心肌超聲造影心動圖聯合斑點追蹤成像評價2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯對砷中毒大鼠心臟保護作用

馮 佳,田芮萌,蘆桂林,秦文娟*

(1.德陽市人民醫院超聲醫學科,四川 德陽 816000;2.石河子大學第一附屬醫院超聲醫學科,新疆 石河子 832008)

三氧化二砷(arsenic trioxide, ATO)常用于治療急性早幼粒細胞白血病,且對部分實體腫瘤亦具有較佳療效[1];但心臟毒性較重,可破壞心肌細胞鈣穩態致心肌細胞興奮-收縮耦聯紊亂而影響心功能,臨床可表現為完全性房室傳導阻滯、急性心力衰竭、心室顫動等甚至死亡[2-3]。2-氨基乙氧基二苯基硼酸酯(2-aminoethoxydiphenyl borate, 2-APB)對維持心肌細胞鈣穩態具有重要作用,可減輕ATO心肌損傷[4]。心肌超聲造影心動圖(myocardial contrast echocardiography, MCE)可無創評估心肌血流灌注,是監測心肌微循環的最佳方法之一[5]。斑點追蹤成像(speckle tracking imaging, STI)可追蹤心肌組織在二維超聲圖像中的位置以獲取反映心肌組織運動力學特征參數[6]。本研究觀察MCE聯合STI評價2-APB對砷中毒大鼠心臟保護作用的價值。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12周齡無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級SD雄性大鼠40只,由山東省實驗動物中心提供(生產許可證號:SCXK-2020-0005)。本實驗獲石河子大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會批準(A2021-060-01)。

1.2 主要儀器及試劑 ATO(雙鷺藥業股份有限公司);2-APB(Sigma公司);乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、谷草轉氨酶(glutamic-oxaloacetic transaminase, GOT)、肌酸激酶(creatine kinase, CK)、心肌肌漿網Ca2+-ATP酶(sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase, SERCA)試劑盒,南京建成生物工程研究所有限公司;EPIQ 7C超聲診斷儀(Philips公司);聲諾維(Bracco公司);CHK光學倒置顯微鏡(Olympus公司)。

1.3 造模及干預 將40只大鼠隨機分為ATO中毒后低劑量2-APB干預組(2-APBL組)、ATO中毒后高劑量2-APB干預組(2-APBH組)、單純ATO中毒組(ATO組)、單純2-APB干預組(2-APB組)及對照組,每組8只。對2-APBL組、2-APBH組和ATO組大鼠經腹腔注射ATO 5 mg/kg體質量,對2-APB組和對照組注射生理鹽水,每日1次,共10日;之后分別按2、4和4 mg/kg體質量對2-APBL組、2-APBH組和2-APB組大鼠腹腔注射2-APB,對ATO組及對照組注射生理鹽水,隔日1次,共21日。期間以標準飼料飼養大鼠于石河子大學動物房[12 h光-暗循環,濕度40%～60%,溫度(23±2)℃]。

1.4 超聲心動圖檢查 麻醉大鼠后以左側臥位將其保定于檢查床上,同步連接心電圖,將12S探頭(頻率12 MHz,120～200幀/s)置于胸骨左緣,獲取乳頭肌水平左心室短軸切面二維動態圖像(>5個心動周期),記錄室間隔舒張末期厚度(interventricular septal thickness at end-diastole, IVSD)、左心室舒張末期內徑(left ventricular end-diastolic dimension, LVIDD)、左心室后壁舒張末期厚度(left ventricular posterior wall thickness at end-diastolic, LVPWD)、室間隔收縮末期厚度(interventricular septal thickness at end-systolic, IVSS)、左心室收縮末期內徑(left ventricular end-systolic dimension, LVIDs)、左心室后壁收縮末期厚度(left ventricular posterior wall thickness at end-systolic, LVPWS)、左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening, LVFS)及左心室射血分數(left ventricular ejection fraction, LVEF);將圖像導入QLab12.0軟件進行脫機分析,選擇清晰顯示心內膜的乳頭肌水平左心室短軸切面圖像,軟件自動將左心室心肌分為心內膜層、中層和心外膜層,并分別計算各層心肌整體圓周應變(global circumferential strain, GCS)峰值。對以上參數均測量3次,取平均值。

將頻率3～12 MHz L12-3探頭置于大鼠胸骨左緣,設機械指數0.1、深度3～4 cm,顯示左心室短軸乳頭肌層面后選擇造影模式,經大隱靜脈快速注入造影劑0.4 ml/kg體質量并跟注0.2 ml生理鹽水獲得造影圖像,并將其導入QLab12.0軟件進行脫機分析;將面積1.5 mm2的矩形ROI置于前間隔心肌組織,獲得時間-強度曲線(time-intensity curve, TIC),排除擬合度<0.9者,獲得達峰時間(time to peak, TTP)、峰值信號強度(peak intensity, PI)、曲線上升斜率(wash in slope, WIS)及曲線下面積(area under the curve, AUC),均測量3次后取平均值。

1.5 檢測血清心肌損傷標志物及SERCA 于超聲檢查后取下腔靜脈血2 ml,4℃條件下離心10 min (3 500 r/min)后取上層血清置于-80℃冰箱中;按試劑盒要求測定LDH、AST、CK和SERCA活性,均測量3次后取平均值。

1.6 病理學檢查 以脊椎脫臼方式處死大鼠,完整剝離心臟并行HE染色,于光鏡下觀察心肌細胞形態。

1.7 統計學分析 采用SPSS 22.0統計分析軟件。以±s表示服從正態分布的計量資料,采用F檢驗及LSD-t檢驗(方差齊)或Welch近似F檢驗及Tamhane'sT2法(方差不齊)進行多組間及2組間比較。行Pearson相關性分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 2-APBL組和2-APBH組大鼠精神狀態尚可,反應尚靈敏,活動、進食、飲水稍減少,毛發略發黃;ATO組大鼠反應遲緩,精神狀態差,活動、進食、飲水明顯減少,毛發發黃,部分出現腹瀉;而2-APB組和對照組大鼠反應靈敏,活動自由,進食、飲水均正常,毛發光澤。

5組心率和矯正QT間期(corrected QT interval, QTc)差異均有統計學意義(P均<0.05);相比對照組,2-APBL組、2-APBH組和ATO組心率加快、QTc延長(P均<0.05);相比ATO組,2-APBL組和2-APBH組心率減慢、QTc縮短(P均<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠基本情況比較(n=8)

2.2 超聲心動圖

2.2.1 M型常規超聲心動圖 5組LVFS和LVEF差異均有統計學意義(P均<0.05);相比對照組和2-APB組,2-APBL組、2-APBH組和ATO組LVFS、LVEF均降低(P均<0.05);相比ATO組,2-APBL組和2-APBH組LVFS、LVEF均增加(P均<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠M型超聲心動圖參數比較(n=8)

2.2.2 MCE 除TTP外,5組大鼠MCE參數差異均有統計學意義(P均<0.05);相比對照組和2-APB組,2-APBL組、2-APBH組及ATO組WIS、PI、WIS×PI及AUC均下降(P均<0.05);相比ATO組,2-APBL組和2-APBH組WIS、PI、WIS×PI及AUC均上升(P均<0.05),2-APBH組上升幅度更大(P均<0.05)。見表3和圖1。

圖1 大鼠前間隔心肌MCE A.2-APBL組; B.2-APBH組; C.ATO組; D.2-APB組; E.對照組

表3 5組大鼠前間隔心肌MCE參數比較(n=8)

2.2.3 STI 5組均表現為心內膜下心肌GCS(GCS of endo-myocardium, GCSendo)>中層心肌GCS(GCS of mid-myocardium, GCSmid)>心外膜下心肌GCS(GCS of epi-myocardium, GCSepi)(P均<0.05)。5組間GCS差異均有統計學意義(P均<0.05);相比對照組和2-APB組,2-APBL組、2-APBH組和ATO組GCS均降低(P均<0.05);相比ATO組,2-APBL組GCSendo、2-APBH組GCSendo及GCSmid均升高(P均<0.05);相比2-APBL組,2-APBH組GCSendo、GCSmid均升高(P均<0.05)。見表4和圖2。

圖2 大鼠左心室GCS-endo超聲圖像 A.2-APBL組; B.2-APBH組; C.ATO組; D.2-APB組; E.對照組

表4 5組大鼠左心室心肌GCS比較(n=8)

2.3 血清心肌損傷標志物及SERCA水平 5組GOT、CK、LDH及SERCA差異均有統計學意義(P均<0.05);相比對照組和2-APB組,2-APBL組、2-APBH組及ATO組GOT、CK、LDH增加而SERCA降低(P均<0.05);相比ATO組,2-APBL組和2-APBH組AST、CK、LDH降低而SERCA增加(P均<0.05),2-APBH組變化更著(P均<0.05)。見圖3。

圖3 各組大鼠血清心肌損傷標志物及SERCA水平柱狀圖 A.GOT; B.CK; C.LDH; D.SERCA (*:組間整體比較P<0.05;#:與對照組和2-APB組比較P<0.05;&:與ATO組比較P<0.05;△:與2-APBL組比較P<0.05)

2.4 病理學 2-APBL組及2-APBH組大鼠心肌細胞稍腫脹、排列稍紊亂,紅細胞部分滲出,其中2-APBH組心肌細胞受損程度較輕;ATO組心肌細胞腫脹、結構不完整,排列紊亂,細胞間隙增寬,細胞核濃縮深染,胞漿深染,紅細胞大量滲出,部分受損較重者可見壞死灶;2-APB組和對照組大鼠心肌細胞結構完整且清晰、形態正常、排列整齊,細胞核位于心肌細胞中央,細胞間隙均勻。見圖4。

圖4 大鼠心肌組織病理圖(HE,×100) A.2-APBL組; B.2-APBH組; C.ATO組; D.2-APB組; E.對照組

2.5 相關性分析 WIS、PI及WIS×PI與均SERCA呈正相關(r=0.874、0.893、0.920,P均<0.05);GCSendo、GSCmid及GCSepi均與SERCA呈正相關(r=0.916、0.848、0.783,P均<0.05)。

3 討論

降低SERCA活性、破壞心肌細胞Ca2+穩態為ATO心臟毒性作用機制之一[3]。2-APB可降低心肌成纖維細胞Ca2+濃度并維持鈣穩態[4,7]。本研究參照GHOLAMI等[8]方法制備大鼠ATO模型,結果顯示各ATO組大鼠一般情況較差,而2-APBL組和2-APBH組較之有所改善,提示大鼠ATO心臟毒性可引發一般情況改變,而2-APB對此具有保護作用。

本研究各ATO組大鼠LVEF均低于對照組但仍處于正常范圍,提示ATO可損傷心臟,但LVEF難以準確評估各層及各節段心肌[9]。本研究2-APBL組、2-APBH組和ATO組WIS、PI、WIS×PI及AUC均低于對照組,其中2-APBL組和2-APBH組均高于ATO組,且2-APBH組又高于2-APBL組,提示ATO可破壞大鼠心肌微循環血流灌注,而2-APB有助于減輕損傷,且劑量越高,效果越明顯。

本研究5組大鼠左心室心肌GCS均表現為GCSendo>GCSmid>GCSepi,與王臻等[10]的結果相符;可能由于心內膜層心肌相對運動幅度較大,負向扭轉形變亦較大,應變能力更強;以ATO及2-APB干預后GCS均有所下降/上升,以GCSendo變化最明顯,可能心內膜層心肌由冠狀動脈末梢血管供血且距冠狀動脈主干較遠,對血供和氧供變化更敏感[11]。本研究發現MCE及STI參數均與SERCA具有相關性,提示MCE和STI,尤其WIS×PI和GCS-endo(r=0.920、0.916)有助于監測ATO心臟毒性并評估2-APB對心肌的保護作用;病理學結果亦進一步證實ATO可破壞大鼠心肌細胞,而2-APB對此具有保護作用。

本研究的主要局限性:①心尖四腔心圖像質量較差,無法提供整體縱向應變參數;②因側壁回聲失落效應、后壁受造影劑聲影影響,無法提供后壁和側壁心肌超聲造影相關參數;③未使用小動物專用超聲設備;④尚無2-APB給藥劑量標準。

綜上所述,MCE聯合STI、尤其WIS×PI和GCSendo參數可用于評估2-APB對砷致大鼠心臟毒性的保護作用。

利益沖突:全體作者聲明無利益沖突。

作者貢獻:馮佳數據分析、撰寫和修改文章;田芮萌數據分析;蘆桂林指導;秦文娟指導、審閱文章。