杜仲葉不同溶劑萃取物對ACE酶活的抑制作用

王 瀟,李 棟,張立攀

(河南省商業科學研究所有限責任公司,河南 鄭州 450000)

現代藥理學表明杜仲葉降壓效果明顯,有“天然降壓藥”之美譽,但目前關于其降壓機制及作用成分尚不明確,極大地限制了杜仲葉產品的開發,因此針對杜仲葉的活性成分建立簡單、系統、高效的提取、分離方法體系至關重要[1]。系統溶劑萃取法根據化學成分的極性強弱,利用不同溶劑(如石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等)將原料不同組分分離,該方法針對目標成分具有一定的初篩作用,簡單快捷[2]。血管緊張素轉化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)能夠催化血管緊張素Ⅰ水解成血管緊張素Ⅱ,使血管收縮,引起血壓升高,因此通過抑制ACE活性可起到降血壓的目的[3]。

本研究利用超聲法提取杜仲葉總成分,采用系統溶劑法萃取總提取液,分別得到石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物,再針對不同極性部位萃取物開展ACE活性抑制及抗氧化研究,為杜仲葉的資源開發提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1原料與試劑

杜仲葉,河南芳捷農業發展有限公司;無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇,煙臺市雙雙化工有限公司;二氯甲烷,天津市科密歐化學試劑有限公司;蘆丁標準品(純度≥98%)、沒石子酸標準品(純度≥98%),北京索萊寶科技有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、福林酚(1 moL/L)、無水碳酸鈉、對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基(含量>97.0%)、七水合硫酸亞鐵、水楊酸、30%過氧化氫,國藥集團化學試劑有限公司;二甲基亞砜、PBS緩沖液(pH值為6.8,濃度0.01 moL/L)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid,HEPES)、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(N-[3-(2-furylacryloyl)]-L-phenyalanyl-glycyl-glycine,FAPGG)、ACE酶(2.5 Units),上海麥克林生化科技。以上均為分析純。

1.1.2儀器與設備

電子天平,上海衡際科學儀器,FA2004;分液漏斗,容量為500 mL;超聲波清洗器,昆山市超聲儀器,KQ-700DE;旋轉蒸發儀,上海亞榮生化儀器廠,RE-2000A;低溫冷卻液循環泵,鞏義市予華科技,DLSB-10L/20;恒溫水浴鍋,金壇市中大儀器廠,KW-1000DC;雙光束紫外分光光度計,北京普析通用儀器,TU-1901;粉碎機,小熊電器,FSJ-A03E1;Agilent technologies 1290 infinity 高效液相色譜儀,廣州廣電計量檢測股份有限公司;酶標儀,Infinite?200 PRO)。

1.2 方法

1.2.1材料處理

參考文獻方法[4],將杜仲葉洗凈烘干后,粉碎過篩,精確稱取3份樣品,質量5 g。置于250 mL錐形瓶中分別按照1∶10、1∶8、1∶6料液比加入75%乙醇,超聲1 h,合并提取液,過濾,轉至500 mL圓底燒瓶,旋轉蒸發,濃縮至干,加入150 mL純凈水溶解。

1.2.2不同溶劑提取物制備

將上述提取液轉移至500 mL分液漏斗中,加入50 mL石油醚,充分搖勻,將分液漏斗置于鐵架臺上,靜置等待分層,分層后,分離有機溶劑層和水層,重復上述操作2次,合并濾液,用旋轉蒸發儀濃縮至無液體,置于干燥器過夜,記錄空瓶初重和干燥后質量,加入12.1 mL二甲基亞砜,得到濃度為20 g/L的提取液。同理,可制得20 g/L的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水提取液。

1.2.3總黃酮測定

參考文獻方法,采用硝酸鋁絡合分光光度法測定[5]。準確稱量蘆丁標準品16.29 mg,以60%乙醇定容至25 mL,制備0.65 g/L標準液。分別吸取0、0.25、0.50、1.00、1.50 mL標準液加至10 mL容量瓶中,依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL,搖勻靜置6 min,加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL,搖勻靜置6 min,加入10%氫氧化鈉溶液2 mL,最后用60%乙醇定容至刻度線,利用分光光度計,在510 nm波長下,測定吸光值,以蘆丁濃度為橫坐標,以吸光值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.4總多酚測定

總酚含量的測定一般采用福林酚比色法[6]。精確稱量18 mg沒食子酸標準品,用純凈水定容至100 mL容量瓶中,得到0.18 g/L標準液,分別吸取0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL標準液于具塞比色管,依次加入福林酚試劑1 mL,搖勻,加入12 mL12%的碳酸鈉溶液,以純凈水定容至25 mL,在25 ℃下避光保溫2 h,于765 nm波長下測定吸光度,以沒食子酸濃度為橫坐標,以吸光值為縱坐標繪制標注曲線。

1.2.5綠原酸、京尼平苷酸、桃葉珊瑚苷含量的測定

參考張立攀等[7]研究方法,分別精確稱取綠原酸(12.4 mg)、京尼平苷酸(11.3 mg)、桃葉珊瑚苷(12.7 mg)標準品于10 mL棕色容量瓶,加入甲醇溶液定容至刻度線,搖勻,得到綠原酸、京尼平苷酸混合標準液和桃葉珊瑚苷標準液。分別吸取一定體積的標準液制備20、50、100、200、500 mg/L標準液,按照色譜條件上樣檢測,以峰面積為縱坐標,以標準品濃度為橫坐標繪制標準曲線。其參數見表1。

表1 杜仲葉活性成分標準曲線及相關系數

1.2.6DPPH·清除率的測定

參考劉俊澤等[8]研究方法,分別精確移取2g/L的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水提取液2 mL于具塞試管中,加入0.04 g/L DPPH溶液2 mL,搖勻,靜置30 min,利用紫外分光光度法,在517 nm波長下測定吸光值(A樣品),60%乙醇2 mL分別和2 g/L的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水提取液2 mL測定吸光值(A′),以60%乙醇2 mL和0.08 g/L DPPH溶液2 mL作為對照組(A對照),計算公式(1)如下:

(1)

分別移取2 mL濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 g/L的石油醚提取液于具塞試管中,加入0.04 g/L DPPH溶液2 mL,搖勻,靜置30 min,利用紫外分光光度法,在517 nm波長下測定吸光值(A樣品),60%乙醇2 mL分別和濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 g/L的石油醚提取液,測定吸光值(A′),以60%乙醇2 mL和0.04 g/L DPPH溶液2 mL作為對照組(A對照)。同理,可測的不同濃度梯度的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水提取液對DPPH·的清除率。

1.2.7羥基自由基清除能力測定

參考劉存芳等[9]研究方法,在具塞試管中依次加入2 mmol/L硫酸亞鐵溶液2 mL、6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL、2 g/L石油醚提取液2 mL、1 mmol/L過氧化氫溶液2 mL于37 ℃水浴中反應30 min,利用紫外分光光度法,在510 nm波長下測定吸光值Ax;在具塞試管中依次加入2 mmol/L硫酸亞鐵溶液2 mL、6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL、純凈水2 mL,1 mmol/L過氧化氫溶液2 mL,測定吸光值為Ao;在具塞試管中依次加入2 mmol/L 硫酸亞鐵溶液2 mL、6 mmol/L水楊酸-乙醇溶液2 mL、2 g/L的石油醚提取液2 mL、純凈水2 mL,測定吸光值為Axo。計算如下:

(2)

同理,利用上述同樣方法,測定不同濃度梯度的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水提取液對羥基自由基的清除率。

1.2.8ACE抑制率的測定

參照朱啟鵬等[10]研究方法,血管緊張素轉化酶抑制活性的測定方法。對照孔:20 μL ACE+40 μL HEPES+50 μL FAPGG。樣品孔:20 μL ACE+40 μL樣品+50 μL FAPGG。在340 nm波長下,分別測定對照孔和樣品孔的吸光度(a1和b1),酶標板于37 ℃條件下保溫30 min后測定其吸光度(a2和b2),每個樣品平行3個。對照孔的吸光度減少值A=a1-a2,樣品空的吸光度減少值B=b1-b2。樣品ACE抑制率的計算如下:

(3)

2 結果與分析

2.1 標準曲線及相關參數(表1)

由表1可知,所測各活性成分的回歸方程,線性關系良好,R2均在0.99以上。

2.2 不同溶劑萃取物活性成分含量(表2)

黃酮類化合物屬于植物次級代謝產物,廣泛存在于自然界中,具有抑菌、消炎、預防動脈硬化、抗衰老等功能,是抗氧化劑的理想原料。由圖表2可知,不同溶劑提取的杜仲葉總黃酮含量差異性較大(P<0.05),總黃酮含量高低順序依次為正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提取物>石油醚提取物>二氯甲烷提取物。

多酚廣泛存在于自然界中,對減緩心腦血管疾病、糖尿病等發生發展具有預防作用。由表2可知,乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物多酚含量差異性不大(P>0.05),但與其他組之間存在顯著性差異(P<0.05),正丁醇提取物和乙酸乙酯提取物中總多酚濃度均為23.27 g/L,其次為水提取物、石油醚提取物,濃度最低的是二氯甲烷提取物。

由表2可看出,正丁醇提取物綠原酸含量最高,其次為水、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷提取物。不同提取物京尼平苷酸含量具有顯著性差別(P<0.05),正丁醇中京尼平苷酸含量最高,水提取物次之,然后是乙酸乙酯提取物、石油醚提取物。京尼平苷酸具有保肝利膽功效。由于桃葉珊瑚苷含量較低,石油醚提取物中僅能夠檢測到48 mg/L,原因可能與桃葉珊瑚苷自身的不穩定性有關,研究表明,桃葉珊瑚苷性質活潑,比較容易降解。

綜上所述,不同萃取部分的活性成分含量差異性較大,其中正丁醇提取物的黃酮、多酚、綠原酸、京尼平苷酸含量最高,適合作為杜仲葉提取溶劑使用。

2.3 不同溶劑萃取物的DPPH·清除率

大量研究表明,杜仲葉具有良好的自由基清除能力,DPPH·自由基清除率經常被用來反映一種藥用植物提取物的抗氧化活性[11]。杜仲葉不同溶劑萃取物對DPPH·自由基的清除作用見表3。

表3 不同溶劑萃取物對DPPH·自由基清除率 %

由表3可知,不同溶劑提取杜仲葉提取物均能夠有效清除DPPH·自由基,不同溶劑提取物按照清除率大小順序依次為:正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>二氯甲烷提取物>水提取物。

不同溶劑提取物對DPPH·自由基的清除能力見圖1。

圖1 不同溶劑提取物對DPPH·自由基的清除能力

利用origin 2019b軟件中的DoseResp模型對測定值進行非線性擬合,擬合效果良好,石油醚提取物、二氯甲烷提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物對DPPH·均有良好的清除效果,其EC50分別為0.870、5.080、0.180、0.138 g/L,水提取物的清除率較低,故沒有相應的EC50,一般EC50越小代表清除能力越強,因此根據EC50大小可知其清除DPPH·能力強弱為:正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物>二氯甲烷提取物>水提取物。

2.4 不同溶劑萃取物的羥基自由基清除率

不同溶劑提取杜仲葉對羥基自由基的清除作用見表4。

表4 不同溶劑萃取物的羥基自由基清除率 %

由表4可知,杜仲葉不同溶劑提取物均能夠有效清除羥基自由基,二氯甲烷提取物清除率最高,其次為水提取物、石油醚提取物、正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物。不同溶劑提取物對羥基自由基的清除能力見圖2。

圖2 不同溶劑提取物對羥基自由基的清除能力

由圖2可知,利用origin 2019b軟件中的DoseResp模型對測定值進行非線性擬合,擬合效果良好。二氯甲烷提取物、水提取物、石油醚提取物、正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物對羥基自由基的清除效果良好,其EC50分別為1.727、2.022、2.326、6.035、6.377 g/L。根據EC50大小可知其清除羥基自由基清除能力強弱為:二氯甲烷提取物>水提取物>石油醚提取物>正丁醇提取物>乙酸乙酯提取物。

2.5 不同溶劑萃取物血管緊張素轉化酶的抑制能力

不同溶劑萃取物對ACE的抑制率見表5。

表5 不同溶劑萃取物對ACE的抑制率 %

由表5可知,不同溶劑提取物對ACE的抑制能力有明顯差異(P<0.05),乙酸乙酯提取物的ACE抑制率最高,其次為正丁醇,二氯甲烷,石油醚和水提取物的抑制能力較差。利用origin 2019b軟件中的DoseResp模型對測定值進行非線性擬合,見圖3。整體來看,隨不同提取物濃度的增大對ACE的抑制率均呈增加趨勢,說明抑制率對濃度有一定的依賴性。根據EC50大小可知,不同提取物對ACE的抑制能力大小順序為:乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>二氯甲烷提取物>石油醚提取物。

圖3 不同溶劑提取物對ACE的抑制率

2.6 相關性分析

相關分析見圖4。杜仲葉不同溶劑萃取物中黃酮、多酚、綠原酸、京尼平苷酸含量與DPPH 自由基清除率、ACE抑制率之間均存在正相關性,黃酮、綠原酸、京尼平苷酸含量與羥自由基清除率之間為正相關,這與目前的研究較一致,黃酮、多酚一致被認為是抗氧化活性的經典物質[12]。ACE抑制率與DPPH 自由基清除率、羥自由基清除率之間為正相關,相關系數分別為0.87、0.15;綜上所述,黃酮、多酚、綠原酸、京尼平苷酸可能是抗氧化的物質基礎,ACE活性抑制與抗氧化能力之間有一定關聯。

圖4 相關性分析

3 結論

杜仲葉不同溶劑(石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水)提取物中活性成分含量差異性較大(P<0.05),其中正丁醇提取物黃酮、多酚、綠原酸、京尼平苷酸含量均為最高,桃葉珊瑚苷穩定性較差,除石油醚提取物外,其余幾種提取物中含量均為0?？寡趸芯勘砻?正丁醇提取物對DPPH的清除能力最強為76.55%,二氯甲烷提取物對羥基自由基的清除能力最強為48.9%,乙酸乙酯提取物對ACE抑制效果最佳為71.7%。相關性分析顯示黃酮、多酚、綠原酸、京尼平苷酸與DPPH·清除率、ACE抑制率之間存在正相關,可能是杜仲葉發揮作用的物質基礎,ACE抑制活性與抗氧化活性之間有一定關系,需要進一步研究驗證。杜仲葉作為傳統中藥材,至今仍具有巨大的研發價值。因此,杜仲葉的正丁醇提取物、乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物可作為追蹤的重要部位,其藥理作用和具體機制有待進一步研究,為深入探索杜仲葉提取物化學成分有效活性的研究提供了理論依據。