早幼粒細胞白血病蛋白與TAK1結合蛋白相互作用的生物信息學分析與驗證

成佳聰，李智慧，劉 鰩，李 成，黃 鑫，田穎鑫，沈富兵

成都醫學院1檢驗醫學院，2藥學院，四川 成都610500

轉化生長因子活化蛋白激酶1（TAK1）是TLR受體信號通路的一個重要信號蛋白［1,2］。當細菌或病毒感染激活該信號通路時，TAK1結合蛋白（TAB1）與TAK1結合形成復合物能通過促進TAK1自我磷酸化而激活下游的MAPK信號通路和NF-κB信號通路，引發TNF-α、IL-6和IL-8等炎性細胞因子的表達，導致炎癥反應［3,4］。在前期研究α-苦瓜素（α-MMC）的抗炎機制時發現，α-MMC能通過抑制TAK1蛋白而抑制LPS誘導的這種炎癥反應［5］，進一步的蛋白組學分析發現，TAB1蛋白也能被抑制，而早幼粒細胞白血病蛋白（PML）則出現顯著性升高。PML是急性早幼粒細胞白血?。ˋPL）的一種腫瘤抑制蛋白，在生長抑制、誘導細胞凋亡和細胞衰老方面具有關鍵功能［6］，并且PML也具有抗病毒感染功能，在Toll樣受體信號途徑中發揮作用［7］。我們的組學結果提示，α-MMC可能通過激活PML而抑制TAB1，進而抑制了TAK1及其下游的MAPK和NF-κB炎性信號通路。那么，PML是否能跟TAB1發生互作是該信號轉導發生的關鍵環節。經國內外文獻查閱，我們并沒有發現任何關于PML與TAB1蛋白相互作用的報道，因此，本研究擬首先通過生物信息學預測二者是否有相互作用，再通過免疫共沉淀（Co-IP）實驗驗證這種互作關系。由于PML蛋白是近些年的一個研究熱點，PML與TAB1蛋白互作并抑制Toll樣炎性信號通路的發現，有望為探明一條新的抗炎信號通路奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

α-MMC，由四川大學生命科學學院的孟延發教授贈予，使用MacroCap SP和Superdex75柱層析技術，從苦瓜籽中提取純化而得，其蛋白質樣品純度大于95%；佛波酯（PMA）；細菌脂多糖（LPS）；RPMI 1640培養基；Anti-PML和Anti-TAB1（abcam）；ProteinA+G agarose、RIPA lysis buffer、PMSF以及BCA蛋白定量檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；ECL（武漢聚能譯通生物公司）；HRP標記山羊抗兔二抗（武漢三鷹生物技術有限公司）；HRPAffiniPure Mouse Anti-Rabbit IgG（Light Chain）（Abbkine）；人單核細胞THP-1細胞系（中國科學院典型文化保護委員會細胞庫）。

1.2 方法

1.2.1 構建TAB1蛋白模型

1.2.1.1 解析TAB1蛋白一級結構 在PSST-2.0（http://pranag.physics.iisc.ernet.in/psst/）蛋白質數據庫序列搜索工具中檢索出TAB1蛋白一級結構即氨基酸排列順序相關的數據［8］。

1.2.1.2 解析TAB1蛋白二級結構 根據靶標蛋白TAB1蛋白的一級序列，采用第三代測序技術和多重序列比對方法（MSA法），找到高相似蛋白質，并建立同源數據庫；用這些蛋白質中含有的可取代氨基酸信息，使用PSIPRED軟件預測TAB1蛋白二級結構［9,10］。

1.2.1.3 解析TAB1蛋白三級結構 使用Rosetta軟件，采用比較建模的方法，構建完整的包含C-端結構域的TAB1蛋白的三維模型［11,12］；通過序列比對，匹配出對應的模板蛋白。

1.2.2 構建PML蛋白模型 在PDB數據庫中檢索PML蛋白［13］，并對目前已報道在PDB數據庫中的晶體結構進行收集。選取位于PML蛋白RBCC結構域中的晶體結構6IMQ以及5YUF進行三維結構模擬。

1.2.3 蛋白-蛋白對接 利用Zdock3.0.2軟件進行蛋白-蛋白對接。對接前，先設定兩個蛋白的關鍵氨基酸結合位點，設定靶標蛋白TAB1的關鍵氨基酸結合位點位為Y481、V482、F484、F487、Y488、W491、H495；設定配體蛋白PML的關鍵氨基酸結合位點，PDB ID為6IMQ的晶體結構設定K160為作用位，PDB ID為5YUF的晶體結構設定K65為作用位點。每次對接將產生10個對接結果，然后挑選對接能量最好的構象進行結構提取。

1.2.4 極化炎性巨噬細胞（M1型）模型構建及α-MMC處理 培養條件為含有10%熱滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的完全RPMI 1640培養基，在37 ℃的含5%CO2的濕空氣中。將約1×106THP-1細胞接入6孔板中，加入PMA（30 ng/mL）培養72 h，換液徹底洗掉漂浮細胞，加入新鮮培養基培養24 h，再以終濃度為20 ng/mL的LPS加入到以上六孔板培養細胞中，在10%胎牛血清的完全RPMI 1640 培養基培養48 h，誘導其成為極化炎性巨噬細胞（M1型）。用以終濃度為0.5 μg/mL 的α-MMC 分別處理M1 巨噬細胞0、1、2、4 h。之后，每孔加入RIPA裂解液，在冰上裂解30 min并超聲3 min，然后在4 ℃12 000 r/min條件下離心10 min，轉移到新的EP管中待用。

1.2.5 PML與TAB1蛋白免疫印跡分析 使用BCA法測定上清蛋白的濃度，根據裂解液的體積加入5×SDS loading bufer，100 ℃煮沸5 min。蛋白質樣品（20 μg）在10%SDS 聚丙烯酰胺凝膠和5%SDS 濃縮凝膠上分離。將樣品電轉移到PVDF上并用5%milk/TBST封閉。洗滌后，用1%BSA/PBST按推薦的稀釋比稀釋一抗同轉移PVDF放入雜交袋，4 ℃冰箱過夜。使用一抗為兔抗人PML單克隆抗體和兔抗人TAB1單克隆抗體，稀釋比例分別為1∶1000。再后分別將PVDF膜放入用5%milk/PBST稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(H+L)多克隆抗體（1∶5000稀釋）在室溫下置于搖床上孵育1 h。之后采用增效魯米諾試劑和增強型化學發光試劑（ECL）作為顯色底物，使用化學發光凝膠成像儀進行顯色，用兔抗人β-actin抗體作為內參對照。

1.2.6 PML與TAB1蛋白的免疫共沉淀分析（1）樣本處理 取α-MMC 處理4 h 的上清樣本，加入100 μL Protein A+G瓊脂糖珠子，4 ℃旋轉1 h，去除非特異性結合蛋白，留50μL作為input陽性對照組，取2μL測定濃度，其余上清備用；（2）抗體與珠子結合 取3 μg抗體，陰性對照組用相應量的正常IgG，按照抗體說明書稀釋抗體，分別加入100μL Protein A+G瓊脂糖珠子，4 ℃旋轉2 h，然后1000 g，4 ℃離心5 min；（3）免疫印跡分析取細胞裂解液分別加入到偶聯抗體或正常IgG的蛋白A+G瓊脂糖珠子中，4 ℃旋轉過夜，使蛋白與抗體結合；1000 g 4 ℃離心5 min，去除上清；用PBS洗4次，每次1 mL；盡量去除上清，加入100 μL 1×loading buffer煮沸5 min；1000 g離心5 min，取上清作為PML-IP實驗組樣品進行免疫印跡檢測，免疫印跡的操作方法同1.2.5。由于TAB1分子大小與IgG重鏈大小相近，故本實驗檢測TAB1的二抗選用辣根過氧化物酶標記的小鼠抗兔IgG的輕鏈。顯色底物使用增強型魯米諾試劑和氧化試劑。

2 結果

2.1 靶標蛋白TAB1信息

人TAB1蛋白由504個氨基酸組成，蛋白的序列信息見表1，其主要功能是能募集其他蛋白如TAK1蛋白形成復合物。

表1 靶標蛋白的序列信息Tab.1 Sequence information of the target protein

2.1.1 靶標蛋白TAB1的二級結構預測 從TAB1二級結構（圖1）可看出，靶標蛋白TAB1的C-端柔性較大，具有一段α螺旋區特征性序列，即FxxFxxxWxxxH。

圖1 靶標蛋白TAB1的二級結構預測Fig.1 Secondary structure prediction of the target protein TAB1.

2.1.2 靶標蛋白TAB1 的三維空間結構建立 使用Rosetta軟件，共預測出5個候選的三維模型，將這5個候選模型的三維結構與前面預測的二級結構做映射，對比結果發現預測的model2.pdb 三維結構與預測的二級結構大致相符合，TAB1蛋白的三維結構模型如圖2所示。

圖2 TAB1蛋白的三維結構模型Fig.2 Three-dimensional structure model of TAB1 protein.

2.2 配體蛋白PML信息

PML基因位于15號染色體，全長53KB，含有9個外顯子。PML蛋白具有富含半胱氨酸的N末端，即1個環指結構域、2個鋅指樣B盒（B-box）和1個卷曲螺旋結構域構成的“RBCC”結構，是PML發揮功能的關鍵結構區域。PML“RBCC”結構域上的兩個晶體結構6IMQ以及5YUF（圖3）為PML蛋白的120～168位氨基酸和51～96位氨基酸殘基片段，其Resolution值分別為2.06 ?，1.60 ?。

圖3 配體蛋白PML的三維結構模型Fig.3 Three-dimensional structure model of the ligand protein PML.

2.3 蛋白-蛋白對接

2.3.1 配體蛋白PML（6IMQ）與靶標蛋白TAB1的蛋白-蛋白對接 對接能量值前10位的pose分別（表2），其聚類分析（圖4）。

圖4 靶標蛋白TAB1與配體蛋白PML(6IMQ)結合位置聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis of the binding sites of the target protein TAB1 and ligand protein PML(6IMQ).

表2 蛋白-蛋白對接結果的能量值Tab.2 Energy value of the protein-protein docking results

聚類分析顯示，靶標蛋白TAB1（灰色）與配體蛋白PML（不同顏色）在多個位置都有良好的結合，但大多數的結合位于TAB1蛋白的C-端，如pose1-4和pose6-7皆在該位置與TAB1聚合（圖4）。

選取對接能量值最高的pose1對接結果構象進行結構提取用于相互作用分析，其結合模式分析（圖5），相互作用的關鍵氨基酸及作用化學鍵列表（表3）。從圖5和表3中可以看出，配體蛋白PML主要結合在靶標蛋白TAB1的C端，二者間有3個鹽橋、6個氫鍵和6個疏水力相互作用。

圖5 靶標蛋白TAB1與配體蛋白PML(6IMQ)相互作用圖(pose1)Fig.5 Interaction map of the target protein TAB1 and the ligand protein PML(6IMQ)(pose1).

表3 靶標蛋白TAB1與配體蛋白PML(6IMQ)相互作用模式Tab.3 Interaction mode between the target protein TAB1 and the ligand protein PML(6IMQ)

2.3.2 配體蛋白PML（5YUF）與靶標蛋白TAB1的蛋白-蛋白對接 設定5YUF晶體結構的K65為PML的關鍵氨基酸結合位點與TAB1蛋白模型進行蛋白-蛋白對接，選取對接能量值前2位的結合構象（pose1為937.271，pose2為934.068）進行結構模擬作圖，其中，灰色結構部分為TAB1，其他顏色部分為PML（圖6）。

圖6 靶標蛋白TAB1與配體蛋白PML(5YUF)結合位置聚類分析圖Fig.6 Cluster analysis of the binding sites of the target protein TAB1 and the ligand protein PML(5YUF).

選取對接能量值最高的pose1對接結果構象進行結構提取用于相互作用分析，其結合模式分析（圖7），相互作用的關鍵氨基酸及作用化學鍵列表（表4）。從圖7和表4中可以看出，配體蛋白PML主要結合在靶標蛋白TAB1的C端，二者間形成了1個氫鍵、3個靜電和9個疏水相互作用。

圖7 靶標蛋白TAB1與配體蛋白PML(5YUF)相互作用圖(pose1)Fig.7 Interaction between the target protein TAB1 and the ligand protein PML(5YUF)(pose1).

表4 靶標蛋白TAB1與配體蛋白PML(5YUF)相互作用模式Tab.4 Interaction mode between the target protein TAB1 and the ligand protein PML(5YUF)

2.4 PML與TAB1蛋白免疫印跡分析

PML蛋白與TAB1蛋白的免疫印跡檢測結果顯示，隨著α-MMC處理時間的延長，PML蛋白的濃度逐漸增強，而TAB1蛋白濃度有減弱趨勢，在α-MMC處理4 h時表現明顯（圖8）。

圖8 PML蛋白與TAB1蛋白的免疫印跡檢測結果Fig.8 Western blotting of PML protein and TAB1 protein in α-MMC-treated M1 inflammatory macrophages.

2.5 免疫共沉淀實驗驗證

PML蛋白與TAB1蛋白的免疫共沉淀WB檢測結果顯示，當使用抗PML作為檢測抗體時，在PML-input組和IgG組相應的蛋白相對分子質量處有單一深染的條帶，PML-IP組則顯示兩條濃密的條帶，分別與input組和IgG組形成的條帶齊平（圖9A）；當使用抗TAB1作為檢測抗體時，PML-IP組也顯示出兩條濃密的條帶，分別與TAB1-input 組和IgG（輕鏈）組形成的條帶齊平（圖9B）。分別選取圖9A和圖9B的相應條帶進行免疫共沉淀的Co-IP拼圖，顯示出PML蛋白與TAB1蛋白有良好的共沉淀效果（圖9C）。

圖9 PML蛋白與TAB1蛋白的免疫共沉淀檢測結果Fig.9 Immunoprecipitation results of PMLprotein and TAB1 protein in α-MMC-treated M1 inflammatory macrophages.

3 討論

α-MMC是來自于苦瓜的天然藥物，具有抗腫瘤、抗病毒和免疫調節等多種藥理效應［14,15］。我們的研究也發現，α-MMC能通過抑制TLR4受體信號通路的TAK1信號蛋白而抑制下游的NF-κB和MAPK炎性信號通路，從而抑制LPS誘導的炎性細胞因子風暴和炎癥［7］。在深入探討α-MMC抑制TAK1蛋白發生機制時發現，α-MMC 能顯著升高PML 蛋白，同時TAK1 結合蛋白TAB1也被顯著抑制。PML是在細胞生命過程中發揮多種重要功能的蛋白，包括腫瘤抑制、轉錄調節、細胞凋亡和衰老、DNA損傷反應和病毒防御等［16-18］。PML蛋白也能參與信號轉導，在TGF-β受體信號通路中，細胞質PML能介導SARA蛋白與Smad2/3之間的信號［19,20］。因此，推測PML 蛋白也可能為α-MMC 抑制TAB1/TAK1的中間信號轉導蛋白。本研究通過生物信息學模擬，觀察到了PML蛋白與TAB1的互作，并經過經典的免疫共沉淀實驗驗證，實驗結果證實了以上設想。

生物信息學模擬實驗中，通過使用Rostta軟件，采用比較建模的方法，構建完整的包含C-端結構域的TAB1蛋白三維模型［21］，又通過檢索PDB數據庫獲取PML蛋白信息，并解析其晶體結構和三維結構，然后使用Zdock3.0.2軟件對PML與TAB1進行了蛋白-蛋白分子對接模擬，并提取最佳構象進行分子對接的結構分析。結果顯示，兩個蛋白之間分別形成了3個鹽橋、5個氫鍵和6個疏水相互作用力（以PML的6IMQ為對接部位）以及1個氫鍵、3個靜電相互作用力和9個疏水作用力（以PML的5YUF為對接部位），兩種對接模式皆顯示出了良好的分子對接和強力的相互作用。Rosetta軟件是目前流行的結構分析軟件［22］，其原理是依據于X射線晶體結構數據，以基于貝葉斯概率理論的能量函數，進行生物分子構象相關的能量分析，從而識別和分析生物分子模型的特征。而Zdock3.0.2蛋白-蛋白對接軟件原理是基于快速傅里葉轉化相關性技術的剛性蛋白對接算法，用來搜索兩種蛋白質之間通過平移和旋轉而得到的空間中所有可能的相互結合模式，并使用能量評分函數評估每個結合模型［23］。

在成功預測PML與TAB1的蛋白互作后，我們進行了經典的免疫共沉淀技術驗證實驗。首先使用免疫印跡技術，觀察α-MMC作用后PML蛋白和TAB1蛋白相互作用的有效時間點。結果顯示，在給予α-MMC處理M1炎性巨噬細胞后，PML蛋白的表達隨著給藥時間延長（0、1、2和4 h）而增高，而TAB1蛋白在給藥4 h后出現了明顯的蛋白量下降。因此，選用4 h作用時間點，進行后續的免疫共沉淀實驗。共沉淀后的PML-IP組能檢測到顯著的PML和TAB1互作陽性蛋白條帶，input陽性組和IgG陰性組也都顯示出了良好對照效果。實驗中使用的M1巨噬細胞模型，是以單核細胞THP-1細胞系為原型細胞，通過PMA誘導為巨噬細胞后再使用LPS極化為炎性巨噬細胞［24,25］。

在TGFβR信號通路中，PML介導了SARA蛋白與Smad2/3 之間的信號，PML 發揮的作用是磷酸化Smad2/3蛋白而傳遞激活信號，而我們的實驗結果顯示，PML對TAB1的作用并不是磷酸化激活，而是抑制作用。這種抑制作用的機制尚不清楚，我們推測PML發揮的是可能泛素化連接酶作用。PML蛋白有多種功能，其結構具有1個環指結構域、2個鋅指樣B盒和1個卷曲螺旋結構域，PML的環指結構域具有E3泛素化酶活性，亦即，PML為一種單環指E3泛素化連接酶［26,27］。泛素化修飾引起靶蛋白降解是信號通路中負性調節的常見模式［28,29］。PML是否是通過泛素化修飾TAB1蛋白導致其被降解，有待后續進一步研究。本研究通過生物信息學預測以及實驗驗證，首次揭示了PML與TAB1蛋白的直接相互作用，為探討PML介導的抗炎信號轉導作用奠定了基礎。