飼料中添加有機酸復合物對凡納濱對蝦生長、營養物質利用、血清生化指標和腸道微生物的影響

柯虹瑜，王瑗瑗，張 鑫，姚文祥，李小勤，冷向軍，2，3

(1.上海海洋大學，水產科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學，農業農村部魚類營養與環境生態研究中心，上海 201306；3.上海海洋大學，水產動物遺傳育種中心上海市協同創新中心，上海 201306)

凡納濱對蝦(Litopenaeusvannamei)是世界范圍內最為重要的對蝦養殖品種，也是我國養殖產量最高的對蝦品種。2021年，我國凡納濱對蝦養殖產量達到了197萬噸[1]。高密度集約化養殖模式下，養殖環境的惡化導致凡納濱對蝦自身免疫力下降，容易誘發各種疾病。為解決以上問題，抗生素被大量使用，由此嚴重影響了水產品質量安全。因此，尋找抗生素的替代品，一直是行業關注的熱點。已有研究表明，有機酸及其鹽類有望成為蝦類養殖中的綠色飼料添加劑[2]。

富馬酸是一種酸性較弱有機酸，長久以來一直被用作食品添加劑。其在畜禽飼料中的應用較多，在水產飼料中應用較少[3]。研究表明，飼料中添加富馬酸可提高非洲鯰(Clariasgariepinus)抗溫和氣單胞菌能力，具有替代抗生素的潛力[3]。三丁酸甘油酯是丁酸的前體物質，其釋放的丁酸具有較強酸性，能有效抑制腸道致病菌的增殖[4]。檸檬酸可平衡腸道菌群，促進對維生素、礦物質的吸收，由此提高動物的生長性能[5]。蘋果酸在機體的三羧酸(TCA)循環代謝過程中發揮著重要作用，有研究表明，飼料中添加蘋果酸能提高真鯛(Pagrusmajor)對磷的利用率[6]。各種有機酸的作用機理可能不完全相同，將其復合后，有可能發揮協同效應，產生更好的作用效果。ROMBENSO等[7]研究發現，復合酸組(丁酸、琥珀酸、富馬酸)斑節對蝦(Penaeusmonodon)的存活率顯著高于單獨添加組(富馬酸)。目前，在凡納濱對蝦上研究報道過的有機酸有檸檬酸[8]、丁酸鈉[2，9]等，但均為單獨添加，尚未見有關富馬酸和三丁酸甘油酯等有機酸聯合添加的研究。

有機酸直接添加到飼料中，會造成損失，減弱作用效果。使用微囊化技術處理有機酸，是有機酸應用的一個發展趨勢。因此，本實驗以凡納濱對蝦為研究對象，在飼料中添加不同水平的微囊化有機酸復合物(organic acids complex，OC，主要成分為富馬酸、三丁酸甘油酯等)，考察對凡納濱對蝦生長性能、營養物質利用率、肝胰腺酶活、血清非特異性免疫酶活性和腸道微生物組成的影響，為有機酸在凡納濱對蝦養殖中的合理應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗設計和實驗飼料

微囊化有機酸復合物由加拿大集富動物營養公司(JefoNu-trition Inc.，Canada)提供，產品顆粒大小為80目，有機酸含量為50%，包括富馬酸(16%)、三丁酸甘油酯(12.5%)和少量山梨酸、蘋果酸、檸檬酸等，包被材料為氫化油脂，占微囊化有機酸復合物的50%。

設置魚粉含量為10%的基礎飼料(對照組)，在此基礎上添加0.05%，0.10%，0.15%的微囊有機酸復合物，制成4組等氮等脂飼料：OC-0，OC-5，OC-10，OC-15組。各飼料添加0.05%的三氧化二釔作為指示劑，用于測定營養物消化率。各飼料原料粉碎后過60目篩，逐級混勻，90 ℃制粒，95 ℃后熟化20 min，晾干至水分約10%，密封保存備用。配方組成及常規營養組成見表1。

表1 實驗飼料配方及營養水平(風干重，%)Tab.1 Ingredients and proximate composition of experimental diets(air dry basis，%)

1.2 實驗蝦與飼養管理

凡納濱對蝦蝦苗購自上海青浦某育苗基地，在水泥池中進行前期暫養，投喂商品飼料(蘇州通威特種飼料有限公司生產，粗蛋白含量≥42%)50 d。正式實驗前24 h停止投餌，挑選大小均勻的健康對蝦1 000尾初始平均體重[(1.0 ±0.1)g]，隨機分配到20口網箱(1.0 m×1.0 m×1.2 m)，置于4口水泥池(5 m×3 m×1.2 m)中，每口水泥池中放置5口網箱，每口網箱50尾蝦。實驗共設置4個處理組，每個處理組5個平行。養殖期間，每日投喂量為蝦體重量的3%～10%(前期投喂高，后期低)，分4次投喂(6：00、12：00、17：00和23：00)。根據對蝦的進食情況和天氣情況及時調整具體投喂量，各網箱投飼量基本一致，并確保飼料在投喂后2小時內被采食完；晝夜充氣，采用虹吸法吸走網箱底部糞便，養殖前期每周吸污一次，換水1/3，所用水源為沉淀后池塘水。實驗期間，水溫27～32 ℃、鹽度0.5‰～1.0‰，溶氧≥5.6 mg/L，pH2)1 kg礦物質預混料含鉀200.00 g、鎂58.200 g、銅3.550 g、鋅5.400 g、錳1.950 g、鈷0.198 g、硒0.040 g、碘0.248 g。

值7.8～8.5，氨氮≤0.2 mg/L，亞硝酸鹽≤0.05 mg/L。飼養實驗共持續56 d。于上海海洋大學濱海養殖基地進行。

1.3 糞便收集

養殖實驗結束前一周，于每次投喂2 h后收集網箱底部包膜完整的糞便，105 ℃干燥，密封存放于-20 ℃冰箱中，以進行營養物質表觀消化率的測定分析。

1.4 樣品采集

養殖實驗開始前，隨機取60尾蝦保存于-20 ℃冰箱，用于初始常規成分測定。養殖實驗結束后，實驗蝦進行24 h饑餓處理，計數并稱量總重；每網箱隨機取13尾蝦并于靜脈竇處取血淋巴，離心(5 000 r/min，10 min)，取血清保存備用。每網箱取4尾對蝦于-20 ℃保存，用于全蝦常規成分分析。另取9尾對蝦進行肝胰腺采樣，每3個肝胰腺匯集為1個樣本，-80 ℃保存，用于消化酶活性測定。另根據生長性能，選對照組和OC-10組，每網箱取3尾已抽血對蝦，將全腸(未沖洗)匯集成一個樣本，用作腸道微生物組成分析。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 生長性能

生長性能指標，包括存活率(SR)、增重率(WGR)、飼料系數(FCR)、蛋白質沉積率、脂肪沉積率，計算如下：

SR=終末尾數(尾)/初始尾數(尾)×100%

WGR=[終末體質量(g)-初始體質量(g)]/初始體質量(g)

FCR=攝入飼料量(g)/[終末體質量(g)-初始體質量(g)]

蛋白質沉積率=全蝦蛋白增加量(g)/總蛋白攝入量(g)×100%

脂肪沉積率=全蝦脂肪增加量(g)/總脂肪攝入量(g)×100%

1.5.2 全蝦和飼料的常規成分

飼料、全蝦和糞便常規分析采用國際標準方法(AOAC，2005)。水分含量通過烘箱在105 ℃下烘干至恒重測定；在測量水分含量之后，收集干燥的飼料、全蝦樣品，將其研磨成粉末，以測定粗蛋白，粗脂肪和灰分含量。粗蛋白質含量采用自動凱氏定氮儀(2300-Auto-analyzer，Foss Tecator，Sweden)測定；粗脂肪含量采用氯仿-甲醇法測定；粗灰分含量是將樣品碳化后放置550 ℃馬福爐中灼燒6 h后測得。

1.5.3 營養物質利用率

飼料和糞便中釔元素的含量采用等離子原子發射光譜法(VistaMPX，Varian Alo Alto，California，American)進行測定。

干物質表觀消化率、蛋白質表觀消化率、脂肪表觀消化率、磷表觀消化率，計算公式如下：

飼料干物質的表觀消化率=(1-飼料中Y2O3含量/糞便中Y2O3含量)×100%

各營養成分的表觀消化率=[1-(糞便中某營養成分含量/飼料中某營養成分含量)×(飼料中Cr2O3含量/糞便中Cr2O3含量)]×100%

1.5.4 消化酶活力

蛋白酶：稱取蝦肝胰腺組織，加入9倍預冷生理鹽水，在4 ℃條件下勻漿，離心15 min(3 000 r/min)。取上清液用福林-酚試劑法測定酶活力。

淀粉酶：取0.1 g肝胰腺組織，加入9倍預冷生理鹽水，剪碎后加入鋼珠，于組織研磨儀進行研磨，冷凍離心(4 ℃，3 000 r/min，10 min)，取上清液測酶活力。

酶活力定義如下：

淀粉酶(U/gprot)：底物與1×10-3g蛋白在37 ℃下反應30 min，酶活單位以水解的0.01 g淀粉為1單位。

蛋白酶(U/mgprot)：以2%酪蛋白溶液為底物，每1×10-3mg組織蛋白在pH 7.2，37 ℃條件下，每分鐘分解酪蛋白生成10-3mg酪氨酸的濃度。

1.5.5 血清生化指標

血清生化指標：采用2，4-二硝基苯肼法測定谷草轉氨酶活性(GOT，U/L)，谷丙轉氨酶活性(AST，U/L)測定采用賴氏比色法，超氧化物歧化酶(SOD，U/mL)活性和堿性磷酸酶(AKP，金氏單位/100 mL)活性分別采用黃嘌呤氧化酶法和對硝基苯磷酸鹽法測定。所有指標均采用南京建成生物工程研究所生產試劑盒測定。

1.5.6 腸道微生物

腸道微生物由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行分析測定。采用16S rDNA基因V3、V4高變區特異性引物338F(ACTCCTACGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對細菌基因組DNA進行擴增，通過Illumina MiSeq platform(Illumina)平臺對腸道菌群進行高通量測序，原始數據經處理得到優化序列，對獲得的不同相似度水平序列，以97%的相似水平對OUT進行劃分。在Majorbio Cloud Platform(www.majorbio.com)基于OTU進行alpha多樣性使用UPARSE(V7.1)分析菌群豐度(Chao 指數)和菌群多樣性(Shannon指數、Simpson指數)。不同分類的鑒定結果以OUT注釋為基準進行劃分，統計分析。

1.6 數據分析

數據以均值±標準差(mean±SD)表示。采用SPSS25.0統計軟件統計分析。所有數據均采用單因素方差分析(ANOVA)，用Tukey氏法對數據進行多重比較(腸道微生物采用Majorbio Cloud Platform的T檢驗)。當P<0.05時，認為平均值有顯著差異。

2 結果

2.1 生長性能

由表2可知，飼料中添加了有機酸復合物后，OC-10和OC-15組的WGR較對照組提高了18.7%和17.9%，FCR降低了16.1%和18.5%。各組蛋白質沉積率、脂肪沉積率、SR無顯著差異。

表2 飼料中添加有機酸復合物對凡納濱對蝦生長性能的影響Tab.2 Effect of organic acids complex supplementation on growth performance of L.vannamei

2.2 全蝦體成分

由表3可知，各組對蝦全蝦水分、粗灰分含量與對照組相比均無顯著性差異。飼料中添加OC后顯著降低了全蝦粗脂肪含量。OC-5和OC-10組粗蛋白較對照組顯著提高。

表3 飼料中添加有機酸復合物對凡納濱對蝦體成分的影響(濕重)Tab.3 Effect of organic acids complex supplementation on body composition of L.vannamei(wet weight) %

2.3 營養物質利用率

由表4可知，在飼料中添加有機酸復合物對凡納濱對蝦的干物質消化率、蛋白質消化率、脂肪消化率和磷消化率無顯著影響。

表4 飼料中添加有機酸復合物對凡納濱對蝦營養物質利用率的影響Tab.4 Effect of organic acids complex supplementation on nutrient utilization of L.vannamei %

2.4 肝胰腺消化酶

由圖1可知，飼料中添加0.05%～0.15%有機酸復合物，均顯著提高了對蝦肝胰腺淀粉酶活性，但對肝胰腺蛋白酶活性無顯著影響(圖2)。

圖1 飼料中添加有機酸復合物對凡納濱對蝦肝胰腺淀粉酶的影響Fig.1 Effect of dietary organic acids complex on amylase activity in hepatopancreas of L.vannamei

圖2 飼料中添加有機酸復合物對凡納濱對蝦肝胰腺蛋白酶的影響Fig.2 Effect of dietary organic acids complex on protease activity in hepatopancreas of L.vannamei

2.5 血清生化指標

由表5可知，各有機酸復合物添加組超氧化物歧化酶均較對照組顯著提高，各組堿性磷酸酶、谷草轉氨酶、血清谷丙轉氨酶無顯著差異。

表5 飼料中添加有機酸復合物對凡納濱對蝦血清生化指標的影響Tab.5 Effect of organic acids complex supplementation on serum biochemical parameters of L.vannamei

2.6 腸道微生物

由表6可知，OC-0組和OC-10組物種覆蓋率接近1，說明已經將群落菌體充分采樣。數據可以代表細菌種群。OC-10組的Chao指數在數值上高于OC-0組。

表6 飼料中添加有機酸復合物后凡納濱對蝦腸道微生物多樣性指數Tab.6 Diversity index of intestinal microbial of L.vannamei fed diets with organic acids complex supplementation

OTU的韋恩圖如圖3所示，OC-0組和OC-10組共有OUT數目為819個，OC-0組和OC-10組各特有OUT數目為250個和86個。

圖3 OTUs的韋恩圖Fig.3 Venn diagram of OTUs

由圖4知，OC-0組和OC-10組在門水平上主要有變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、厚壁菌門(Firmicutes)和綠彎菌門(Chloroflexi)、藍藻菌門(Cyanobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)。其中，變形菌門、放線菌門、厚壁菌門是OC-0組的優勢菌門，分別占細菌總數的53.54%，15.94%，10.67%。OC-10組的優勢菌門有變形菌門，占細菌總數的53.79%，以及放線菌門(19.97%)和綠彎菌門(7.81%)。放線菌門在兩組中占比存在數值上的差異(圖4，圖5，表7)。

圖4 飼料中添加有機酸復合物后凡納濱對蝦腸道菌群的門水平豐度Fig.4 Community abundance of intestinal microbiota at phylum level of L.vannamei fed diets with organic acids complex supplementation

圖5 凡納濱對蝦腸道微生物門水平上的差異檢驗Fig.5 The difference test of intestinal microbiota of L.vannamei at phylum level

表7 凡納濱對蝦腸道菌群中主要菌門的占比Tab.7 The proportions of major intestinal flora of L.vannamei at phylum level %

在屬水平上，芽殖桿菌屬(Gemmobacter)是主要腸道微生物，占OC-0組16.34%，占OC-10組17.73%。此外，OC-0組的優勢菌還有Arthrospira_PCC-7345(4.58%)，而分枝桿菌屬(Mycobacterium)是OC-10的優勢菌。其中，OC-10組的分枝桿菌屬較OC-0組顯著增加(圖6，圖7，表8)。

圖6 飼料中添加有機酸復合物后凡納濱對蝦腸道菌群的屬水平豐度Fig.6 Community abundance of intestinal microbiota at genus level of L.vannamei fed diets with organic acids complex supplementation

圖7 凡納濱對蝦腸道微生物屬水平上的差異檢驗Fig.7 The difference test of the intestinal microbiota of L.vannamei at genus level

表8 凡納濱對蝦腸道菌群中主要菌屬的占比Tab.8 The proportions of major intestinal flora of L.vannamei at genus level %

3 討論

3.1 OC對凡納濱對蝦生長性能和體成分的影響

有機酸在飼料中的添加，能夠起到促進水產動物生長的作用[10]。研究表明，在飼料中補充0.2%檸檬酸，顯著提高了凡納濱對蝦增重率，降低了飼料系數[6]。唐啟峰等[4]研究發現，飼喂含有三丁酸甘油酯的飼料后，凡納濱對蝦的周增重和蛋白質效率顯著提高，餌料系數顯著降低。本實驗中，飼料中添加0.1%和0.15%有機酸復合物后，顯著提高了蝦體增重率，降低了飼料系數(P<0.05)。有機酸對生長性能的改善，可能與促進腸道有益菌的增長，促進其消化吸收有關[10]。此外，在含12%魚粉的飼料中添加0.3%丙酸鈉和富馬酸，對凡納濱對蝦生長性能無顯著影響[9]。不同的研究結果，可能與有機酸組成和基礎配方不同有關。

在全蝦體成分方面，OC的添加降低了粗脂肪含量(P<0.05)，OC-5和OC-10組的粗蛋白含量顯著增加(P<0.05)。粗蛋白含量的提高可能是由于有機酸復合物的添加降低了腸道內的pH值，使食物排空減慢，蛋白質在肝胰腺內停留時間延長導致[11]。在斑節對蝦飼料中添加1%富馬酸，對幼蝦粗脂肪含量并無顯著影響[7]；在飼料中添加檸檬酸，對凡納濱對蝦體成分也無顯著影響[8]。XU等[12]研究表明，丁酸可通過降低脂質合成相關基因的表達水平降低大黃魚(Larimichthyscrocea)體脂含量。本實驗中，全蝦粗脂肪含量的降低，可能與OC促進了脂肪代謝有關，這有待進一步研究。

3.2 OC對凡納濱對蝦消化能力的影響

研究表明，在攝食了含有機酸的飼料后，水產動物的營養物質消化利用率會得到提高，這與有機酸種類和養殖對象密切相關[13]。WING等[14]發現，斑節對蝦攝食了添加2%有機酸復合物(含甲酸、乳酸、蘋果酸和檸檬酸)的飼料后，蛋白質消化率、干物質消化率、磷消化率均顯著提高(P<0.05)。消化率的提高，可能與刺激了消化腺的分泌有關。然而，在建鯉飼料中添加0.25%的蘋果酸、富馬酸和丁酸鈉，僅提高了干物質和粗蛋白消化率(P>0.05)[15]。本實驗中，在飼料中添加有機酸復合物對凡納濱對蝦的干物質消化率、蛋白質消化率、脂肪消化率和磷消化率均無顯著影響(P>0.05)。不同的作用結果，可能與有機酸與養殖對象種類有關。

凡納濱對蝦肝胰腺中消化營養物質的關鍵酶有蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶。在飼料中添加OC后，凡納濱對蝦的淀粉酶活力顯著提高。這與翟秋玲等[16]的結果一致。在菊黃東方鲀(Takifuguflavidus)[16]飼料中添加三丁酸甘油酯使回腸的脂肪酶活力、空腸和回腸胰蛋白酶活力以及腸道淀粉酶活力得到提高。在草魚(Ctenopharyngodonidella)飼料中添加復合酸后，淀粉酶活力顯著提高[17]。本實驗中凡納濱對蝦的蛋白酶活性與對照組相比無顯著差異，但在數值上出現了下降。甲殼動物胰蛋白酶的最適pH環境為7～9，攝入的酸過多可能會影響凡納濱對蝦肝胰腺內環境[11]。

3.3 OC對凡納濱對蝦血清生化指標的影響

凡納濱對蝦無特異性免疫系統，非特異免疫系統是其抵御病害的重要系統，肝胰腺是凡納濱對蝦極其重要的器官。為探究復合酸是否對肝胰腺產生作用，選取谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)來評價凡納濱對蝦肝胰腺健康程度。在無刺激環境下，轉氨酶活性較低，心臟和肝臟組織細胞受到損傷，或者天氣變化較大，血清轉氨酶活性升高[18]。在對草魚的研究中，程卓[19]發現三丁酸甘油酯并未影響谷丙轉氨酶和谷草轉氨酶活性。本實驗中，各有機酸復合物添加組的AST、ALT與對照組相比無顯著差異，表明OC并未對凡納濱對蝦肝胰腺產生不利影響。

3.4 OC對凡納濱對蝦腸道微生物的影響

本實驗中，添加有機酸復合物后，OC-10組的Chao指數得到提高，表明菌群豐度提高，OC改變了腸道菌群組成[23]。已有研究證明，菌群多樣性在維持生態功能方面有重要作用，提高菌群多樣性可以提高菌群穩定性，減少機體患病風險[24]。門水平上，變形菌門(Proteobacteria)是凡納濱對蝦腸道中發現的核心細菌類群[25]，厚壁菌門(Firmicutes)在草魚腸道中占主導地位[26]。本實驗中凡納濱對蝦腸道微生物菌群主要有變形菌門、厚壁菌門、放線菌門等，與吳金鳳等[27]的研究結果相似?？梢?，保守性是凡納濱對蝦腸道微生物菌群組成的特點之一。厚壁菌門中產丁酸細菌可以產生短鏈脂肪酸，宿主可以利用這些脂肪酸促進腸粘膜的健康[28]。本實驗中，變形菌門在菌門中占比明顯高于厚壁菌門，LI等[25]在凡納濱對蝦中也有相似發現，這可能是由于兩種細菌的生理功能差異以及其他影響因素，如飲食和棲息地。另外，本實驗中，擬桿菌門也是OC-0組和OC-10組的優勢菌群之一。當機體失衡時，擬桿菌門可能會成為致病菌[29]，當機體維持正常時，則是凡納濱對蝦腸道菌群中的優勢菌，能夠從許多方面影響機體健康。