共生微生物對仔豬腸道發育、代謝和線粒體功能的影響

張進威 吳元霞 孫靜 李曉開 陸路 李周權葛良鵬

（1. 重慶市畜牧科學院，重慶 402460；2. 農業農村部養豬科學重點實驗室 養豬科學重慶市重點實驗室，重慶 402460；3. 國家生豬技術創新中心，重慶 402460；4. 西南大學動物科學技術學院生物飼料與分子營養實驗室，重慶 400715；5. 四川農業大學動物科技學院，成都 611130）

在漫長進化過程中，部分微生物定居于其他生物體，逐漸形成復雜多樣的種群并伴隨宿主一生，被稱為共生微生物（commensal microbiota）。共生微生物定居在宿主多個解剖學部位，在種類和豐度上存在巨大差異，表現出部位特異的微生物-宿主互作模式［1］。線粒體是真核細胞的“能量工廠”，可通過氧化磷酸化合成ATP，同時還參與細胞鈣離子平衡、凋亡、炎性反應等生物學過程［2］。一直以來，線粒體被認為是祖先細菌在真核細胞內共生而形成的，在進化上與α-變形菌有共同起源，尤其是細胞色素氧化酶與細菌高度同源，說明線粒體與微生物之間存在特殊的印記和紐帶［3］。

線粒體是微生物與宿主細胞之間的重要聯系，營養代謝是微生物和線粒體共有的功能［4］。近年來研究發現，共生微生物產生的代謝物會影響線粒體功能和生物發生［5］。例如，共生微生物直接或通過短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids, SCFAs）、次級膽汁酸、H2S等代謝產物間接影響線粒體能量代謝、活性氧（reactive oxygen species, ROS）產生和細胞免疫反應［6］。此外，線粒體DNA遺傳變異［7］、線粒體功能（如氧化還原平衡［8］、線粒體ROS［9］）紊亂、線粒體動力相關蛋白活性變化［10］等也會影響腸道共生微生物組成，表明腸道共生微生物與宿主細胞線粒體存在相互影響的過程。

線粒體是哺乳動物細胞中唯一具有微生物起源的細胞器，也被認為是微生物調控宿主細胞的重要靶點［11］。無菌（germ-free, GF）豬是對無特定病原、外觀無異常的供體母豬進行無菌剖腹產，仔豬全程飼養于無菌環境，獲得的不含任何活的微生物的特殊用途豬，GF豬作為模型可排除背景微生物干擾，獲得高重復高敏感的研究結果［12］。無特定病原（specific pathogen-free, SPF）豬是從出生到育成均無特定病原體存在的健康豬，是研究共生微生物的標準實驗動物。本研究利用GF豬和SPF豬為模型，研究共生微生物對宿主腸道形態、代謝、基因表達及線粒體功能的影響，以期為“微生物-宿主互作”對仔豬腸道健康的調控研究奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 選擇無特定病原（GB/T 22914-2008中11種病原均為陰性）、外觀無異常、飼養管理良好的巴馬母豬作為供體，預產期前一天經無菌剖腹產獲得新生仔豬。同批次仔豬隨機分為兩組，一組飼養在無菌環境的飼養隔離器中，作為GF組（n = 3）；另一組（n = 3）飼喂在SPF環境的飼養隔離器中，作為SPF組。所有仔豬給予相同飼養條件，自由采食和飲水，室溫22-28℃，濕度40%-70%，0-4周飼喂滅菌奶（60Co輻照滅菌），5-6周飼喂滅菌固體飼料，試驗期為42 d。飼養期間，每周對GF組的豬只、飲水、奶粉、隔離器等進行微生物監測（參照孫靜等［13］方法執行），微生物監測結果參考文獻［14］。試驗經重慶市畜牧科學院實驗動物倫理委員會批準（XKY-20210606），在重慶市畜牧科學院國家現代畜牧業示范區試驗用豬工程中心進行。

1.1.2 主要試劑 HE染色試劑盒（G1120）購自北京索萊寶生物科技有限公司；Anti-Prohibitin抗體（線粒體標記物）購自Abcam公司（ab28172）；HRP標記山羊抗兔IgG（GB23303）購自武漢塞維爾公司；DAB試劑盒（ZLI-9018）購自北京中杉金橋生物有限公司；蘇木素染液（LM10N13）購自北京百靈威科技有限公司；檸檬酸鹽抗原修復液（ZLI-9065）購自北京中杉金橋生物技術有限公司；通用型RNA小量提取試劑盒（R4130-03）購自廣州美基生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA（RR037A）、TB Green? Premix Ex TaqTMII（RR820A）購自Takara；甲醇（A456-4）、乙腈（A955-4）、甲酸（A117-50）購自Fisher Scientific；Kairos氨基酸試劑盒（176004379）購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 腸道形態結構 試驗期第42天，將GF組和SPF組仔豬進行屠宰。取回腸、結腸各3 cm樣品，經生理鹽水沖洗、福爾馬林浸泡保存；再經固定、脫水、石蠟包埋、切片，按照HE染色試劑盒說明書進行染色。染色后的切片通過鏡檢觀察腸道形態結構，使用Olympus BX51圖像采集系統采集圖像，圖片使用Image J軟件進行絨毛高度、隱窩深度及黏膜層厚度的測定［15］，并對比組間差異。

1.2.2 氨基酸和短鏈脂肪酸含量測定 氨基酸和短鏈脂肪酸含量測定委托北京荷欣科技有限公司完成。采用液質聯用（LC-MS）方法進行測定，以液相色譜作為分離系統，質譜為檢測系統，樣品在質譜部分和流動相分離，被離子化后，經質譜的質量分析器將離子碎片按荷質比分開，經檢測器得到質譜圖。

回腸、結腸、肝臟和血清經過甲醇、甲酸和AccQ Tag衍生試劑（美國Kairos氨基酸試劑盒）等試劑處理后得到待測上清液；采用梯度稀釋法，配制不同濃度氨基酸標準品，加入等體積同位素內標，混勻后待測；將待測上清和標準品在Waters ACQUITY UPLC I-CLASS超高效液相色譜進行色譜分離（色譜柱：Waters UPLC HSS T3；流動相：A相為0.1%甲酸、B相為乙腈；流速：0.5 mL/min；進樣量：5.0 μL；柱溫：50℃），采用Waters XEVO TQ-S串聯四級桿質譜系統進行質譜分析（正離子離子源電壓1.5 kV、錐孔電壓20 V；去溶劑溫度600℃，去溶劑氣體流速1 000 L/h；錐孔氣體流速10 L/h）。利用MassLynx定量軟件計算峰面積，通過標準曲線法得到氨基酸的定量結果。

回腸、結腸、肝臟和血清經甲醇、丙酸同位素內標及3-硝基苯肼等試劑處理后得到待測上清；配制不同濃度短鏈脂肪酸標準品；將待測上清和標準品在Waters ACQUITY UPLC I-CLASS超高效液相色譜進行色譜分離（色譜柱：Waters UPLC BEH C8；流動相：A相為0.01%甲酸、B相為甲醇∶異丙醇 = 8∶2；流速：0.3 mL/min；進樣量：5.0 μL；柱溫：45℃）；采用Waters XEVO TQ-S Micro串聯四級桿質譜系統進行質譜分析（離子源電壓3.0 kV、溫度150℃；去溶劑化溫度450℃、去溶劑化氣體流速1 000 L/h；錐孔氣體流速10 L/h）；采用TargetLynx定量軟件計算峰面積，采用標準曲線法獲取短鏈脂肪酸的定量結果。

1.2.3 線粒體含量測定 回腸和結腸線粒體含量采用免疫組化方法進行測定，樣品經固定、脫水、石蠟包埋、組織切片等過程；然后將切片在檸檬酸鹽抗原修復液中進行抗原修復；3%的H2O2去離子水阻斷內源性過氧化酶；加入山羊血清工作液對組織進行封閉；加入一抗（Anti-Prohibitin抗體）稀釋液，4℃過夜；二抗（HRP標記山羊抗兔IgG）孵育，在室溫下孵育30 min；應用DAB溶液顯色；復染細胞核、脫水封片；最后切片在顯微鏡下進行鏡檢觀察并采集圖片，圖片使用Image J軟件測定光密度（optical density, OD）［16-17］，將圖片拖拽到Image J軟件中，在Image-Type中將圖片調整為8 bit，然后在Analyze-Calibrate的function選中Uncalibrated OD將圖片灰度調整為OD值，在Analyze-Set measurements選定Area、Integrated density、Area fraction和Limit to threshold參數，在Image-Adjust-Threshold進行面積選中，最后在Analyze-measure進行測定，得出Area和IntDen數據，計算平均光密度值（Area/IntDen），兩組數據進行統計分析。

1.2.4 RNA-seq分析

1.2.4.1 總RNA提取 將肝臟、回腸和結腸組織置于盛有液氮的研缽中充分研磨，使用通用型RNA小量提取試劑盒提取總RNA，使用NanoDrop 2000分光光度計檢測RNA濃度和質量，質檢合格的RNA樣品用于建庫和測序。

1.2.4.2 文庫構建及測序 取約3 μg 總RNA樣品用于文庫構建。按照Epicentre Ribo-zeroTM rRNA Removal Kit試劑盒說明書步驟去除核糖體RNA（rRNA），隨后用乙醇沉淀法清洗無rRNA樣品。按照NEBNext? UltraTM Directional RNA Library Prep Kit試劑盒說明書步驟構建RNA-seq測序文庫。文庫構建完成后，通過Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫，隨后用Agilent 2100對文庫的插入片段大小進行檢測，插入片段符合預期后，使用q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準確定量。文庫質檢合格后，委托北京諾禾致源科技股份有限公司使用Illumina Hiseq2500高通量測序平臺在PE150模式下進行測序。所有下機數據已經上傳至組學原始數據歸檔庫（genome sequence archive, GSA, https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/），登錄號為CRA011035。

1.2.4.3 差異基因分析 原始數據（raw data）通過cutadapt2.0軟件進行過濾處理，過濾條件為：去掉含有超過10%的N（測序儀未識別的堿基）、比對到接頭序列超過10個堿基（base pair，bp）、堿基錯配率達到10%或者包含超過50%的堿基質量評分都在5分以下的序列，過濾后得到高質量測序數據（clean data）。通過kallisto軟件（v0.44.0）對基因表達量進行定量，計算每個樣本TPM值（每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的轉錄本，至少在一個組織的所有重復中TPM ＞ 1的mRNA被認為表達）。通過edge R（v 3.10）計算差異基因［18］，校正P＜0.05和|log2（FoldChange）|＞1視為差異基因。

1.2.4.4 基因功能富集分析 使用Metascape網站（https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1）對差異表達基因進行基因本體論（gene ontology, GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）功能富集分析［19］。

1.2.4.5 線粒體基因集分析 線粒體功能相關基因集從MitoCarta3.0 MitoPathways數據庫中下載，包括線粒體功能相關基因（電子呼吸傳遞鏈、鈣離子穩態、氨基酸代謝、脂質代謝、碳水化合物代謝等）［20］。這些基因通常來自基于人的研究，本研究使用人與豬一對一同源基因，通過熱圖展示這些基因的表達變化。

1.2.5 實時熒光定量（RT-qPCR）檢測

1.2.5.1 引物設計 首先在NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）中查找并下載目的基因序列，使用在線Primer3.0進行引物設計，并在NCBI Primer Blast進行特異性分析。篩選特異性高的引物序列送到蘇州金唯智公司合成。試驗中所有目的基因引物信息如表1，其中GAPDH為內參基因。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for RT-qPCR

1.2.5.2 RT-qPCR熒光定量 按照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser說明書對總RNA進行反轉錄，獲得cDNA，并以此為模板采用實時熒光定量PCR方法（TB Green? Premix Ex Taq II反應體系）測定各基因mRNA表達水平，每個反應3個技術重復。擴增程序設計為：95℃（預變性），30 s；95℃（變性），5 s；60℃（退火），34 s，40個循環。

1.2.6 統計分析 采用2-ΔΔCt方法計算GF豬和SPF豬各樣品中的基因相對表達量，ΔCt=Ct目標基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCtSPF組織-ΔCtGF組織。試驗數據采用SPSS18.0軟件進行數據分析，使用GraphPad Prism 8.0.2軟件進行圖片繪制，試驗結果以“平均值±標準差”表示，P ＜ 0.05為差異顯著，P ＜ 0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 共生微生物對仔豬腸道形態結構的影響

由圖1 HE染色結果可知，GF-回腸、GF-結腸、SPF-回腸和SPF-結腸的形態結構完整性良好，腸道絨毛和隱窩均保持著正常形態結構。測定腸道絨毛高度、隱窩深度和黏膜層厚度，結果顯示（圖1-A-F），GF仔豬和SPF仔豬回腸絨毛高度無顯著差異，但SPF仔豬絨毛高度在數值上高于GF仔豬，SPF仔豬回腸黏膜層厚度顯著高于GF仔豬（P ＜ 0.01）；SPF仔豬和GF仔豬結腸絨毛高度無顯著差異，SPF仔豬隱窩深度顯著低于GF仔豬（P ＜ 0.01），黏膜層厚度呈現高于GF仔豬的趨勢。以上結果表明共生微生物有助于腸道形態結構發育。

圖1 共生微生物對腸道絨毛高度、隱窩深度及黏膜層厚度的影響Fig. 1 Effects of commensal microbiota on intestinal villus height, crypt depth, and mucosal thickness

2.2 共生微生物對短鏈脂肪酸含量的影響

由圖2可知，SPF仔豬和GF仔豬回腸短鏈脂肪酸中的乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、戊酸和已酸含量無顯著差異（圖2-A），但SPF仔豬回腸已酸含量有降低的趨勢；SPF仔豬結腸的丙酸、戊酸含量分別比GF仔豬高4317.77%和3883.32%（P ＜ 0.05），SPF仔豬結腸乙酸和丁酸呈現高于GF仔豬的趨勢，其余指標無顯著差異（圖2-B）；SPF仔豬肝臟已酸含量低于GF仔豬39.59%（P ＜ 0.05），SPF仔豬肝臟丁酸含量呈現高于GF仔豬的趨勢，其余指標無顯著性影響（圖2-C）；血清中短鏈脂肪酸指標無顯著性影響（圖2-D）。以上結果表明共生微生物對結腸短鏈脂肪酸含量影響較大，特別是乙酸、丙酸和丁酸含量。

圖2 共生微生物對仔豬短鏈脂肪酸含量的影響Fig. 2 Effects of commensal microbiota on the contents of short-chain fatty acids in piglets

2.3 共生微生物對氨基酸含量的影響

由圖3可知，GF仔豬和SPF仔豬回腸的必需氨基酸和非必需氨基酸含量無顯著影響（圖3-A-B）；SPF仔豬結腸精氨酸（Arg）和谷氨酸（Glu）含量分別低于GF仔豬79.78%和20.46%（P ＜ 0.05），其余氨基酸無明顯影響（圖3-C-D）；SPF仔豬肝臟必需氨基酸含量顯著低于GF仔豬（P ＜ 0.05），SPF仔豬肝臟精氨酸（Arg）、天冬氨酸（Asp）和谷氨酰胺（Gln）含量分別低于GF仔豬70.03%、71.51%和52.34%（P ＜ 0.05），其余指標無顯著差異（圖3-E-F）；SPF仔豬血清甲硫氨酸（Met）、甘氨酸（Gly）和丙氨酸（Ala）含量顯著高于GF仔豬（P ＜ 0.05），其余指標無顯著差異（圖3-G-H）。以上結果表明共生微生物主要促進肝臟氨基酸的代謝，而對回腸、結腸和血清氨基酸含量無明顯影響。

圖3 共生微生物對仔豬氨基酸含量的影響Fig. 3 Effects of commensal microbiota on the amino acid contents in piglets

2.4 共生微生物對腸道線粒體含量的影響

由回腸和結腸線粒體免疫組化結果可知（圖4），兩組間回腸組織線粒體數量無顯著差異；SPF仔豬結腸線粒體數量顯著高于GF仔豬（P ＜ 0.05）。以上結果表明共生微生物影響結腸細胞線粒體含量。

圖4 共生微生物對仔豬回腸和結腸線粒體含量的影響Fig. 4 Effects of commensal microbiota on the mitochondrial contents in the ileum and colon of piglets

2.5 共生微生物對回腸、結腸和肝臟基因表達的影響

基因表達相關性分析顯示，組織內的相關系數為0.93-0.98；組織間的相關系數為0.1-0.7（圖5-A）?；虮磉_的層次聚類分析顯示，所有樣本先按照組織類型分類，再按照處理效應聚類（圖5-B）。差異基因分析顯示（圖5-C, D），GF仔豬和SPF仔豬的回腸差異基因為114個（上調83個，下調31個），結腸差異基因為101個（上調49個，下調52個），肝臟差異基因為123個（上調67個，下調56個）（圖5-E-G），以上結果表明共生微生物影響仔豬肝臟、回腸和結腸的整體基因表達模式。

圖5 共生微生物對回腸、結腸和肝臟基因表達量的影響Fig. 5 Effects of commensal microbiota on the gene expressions in ileum, colon, and liver

組織差異基因進行功能富集發現（圖6），肝臟的差異基因主要參與能量代謝過程，回腸和結腸的差異基因主要參與能量代謝和免疫反應過程，表明共生微生物影響腸道組織和肝臟的能量代謝和免疫反應等生物學過程。

圖6 回腸、結腸和肝臟差異基因功能富集分析Fig. 6 Results of functional enrichment analysis of differential genes in the ileum, colon, and liver

2.6 共生微生物對線粒體功能相關基因表達的影響

線粒體功能相關基因集分析結果顯示，與GF仔豬相比，SPF仔豬回腸線粒體的氧化磷酸化過程顯著上調（P ＜ 0.05），蛋白質攝取和運輸過程顯著下調（P ＜ 0.05），氨基酸代謝、脂質代謝和碳水化合物代謝過程顯著上調（P ＜ 0.05），鈣離子平衡受到調控（圖7）。SPF仔豬結腸的氧化磷酸化過程受到顯著影響，其中ND1、ND4L和ND4顯著上調（P ＜ 0.05），ATP6、ATP5PF、COX19、NDUFA4、CYTB、ND6和ND3顯著下調（P ＜ 0.05）；參與鈣離子平衡的MICU3和MCU顯著上調（P ＜ 0.05），SMDT1基因顯著下調（P ＜ 0.05）；參與核酸代謝過程的AK3顯著上調（P ＜ 0.05），參與細胞凋亡的MSRB2顯著性下調（P ＜ 0.05）（圖7）。在SPF仔豬肝臟中，參與鈣離子平衡過程的MICU1顯著下調，參與脂質代謝過程的ACAA2顯著上調（圖7）。

2.7 共生微生物對線粒體介導的脂質氧化、氧化應激和細胞凋亡過程的影響

選擇線粒體功能相關基因進行組織定量分析，結果顯示，與GF仔豬相比，SPF仔豬肝臟PIG3表達顯著上調（P ＜ 0.05），PGC-1α表達顯著下調（P＜ 0.05，圖8-A-C）；SPF仔豬回腸的脂質氧化過程中ACC1基因顯著上調（P ＜ 0.05），CPT-1α表達量呈現升高趨勢（圖8-D），細胞凋亡途徑的APAF-1、PIG3、CytC和p53顯著上調（圖8-E），抗氧化系統中NRF1、HO-1和TFAM均顯著上調（P ＜ 0.05，圖8-F）。SPF仔豬結腸脂質氧化過程中ACC1基因顯著下調（P ＜ 0.05，圖8-G），細胞凋亡相關基因無顯著差異（圖8-H），抗氧化系統中NRF1基因顯著下調（P ＜ 0.05，圖8-I）。SPF仔豬肝臟PIG3表達顯著上調（P ＜ 0.05），PGC-1α表達顯著下調（P ＜ 0.05，圖8-A-C）。

3 討論

3.1 共生微生物對仔豬腸道形態結構的影響

腸道是營養物質消化吸收的重要場所，也是進行腸道黏膜免疫和微生物防御的重要器官，其結構和功能與共生微生物息息相關。共生微生物對宿主的生長發育起著至關重要作用。腸道絨毛高度和隱窩深度是反映腸道健康重要指標，腸道絨毛增加了營養物質吸收面積，其表面含有多種可水解碳水化合物和蛋白質的消化酶［21］，對營養物質的消化吸收和代謝具有重要影響［22］，而隱窩深度決定了腸道上皮細胞的更新速度［23］，當隱窩變淺時，腸道上皮更新速度變慢，上皮細胞成熟率上升，細胞的分泌功能增加。在本研究中，SPF仔豬結腸隱窩深度顯著低于GF仔豬，表明共生微生物改善了黏膜層的結構，這與Du等［24］研究結果一致。由此可知，共生微生物促進仔豬腸道形態結構發育。

3.2 共生微生物影響仔豬營養物質代謝

仔豬的腸道形態結構與能量代謝有關，因此，我們進一步測定回腸、結腸、肝臟和血清中的營養代謝物含量變化，靶向分析共生微生物對小腸、大腸和外周組織部位營養代謝物的影響。SPF仔豬結腸短鏈脂肪酸顯著高于GF仔豬，而回腸和血清中短鏈脂肪酸無顯著性差異，肝臟中短鏈脂肪酸差異較小，表明了共生微生物有助于結腸短鏈脂肪酸吸收與代謝，其主要原因是共生微生物可以將哺乳動物難以消化的碳水化合物發酵產生短鏈脂肪酸，而結腸和肝臟是短鏈脂肪酸吸收代謝的重要場所［25］。氨基酸是營養素中重要的組成部分之一，不僅支持胃腸道中細菌的生長和存活［26］，而且參與調節生物體的能量和蛋白質穩態［27-28］。小腸是吸收氨基酸的主要場所，而結腸中氨基酸通常是被微生物代謝成氨、短鏈脂肪酸或支鏈脂肪酸，再被吸收到宿主體內［29］。本研究發現，SPF仔豬肝臟中氨基酸含量顯著低于GF仔豬，SPF仔豬結腸氨基酸含量（精氨酸和谷氨酸）低于GF仔豬，血清和回腸中無顯著差異，這提示共生微生物可能將結腸中的氨基酸代謝成短鏈脂肪酸，從而影響肝臟氨基酸含量。

3.3 共生微生物或其代謝物對線粒體功能的影響

線粒體不僅是細胞的能量轉換站，而且廣泛參與細胞鈣離子平衡、凋亡、炎性反應及腸道穩態等生物學進程。線粒體是哺乳動物細胞中唯一具有微生物起源的細胞器，且許多研究認為線粒體是共生微生物調控宿主細胞的重要靶點［11］。腸道細胞是與共生微生物物理距離最近的場所，腸道和肝臟是機體能量代謝的主要場所。因此，本研究通過檢測回腸、結腸和肝臟的氨基酸和短鏈脂肪酸及基因表達等指標，探究共生微生物對仔豬腸道細胞線粒體功能的影響。

本研究發現，SPF仔豬結腸中短鏈脂肪酸含量（乙酸、丙酸和丁酸）顯著增加；SPF仔豬結腸線粒體的氧化磷酸化過程受到顯著影響，特別是復合體I亞基。先前已有研究報道，短鏈脂肪酸（丁酸）促進線粒體的氧化磷酸化過程［8］，這表明了共生微生物產生的短鏈脂肪酸促進了腸道細胞線粒體的氧化磷酸化過程。線粒體的氧化磷酸化高度耗氧，較高的氧化磷酸化會引起結腸局部缺氧，促進共生微生物定植，維護腸道穩態及健康［8］。因此，共生微生物通過影響線粒體氧化磷酸化，從而調控共生微生物與宿主之間的動態平衡。

線粒體基因集分析發現，SPF仔豬肝臟、回腸和結腸的鈣離子單向轉運蛋白相關基因均受到調控，而MCU、MICU1和MICU3是參與線粒體鈣離子單向轉運的關鍵基因［30］，調控線粒體鈣離子吸收，這表明共生微生物通過調控鈣離子吸收關鍵基因來調控線粒體基質的鈣離子平衡。SPF回腸中MCU基因顯著上調，暗示回腸線粒體基質鈣離子濃度增加。線粒體鈣離子濃度持續或過量誘導線粒體通透性轉換孔（mitochondrial permeablity transition pore, mPTP）打開，導致線粒體腫脹、細胞色素C釋放和細胞凋亡誘發的細胞死亡［31］；SPF仔豬回腸APAF-1、PIG3、CytC和p53基因顯著上調，回腸細胞發生凋亡，這表明共生微生物可能通過調控線粒體基質鈣離子濃度影響回腸線粒體途徑誘發的細胞凋亡。

此外，SPF和GF仔豬回腸、結腸和肝臟存在許多特有的差異基因，回腸和結腸共有的差異基因較多，這反映了共生微生物對宿主影響的組織特異性［32］。差異基因功能分析發現，回腸、結腸和肝臟中差異基因主要參與能量代謝和免疫相關通路，例如：SPF仔豬肝臟甘油脂代謝過程（GO：0046486）上調，結腸谷氨酰胺家族氨基酸代謝過程（GO：0009064）以及回腸碳水化合物衍生物的分解代謝過程（GO：1901136）上調，這體現了共生微生物對仔豬組織能量代謝的直接調控作用［32］。SPF仔豬肝臟和回腸ACAA2（參與線粒體脂質代謝的關鍵基因［33］）上調，表明共生微生物可能通過影響ACAA2表達，來調節肝臟脂質代謝過程。SPF仔豬回腸氨基酸代謝相關基因（MAOB，OTC和SLC25A15）顯著上調，這表明共生微生物促進線粒體氨基酸代謝。

4 結論

共生微生物影響仔豬腸道形態結構和發育，促進仔豬營養物質的吸收與代謝。共生微生物通過調控腸道細胞線粒體的氧化磷酸化、鈣離子平衡及物質代謝等生物學過程，從而調節腸道發育和代謝，最終影響仔豬腸道穩態和健康。