抵御干露脅迫的能力對于提高鮮蝦產品品質有重要意義。

谷胱甘肽，L-γ-谷氨酰-L-胱氨酰甘氨酸，是一種三肽類物質，普遍分布在活細胞中[6]，主要有還原型谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）兩種形式[7]，在水產養殖中應用廣泛。研究表明，飼料中添加GSH 可提高草魚（Ctenopharyngodon idella）[8]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[9]、虹鱒（Oncorhynchusmykiss）[10]、吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）[11]、中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）[12]和凡納濱對蝦[13]的生長性能、抗氧化能力及免疫力。酵母水解物含有β-葡聚糖、GSH、核苷酸和甘露寡糖等免疫刺激物質[14]，作為原料或飼料添加劑可改善養殖動物生長性能、抗氧化能力、非特異性免疫及緩解炎癥[15-17]。添加16.2 g/kg 的酵母水解物可使凡納濱對蝦獲得最佳的生長；添加到50 g/kg也不會對凡納濱對蝦的生長產生負面影響，并可有效提高對副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的抵抗力[18]；補充酵母水解物還可提高凡納濱對蝦消化酶活性以及抵抗低鹽脅迫的能力[14,19]。本研究探討富含谷胱甘肽的酵母水解物在凡納濱對蝦飼料中的使用效果，主要關注其對干露脅迫下的凡納濱對蝦肝胰腺糖代謝相關基因的影響，為谷胱甘肽酵母水解物在水產養殖中的應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗設計和飼料配制

以基礎飼料（魚粉質量分數17.7%）為對照組，在基礎飼料中分別按質量分數0%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%的比例添加谷胱甘肽酵母水解物（含質量分數5%的GSH，安琪酵母股份有限公司），分別記為G0、G0.3、G0.5、G0.7、G0.9、G1.1。飼料原料粉碎后過孔徑180 μm 的篩，所有原料混勻，制成粒徑為1.0、1.5 mm 的顆粒飼料，自然風干至水分質量分數約10%，分裝密封后置于-20 ℃冰箱中存放待用。實驗飼料組分和營養水平見表1。

表1 實驗飼料組分質量分數Table l Mass fraction of ingredient of experimental diets%

1.2 實驗動物飼養管理

在實驗開始前，用商品飼料飼喂實驗蝦（湛江國聯水產種苗科技有限公司），暫養2 周后，禁飼24 h，挑選出活力強、規格均勻、初始體質量（0.24±0.01）g 的幼蝦，隨機分配于6 個處理組，每處理3 重復（0.3 m3玻璃鋼桶），每桶30 尾蝦。投喂實驗飼料養殖4 周。每天7:00、11:30、16:30、21:00 各投喂1次，每天投喂40 min 后檢查攝食情況，根據對蝦攝食情況及天氣情況調整投喂量。養殖期間每天換水量近50%，水溫28～31 ℃，鹽度10～12 g/L，pH 值7.5～8.3，溶氧質量濃度大于5 mg/L，氨氮質量濃度小于0.03 mg/L。

1.3 樣品采集及分析

在養殖實驗結束時，所有蝦禁飼24 h，計數、稱質量，計算凡納濱對蝦的增重率（WGR）、特定生長率（SGR）和飼料系數（FCR）。每個重復取4 尾對蝦的肝胰腺組織于RNA later中，檢測干露脅迫前凡納濱對蝦肝胰腺相關基因的表達。

從每個重復中隨機取對蝦10 尾，在陰暗處（室溫26 ℃，濕度85%）干露30 min。取4 尾對蝦肝胰腺組織于RNA later中，檢測干露脅迫后凡納濱對蝦肝胰腺相關基因的表達。

1.4 肝胰腺相關基因的表達分析

用Trizol Reagent（TransGen Biotech，中國）提取肝胰腺的總RNA，用分光光度計（ND-2000，Nano-Drop Technologies，Wilmington，美國）評估RNA 質量。將合格的RNA 作為反轉錄模板，使用Evo M-MLV RT Mix 試劑盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）合成cDNA。用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR試劑盒II（湖南艾科瑞生物工程有限公司）進行實時定量PCR（Roche LightCycler?480），分析缺氧誘導因子1（HIF-1α）、葡萄糖轉運蛋白1（GLUT1）、己糖激酶（HK）、果糖磷酸激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PK）、乳酸脫氫酶（LDH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、蘋果酸脫氫酶（MDH）和細胞色素氧化酶（CCO）等基因的相對表達。10 μL 反應體系包含cDNA 模板1 μL，正反向引物各0.5 μL，2 × SYBR?Green Pro Taq HS Premix II 5 μL，無菌雙蒸水3 μL。反應條件為：95 ℃30 s；95 ℃5 s，60 ℃30 s，40 個循環。用β-actin作參考基因，2-ΔΔCT方法用于計算基因的表達水平。用于qRT-PCR分析的引物見表2。

1.5 統計分析

數據用平均值± 標準誤表示，采用SPSS 21.0軟件進行數據分析和統計，先對數據作單因素方差分析，若組間差異顯著，再用Tukey’s 檢驗進行多重比較，同一處理組干露脅迫前后進行t-檢驗，顯著性水平α為0.05。

2 結果

2.1 谷胱甘肽酵母水解物對凡納濱對蝦生長性能的影響

由圖1 所示，各處理組之間的凡納濱對蝦增重率、特定生長率和飼料系數無顯著差異（P＞0.05），表明飼料中添加不同水平谷胱甘肽酵母水解物對凡納濱對蝦生長性能無顯著影響。

圖1 谷胱甘肽酵母水解物水平對凡納濱對蝦生長性能的影響Fig.1 Effect of glutathione yeast hydrolysate on growth performance of Litopenaeus vannamei

2.2 干露脅迫對凡納濱對蝦肝胰腺HIF-1α 表達的影響

如圖2所示，在干露脅迫前，各處理組之間的凡納濱對蝦肝胰腺HIF-1α基因的表達差異不顯著（P＞0.05）。在干露脅迫后，G0 組的凡納濱對蝦肝胰腺HIF-1α基因的表達顯著上調（P＜0.05）。

圖2 在干露脅迫前后凡納濱對蝦肝胰腺HIF-1α基因的表達Fig.2 Expression of hepatopancreatic HIF-1α genes in Litopenaeus vannamei before and after air exposure

2.3 干露脅迫對凡納濱對蝦肝胰腺糖酵解關鍵基因表達的影響

如圖3 所示，關于對蝦肝胰腺GLUT1基因表達，在干露脅迫前，G0 組顯著低于G0.5 和G0.9 組（P＜0.05）；在干露脅迫后，各處理組之間差異不顯著（P＞0.05）；同一處理組在干露脅迫前后均未呈現顯著差異（P＞0.05）。干露脅迫前后各處理對蝦肝胰腺HK和PFK基因的表達未產生顯著影響（P＞0.05）。G0 組對蝦肝胰腺PFK基因表達在干露脅迫后顯著上調（P＜0.05）。在干露脅迫前，各處理組間對蝦肝胰腺PK基因的表達差異不顯著（P＞0.05）；在干露脅迫后，G0 組對蝦肝胰腺PK基因的表達量顯著高于G1.1組（P＜0.05），但與其他處理組相比差異不顯著（P＞0.05）。在干露脅迫前，各處理組間對蝦肝胰腺LDH基因的表達差異不顯著（P＞0.05）；在干露脅迫后，G0 組對蝦肝胰腺LDH基因顯著上調（P＜0.05），且顯著高于其他處理組（P＜0.05）。

2.4 干露脅迫對凡納濱對蝦肝胰腺三羧酸循環及氧化磷酸化關鍵酶基因表達的影響

如圖4所示，關于對蝦肝胰腺SDH基因的表達，在干露脅迫前，各處理組間差異不顯著（P＞0.05）；在干露脅迫后，G0 和G1.1 組均下調（P＜0.05），G0組表達量顯著低于G0.3、G0.5和G0.7組（P＜0.05）。肝胰腺MDH基因的表達，在干露脅迫前，各處理組差異不顯著（P＞0.05）；在干露脅迫后，G0組顯著下調（P＜0.05），且顯著低于G0.3、G0.5、G0.7 和G0.9組（P＜0.05）。對蝦肝胰腺CCO基因的表達，在干露脅迫前，G0 組低于G0.3 和G0.7 組（P＜0.05），但與其他組相比差異不顯著（P＞0.05）；在干露脅迫后，G0、G0.3和G1.1組均顯著下調（P＜0.05），G0組的表達量顯著低于G0.5和G0.7組（P＜0.05）。

圖4 在干露脅迫前后凡納濱對蝦肝胰腺SDH、MDH和CCO基因的相對表達量Fig.4 Relative expression of hepatopancreatic SDH,MDH and CCO genes in Litopenaeus vannamei before and after air exposure

3 討論

一般來說，能量代謝是細胞和生物體的主要生理過程。環境脅迫可影響機體能量代謝乃至生存。無水運輸時的干露脅迫是甲殼類動物養殖中的典型脅迫，會導致其脫水及缺氧，甚至死亡[20]。在缺氧環境下水生動物會由有氧呼吸代謝轉變為無氧呼吸代謝，產生能量以維持機體正常生命活動[21]，但無氧代謝途徑產生能量效率較低，不能提供足夠的能量來維持有氧消耗。缺氧可導致甲殼類動物行為、生理、細胞和分子層面的變化，具體取決于缺氧的持續時間和嚴重程度[22]。

肝胰腺是對蝦主要能量代謝器官[23]。HIF-1 由HIF-1α和HIF-1β亞基組成的異二聚體，在肝胰腺調節能量供應和消除缺氧引起的有害物質方面發揮重要作用。HIF-1α 感知細胞中的氧氣[24]，對于維持正常的細胞功能以應對缺氧至關重要[25]。干露脅迫會誘導日本囊對蝦（Marsupenaeus japonicus）肝胰腺HIF-1α基因的表達[26]；HIF-1α基因的高表達意味著凡納濱對蝦耐缺氧的能力較差[27]。在干露脅迫前，各處理組間凡納濱對蝦肝胰腺HIF-1α基因的表達無顯著差異，干露脅迫引起凡納濱對蝦的缺氧應激反應，誘導基礎飼料組的凡納濱對蝦肝胰腺HIF-1α基因的顯著上調，而谷胱甘肽酵母水解物處理組的凡納濱對蝦肝胰腺HIF-1α基因表達未發生顯著變化。干露脅迫誘導機體內自由基產生增加，引起氧化應激[28]，機體為抵御氧化應激需要消耗大量ATP，從而使ATP 含量迅速降低[29]。機體為維持能量供應消耗大量氧氣以加快能量代謝，產生ATP，從而導致肝胰腺中的氧氣含量迅速降低，誘導HIF-1α基因上調。GSH 為抗氧化劑，其巰基官能團可與自由基反應，緩解機體產生ATP 來抵御氧化應激，減少氧氣消耗。GSH 還有維護電子傳遞、保持有氧呼吸代謝速率的功能[30]。因此，本研究凡納濱對蝦攝食富含谷胱甘肽的酵母水解物，有效地減少了凡納濱對蝦肝胰腺的氧化應激，使其仍可維持較強的有氧呼吸代謝，因而未顯著誘導HIF-1α基因的上調，從而提高凡納濱對蝦耐缺氧能力。

HIF-1α 還是重要的轉錄分子，HIF-1α 可誘導凡納濱對蝦PFK[31]及LDH[32]基因的上調，HIF-1α 高表達的細胞中糖酵解水平明顯增加[33]。無水?；钸\輸時的干露狀態也會使凡納濱對蝦的糖酵解加快[34]。HK、PFK和PK是糖酵解關鍵限速酶，均受轉錄水平的調控[34]。缺氧可誘導凡納濱對蝦肝胰腺PFK基因的表達[31]，本研究中，干露脅迫可誘導基礎飼料組凡納濱對蝦肝胰腺PFK基因的顯著上調，增強干露脅迫條件下凡納濱對蝦的糖酵解途徑。然而，谷胱甘肽酵母水解物處理組的凡納濱對蝦肝胰腺HK、PFK及PK基因未發生顯著的上調，其肝胰腺HIF-1α基因同樣未受到干露的顯著影響，表明谷胱甘肽酵母水解物可較好地維持凡納濱對蝦的有氧呼吸代謝。

SDH 和MDH 是三羧酸循環中的關鍵酶，在細胞能量代謝中起重要作用[35]。本研究中，各處理組凡納濱對蝦肝胰腺SDH和MDH基因表達在干露脅迫前無顯著差異；但干露脅迫后，基礎飼料組凡納濱對蝦肝胰腺SDH和MDH基因顯著下調，三羧酸循環減弱，添加質量分數0.3%～0.9%谷胱甘肽酵母水解物可減緩凡納濱對蝦肝胰腺SDH和MDH基因因干露脅迫誘導的下調。此外，SDH 還是電子傳遞鏈的起始酶[21]，影響氧化磷酸化，反映有氧呼吸代謝的水平。在干露脅迫條件下中華絨螯蟹的肝胰腺SDH 活性下降[36]，阻礙了電子傳遞，影響氧化磷酸化，降低有氧呼吸代謝水平。細胞色素氧化酶（CCO）是電子傳遞鏈的末端酶，是有氧呼吸的限速酶[37]。干露脅迫誘導基礎飼料組的凡納濱對蝦肝胰腺CCO基因的顯著下調，阻礙了電子傳遞，降低有氧呼吸代謝速率，添加質量分數0.5%～0.9%谷胱甘肽酵母水解物可減緩因干露脅迫誘導的SDH和CCO基因的下調，維持電子傳遞，使凡納濱對蝦保持較強的有氧呼吸代謝，產生能量，抵御干露脅迫。

LDH 是糖酵解途徑的末端酶，還是連接三羧酸循環的關鍵環節，在無氧條件下，LDH 的誘導表達可催化丙酮酸轉化為乳酸，并產生少量ATP 為機體提供能量，是無氧呼吸代謝的關鍵酶[38-39]。干露脅迫可誘導基礎飼料組凡納濱對蝦肝胰腺LDH基因的表達顯著上調，增強機體的無氧代謝途徑，表明凡納濱對蝦依賴糖酵解途徑補償干露脅迫引起的能量供應不足。無氧代謝途徑增強會導致對蝦的肝胰腺和肌肉產生大量的乳酸[39-40]，降低肌肉細胞的pH 值，低pH 激活ATP 酶，加速ATP 的分解，直到ATP 完全消失[41]。若ATP 分解速率超過合成速率，會導致肌原纖維中肌球蛋白和肌動蛋白無法分離，形成不可擴展的肌動球蛋白，導致肌肉僵硬[41]，最終影響肌肉品質。GSH 可降低缺氧脅迫誘導的細胞LDH 活性[42]，添加谷胱甘肽酵母水解物處理組凡納濱對蝦肝胰腺LDH基因的表達在干露脅迫前后無顯著差異，這說明添加谷胱甘肽酵母水解物有助于凡納濱對蝦維持較強的有氧呼吸代謝，維持基本的生理代謝，更好地抵御干露脅迫。

本研究主要在基因表達層面關注谷胱甘肽酵母水解物對凡納濱對蝦干露急性應激條件下肝胰腺能量代謝的變化，未能進一步觀察肝胰腺結構上的變化。此外，由于缺少凡納濱對蝦血清生化相關指標導致無法進一步探討代謝基因表達的變化與生化響應的關聯，這是本研究的不足之處。

4 結論

干露脅迫下，凡納濱對蝦肝胰腺中的HIF-1α、PFK和LDH基因顯著上調，有氧呼吸代謝相關基因（SDH、MDH和CCO）顯著下調，凡納濱對蝦肝胰腺的有氧呼吸代謝減弱，無氧呼吸代謝增強。攝食含有適量谷胱甘肽酵母水解物的飼料可使凡納濱對蝦在干露脅迫的條件下仍維持較強的有氧代謝，為機體提供能量，抵御干露脅迫。