基于胎兒游離DNA的地中海貧血無創產前診斷的研究進展

許桂丹綜述,鄧益斌審校

0 引 言

地中海貧血(地貧)是全球分布最廣、累及人群最多、危害性最大的一種單基因病。地貧難治可防,通過產前診斷阻止重型患兒出生是目前國內外公認的首選預防措施。絨毛膜吸取、羊膜腔穿刺和臍靜脈血穿刺是目前常用的產前診斷技術,但均屬于侵入性操作,除母體細胞污染導致的基因型誤診風險,還有一定流產、宮內感染、胎兒損傷甚至死亡等并發癥的風險。孕婦外周血胎兒游離DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)的發現為遺傳性疾病的無創產前DNA檢測(noninvasive prenatal testing,NIPT)提供了新的途徑。近年來,數字PCR、突變序列富集法、分子大小分離法、飛行時間質譜分析和下一代測序(next-generation sequencing, NGS)的發展與應用,使無創產前地貧診斷成為現實,相關技術的進一步發展有望推動其他遺傳病無創性產前診斷的應用。本文主要就cffDNA和NGS的地貧NIPT研究進展作一綜述。

1 NIPT的發展概況

傳統的血清學產前篩查及超聲檢查檢測時間窗窄,且漏診率和假陽性高,絨毛、羊水和臍靜脈血穿刺產前診斷均屬于侵入性。一直以來,研究學者們為尋求安全有效的產前診斷技術做了相關大量工作,早在1954年,Chown等[1]研究發現,在失血性貧血胎兒中發現有胎兒紅細胞進入母體血液循環。1997年,Lo等[2]從孕婦血漿中檢出男性胎兒Y染色體上特異序列,并且發現孕婦血漿cffDNA在孕早期可以檢測,其含量明顯高于其他胎兒成分,這一重大發現在NIPT史上具有里程碑意義。2008年,Chiu等[3]檢測了28例孕婦孕早期和孕中期的血漿樣本,測序結果14例21號染色體三體胎兒和14例正常胎兒全部驗證,這一重要研究發現開啟了NIPT時代。2010年,Lo等[4]證實cffDNA包含整個胎兒基因組,并且以相對恒定的比例與母體基因組共存于孕婦外周血中。利用孕婦外周血中cffDNA進行遺傳性疾病的NIPT具有安全、無創、準確率高(有些疾病可達99%以上)、檢測時間窗長,檢測周期短等優勢,而成為產前診斷的研究熱點。

2 母體血液中cffDNA的生理特性

孕母血漿中的cffDNA主要來源于凋亡和損傷的胎盤滋養層細胞[4],在孕7周就可檢出,其含量隨著孕周的增大而增加[5]。cffDNA具有以下特點:①含量低,cffDNA僅占血漿總游離DNA的4%～37%,其余為母親的游離DNA,母體內cffDNA的百分比也稱胎兒濃度(fetal fraction, FF)[6];②片段化,cffDNA片段被降解,平均大小為166bp[7];③半衰期短,cffDNA半衰期僅為4～30min,分娩2h后在母體內迅速清除,不受既往妊娠影響或影響下一胎孕期檢測[8];④影響因素,cffDNA受孕婦體質量指數(BMI)、孕早期篩查參數和吸煙狀況等因素的影響[9-10]。因此,單基因病的NIPT檢測面臨著許多技術挑戰:①如何檢測與高濃度母源性DNA共存的cffDNA?②當cffDNA測出的突變型別中有與孕婦相同的突變時,如何明確胎兒的基因型?③如何運用短片段的cffDNA檢測缺失型突變。為克服以上難題,大量的可行性診斷策略不斷探索[3-11]。

3 地貧NIPT的研究進展

目前,將cffDNA應用于胎兒染色體非整倍體NIPT的已經成熟應用于臨床,針對21、13、18三大染色體非整倍體疾病的檢測準確率高達99%以上,具有早期、快速、安全、無創、準確率高等特點[12]。NIPT plus是在21、13、18三大染色體的基礎上,增加其他的常染色體非整倍體以及各種微缺失/微重復的檢測[13-14]。目前,NIPT還廣泛應用于各種單基因遺傳病測定,可檢測涉及30個基因25種疾病的相關變異[15]。近期的研究表明,在地貧NIPT技術具有較好的應用前景[16-17]。

3.1β-地貧NIPT的研究進展2002年,Chiu等[18]首次報道運用NIPT技術進行地貧產前診斷,利用cffDNA和特異性熒光定量PCR技術,定性檢測cffDNA是否存在父源性突變基因型,通過排除父源性突變判斷檢測對象是否為重型地貧兒,這一研究開啟了地貧NIPT的道路。通過檢測cffDNA中是否存在父源性突變的方法適用于夫婦雙方攜帶不同β-地貧基因型的情況,未檢測出父源性突變則可排除胎兒為重型地貧兒,但如果檢出父源性突變位點,胎兒仍需要進行侵入性產前診斷以排除是否同時遺傳了母源性突變。當夫婦雙方攜帶的β-地貧基因型相同時,以上方法則不適用。2004年,Ding等[19]報道夫婦攜帶同種β-地貧基因型的NIPT策略,先篩選出一組與父源突變基因連鎖且區別于孕婦的特異性SNP標簽,通過檢測cffDNA是否存在特異性標簽來判斷胎兒基因型。如何特異性識別cffDNA是NIPT最大的技術難題[20]?；贚o等[4]關于cffDNA以相對恒定的比例與母體DNA共存于孕婦外周血的理論,通過不同SNP對β-地貧基因突變位點進行捕獲,運用相對突變劑量(relative mutation dosage,RMD)分析或序列概率比檢驗方法構建單體型相對劑量模型(Relative Haplotype Dosage, RHDO)讓NIPT識別母源性基因位點具有可行性。Xiong等[21]利用NGS技術和RMD,對49例已經確診為父源性β-地貧遺傳性的cffDNA樣本,鑒定出48例存在母源性等位基因中,有44例(91.7%)與確診結果一致,有1例為假陽性,3例為假陰性。Saba等[22]運用NGS技術檢測37名孕婦的cffDNA,通過構建RHDO模型實現對β-地貧c.118C>T的NIPT。Erlich等[16]結合目標區域捕獲測序技術和SNP分析估計FF,綜合家系結果,推斷胎兒突變基因型,結果證實探針捕獲NGS技術在β-珠蛋白異常血紅蛋白的NIPT中具有潛在的應用價值。

探針捕獲NGS的應用使游離孕婦外周血中低濃度cffDNA的有效識別成為可能,這將極大推動已知突變位點的β-地貧NIPT的發展,但目前仍缺乏高靈敏性和特異性識別cffDNA的生物信息學分析方法,仍需要不斷的探索與驗證[23-24]。

3.2α-地貧NIPT的研究進展中國南方是地貧高發區,常見的α-地貧突變的類型主要為缺失型,其中以--SEA基因型為主[25-28],我們前期對桂滇黔省際邊界民族地區38 812對77 624例育齡夫婦研究表明,α-地貧同型夫婦高達3414對,其中有808對夫婦有可能生育巴氏胎兒,有1849對夫婦有可能生育中間型地貧[27]。有研究人員應用超聲技術中的頸項透明層、胎兒心胸比值、胎盤厚度、胎兒大腦中動脈血流速度、胎兒超聲心動圖等重要指標進行無創性診斷巴氏水腫胎兒的研究[29-32],但是超聲技術診斷巴氏水腫胎兒特異性欠佳。因此,準確的α-地貧NIPT技術的發展和應用對我國南方具有重要意義。

缺失型α-地貧往往片段較大,臨床上常用gap-PCR、多重連接探針擴增和多重熒光定量PCR等技術進行檢測,用以上方法檢測高度片段化cffDNA中的大片段缺失存在很大的困難。重型α-地貧患兒的父母均為α-地貧大片段缺失,孕婦外周血漿中最大成分的母源性DNA本身含有1∶1的缺失型片段和野生型序列,父源性等位基因排除法不適用。Yan等[33]用類似Ding等[19]的策略,先篩選和設計出可特異性識別父系遺傳的SNP等位基因標簽,對已經進行侵入性的67例孕婦進行該策略的評估,結果有33例準確排除了巴氏水腫胎,與傳統參考方法完全一致,有2例因溶血而結果不準確,該方法在地貧NIPT的應用上具有良好的應用前景。Ge等[34]結合利用目標序列捕獲測序法,通過與正常對照組比較,利用母親血漿的相對拷貝比,結合二項統計數值R評分(R-score)和L評分(L-score)分析,計算出胎兒拷貝數的信號,在5例--SEA純合子高風險的胎兒進行驗證,結果提示,有1例基因型為--SEA純合缺失、2例為--SEA雜合缺失,另外兩例正常,結果與侵入性產前診斷一致,但是,該方法對FF要求高,加上孕婦血漿中目標區域的捕獲特異性遠不如基因組的捕獲,因此仍需要不斷進行條件的優化。Wang等[35]基于cffDNA的原理通過靶向捕獲測序和單倍型輔助分析對兩個生育重型地貧風險的家庭進行無創產前分析,結果證實與羊水產前診斷結果一致。Chen等[36]招募了59對有重型地貧胎兒風險的夫婦,基于人群數據單倍型分析,成功推斷出94.1%胎兒等位基因,通過侵入性產前診斷確認其準確率達99.1%,從而認為基于人群數據單倍型分析的地貧NIPT是一種敏感、快速、經濟的策略。

4 結語與展望

無創、準確、安全、簡便的產前診斷技術一直是遺傳性疾病診斷的方向和目標。NGS技術的發展極大地推動了NIPT的應用。目前,利用孕婦外周血漿中的cffDNA檢測胎兒染色體非整倍體項目已經成熟應用于臨床。隨著技術的不斷完善和創新,檢測靈敏度不斷提高,NIPT技術甚至應用到胎兒表觀遺傳學、轉錄組學、基因組學等各方面,利用孕母血漿進行測定獲取胎兒表達調控、拷貝數變異及微缺失/微重復,從而實現胎兒疾病早期診斷、干預和避免患病胎兒出生的目的。但是,由于cffDNA 含量較低、地貧基因突變型別的復雜性和多樣性、技術操作的繁瑣以及數據分析復雜等問題, NIPT應用于地貧產前診斷仍需要大量的探索和實驗驗證。隨著研究的不斷深入,檢測技術日趨成熟,獲取信息日益豐富,測序成本不斷降低,在不久的將來地貧無創性產前診斷技術有望應用于臨床。