基于響應面法優化沙棘普洱茶粉水提工藝及體外抗氧化能力評價研究

張靖鵬,翟宇晴,張得鈞

(青海大學 生態環境工程學院,青海 西寧 810016)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)是胡頹子科沙棘屬植物,其果實中含有維生素C、維生素E、氨基酸、胡蘿卜素、黃酮類、多酚類等多種生物活性物質,而其葉片中富含茶多酚、氨基酸、脂肪、咖啡堿等成分[1].經對沙棘葉分別以甲醇、水、無水乙醇、丙酮、乙酸乙酯為提取劑進行提取,發現其提取物均具有一定的抗氧化活性[2].此外,研究發現沙棘葉提取物[5]具有調節糖代謝及降糖功效.經驗證,10%沙棘葉含藥血清可降低高脂細胞模型的脂質累積和降低細胞內的TG、TC水平[3].此外,沙棘葉可以通過抗氧化酶的水平進而減低黃曲霉毒素產生的氧化應激作用[4].

普洱茶是由毛茶[Camelliasinensfs(Linn.)var.assamica(Masters)Kitamura]的鮮葉制作而成的,期間經曬青、殺青、揉捻、日曬等工序,再采用特殊的“渥堆”工藝后發酵而成[5].研究表明,普洱茶中富含茶多酚、咖啡堿、茶素、茶單寧、維生素等活性成分,具有降血脂[6]、緩解酒精性脂肪肝[7]及抗氧化[8]等功效,而其具有的降血脂的作用可能是通過影響鯊烯合成酶催化水平,抑制膽固醇合成,降低細胞內膽固醇濃度及參與肝細胞代謝過程實現的[6].

茶粉又稱茶精、速溶茶,是以成品茶為原料,經提取、濃縮、噴霧干燥等工藝制成的粉末或顆粒狀產品[9].目前,普洱茶粉制備工藝較為完善,產品穩定性較高[10].茶粉的提取方法包括水浸提法[11]、乙醇浸提法[12]及酶解法[13],其提取液中的可溶性固形物含量是評價茶粉提取率的重要指標之一[11],而得到的茶粉具有較高的茶褐素含量[14],具有較茶相比具有更好的降血脂功效[15].而復配茶提取液具有更好的口感,如沙棘葉與羅漢果、金銀花復配,經提取、加入甜味劑和酸味劑制得的復合茶飲料色澤清亮,茶香自然清新,口感清爽[16].綜上所述,將沙棘葉與普洱茶經復配、提取、干燥可能制備出具有更高飲用價值的茶粉.

DPPH、ABTS因反應穩定、易操控等特點是體外自由基清除能力評價實驗中常用的指示劑,而總還原能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)與銅離子還原能力(cupric reducing antioxidant power,CuPRAC)則是通過還原金屬離子進行的評估的一種體外抗氧化方法[17].

基于生產成本考慮,首先選擇原料配比(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)為研究對象,通過采用單因素分析、Box-Benhnken響應面優化沙棘普洱茶水提工藝,后對不同原料配比的沙棘普洱茶粉進行體外抗氧化實驗,進而對沙棘普洱茶粉的制備及功效進行初步研究,進而為沙棘、普洱綜合加工、利用提供一定理論及實踐參考.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及設備

沙棘葉(青海西寧大通縣);普洱茶末(云南茶東家茶葉有限公司,云南昆明);DPPH、ABTS;2,9-二甲基-1,10-菲啰啉(新亞銅靈);L-抗壞血酸標準品(Vc)(Scientific Phygene);FRAP(T-AOC)試劑盒(南京建成生物工程研究所);其余試劑均為國產分析純;紫外可見光分光光度計(754PC)(上海元析儀器有限公司);酶標儀(ST-360)(上?？迫A生物工程股份有限公司);數顯恒溫水浴鍋(HH-4)(天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠);噴霧干燥機組(LPG-5)(江蘇先鋒干燥工程有限公司);旋轉蒸發儀(R5002K)(上海夏豐實業有限公司);數字阿貝折光儀(WYA-3S)(上海儀電物理光學儀器有限公司);紫外可見光分光光度計(754PC)(上海元析儀器有限公司);酶標儀(ST-360)(上?？迫A生物工程股份有限公司).

1.2 試驗方法

1.2.1 沙棘普洱茶粉工藝

將沙棘葉粉碎并與普洱茶末按照配料比(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)混合,加入純凈水,浸泡 0.5 h 后,在一定溫度、pH、時間下進行水提,后進行濃縮、噴霧干燥,最終得到沙棘普洱茶粉.

1.2.2 單因素試驗

以不同料液比、提取時間、提取溫度與pH進行單因素試驗,考察不同因素對沙棘普洱茶粉料液中可溶性固形物的影響.除變化量外,試驗固定料液比為1∶8(g/mL),提取溫度為 80 ℃,提取時間為 3 h,pH為7,分別研究料液比(1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10 g/mL),提取溫度(60、70、80和 90 ℃、沸騰),提取時間(1、2、3、4和 5 h),pH(5、6、7、8、9)對可溶性固形物的影響.

1.2.3 響應面試驗設計

根據單因素確定3個水平,以料液比、提取時間、提取溫度與pH為試驗因素,以可溶性固形物為響應值,采取Box-Behnken中心組合法進行4因素3水平試驗設計,試驗因素水平見表1.

表1 響應面試驗因素水平設計

1.2.4 理化檢測

檢測料液中可溶性固形物使用《GB/T 12143 飲料通用分析方法》中可溶性固形物的檢測方法.檢測不同沙棘葉、普洱茶末原料配比下沙棘普洱茶粉產品中相關活性化合物含量(包括：沙棘總黃酮、兒茶素、茶多酚及茶褐素),檢測方法：沙棘總黃酮參照《中國藥典2020年第一部》沙棘項下,茶多酚、兒茶素參照《GB∕T 8313—2018 茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測方法》,茶褐素參照《NY/T 3675—2020 紅茶中茶紅素和茶褐素含量的測定分光光度法》.

1.2.5 體外抗氧化能力評價

按照最優提取工藝參數,分別對沙棘葉、普洱茶末及不同沙棘葉、普洱茶末配比(1∶1、1∶4、4∶1)的沙棘普洱茶粉進行提取,后經濃縮、干燥制備得到茶粉樣品.

分別稱取沙棘茶粉、普洱茶粉、沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶1)、沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)、沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)及Vc 3.5 mg/mL 樣本溶液,對上述樣本溶液依次進行梯度稀釋,得到1.0、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL 濃度梯度的樣本及對照品溶液.

1) DPPH抗氧化能力測定 稱 2 mg DPPH,用乙醇溶解定容至 25 mL,得到DPPH儲備液.吸取DPPH儲備液 15 mL 并用乙醇定容至 25 mL,得到DPPH工作液.于96孔板中加入 200μL 的DPPH工作液,再各自加入 5 μL 樣本溶液和 5 μL Vc溶液,分別作為樣品組和陽性對照組,每隔 5 min 于 517 nm 波長下測定OD值,直至測至 30 min,空白對照組以乙醇代替樣本溶液.DPPH自由基清除率計算公式為：

清除率(%)=(OD1-OD2)/OD1×100%

(1)

式中,OD1為空白對照組吸光度,OD2為樣本組吸光度.

2) ABTS抗氧化能力測定 稱ABTS 57.6 mg,用 0.02 mol/L 醋酸緩沖液溶解,定容至 15 mL.稱過硫酸鉀 6.6 mg,用 0.02 mol/L 醋酸緩沖液溶解,定容至 10 mL.取 5 mL ABTS溶液和 5 mL 過硫酸鉀溶液,混勻后避光反應 12 h,得到ABTS母液.吸取 280 μL ABTS母液,用 0.02 mol/L 醋酸緩沖液稀釋至 6.5 mL,避光反應 30 min 后,即得ABTS工作液.

于96孔板中加入 200 μL 的ABTS工作液,再各自加入 10 μL 樣本溶液和 10 μL Vc溶液,分別作為樣品組和陽性對照組.每隔 10 min 于 734 nm 波長下測定OD值,直至測至 60 min,空白對照組以乙醇代替樣本溶液.ABTS自由基清除率計算公式為：

清除率(%)=(OD1-OD2)/OD1×100%

(2)

式中,OD1為空白對照組吸光度,OD2為樣本組吸光度.

3) FRAP抗氧化能力測定 以試劑盒提供的實驗方法進行實驗,于比色皿中加入 1 800 μL FRAP工作液,再分別加入 50 μL 樣本溶液,將其置于25～37 ℃ 下孵育 10 min,于 520 nm 波長下檢測吸光度,根據吸光度計算公式：

總抗氧化能力(U/mL)=(A1-A2)/0.01÷T×V1/V2

(3)

式中,A1為測定組吸光度,A2為空白組吸光度,T為反應時間(30 min),V1為取樣量(mL),V2為反應液總體積(mL).

4) CuPRAC抗氧化能力測定 稱取CuCl2·2H2O 4.28 mg 加水溶解,定容 25 mL,搖勻備用;稱 19.27 g 醋酸銨加水溶解,定容至 250 mL,搖勻備用;稱取 164.89 mg 新亞銅靈(2,9-二甲基-1,10-菲啰啉)加無水乙醇溶解,定容至 100 mL,搖勻,避光保存.

吸取新亞銅靈溶液、CuCl2溶液和醋酸銨溶液各 1 mL,分別加入Vc(3.5 mg/mL)溶液10、20、30、40、50、60 μL 后用無水乙醇補足 4 mL,避光反應 30 min 后在 450 nm 波長下檢測OD值.做標準曲線,得回歸方程.樣本溶液按上述操作加入,加入樣品 2.5 μL,反應 30 min 后于 450 nm 波長下檢測OD值.根據樣品OD值,帶入回歸方程得到對應的清除Vc-Cu2+還原能力值.

1.2.6 數據分析

試驗數據使用SPSS 17軟件對數據進行統計分析,每個實驗重復3次.試驗數據使用SPSS 17軟件進行統計分析.數據采用單因素ANOVA分析,以評價兩組差異的顯著性.使用Design Expert V8.0.5軟件對響應面模型進行分析.

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果及分析

2.1.1 料液比對沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影響

由圖1可知,當料液比在1∶5～1∶7時,料液的可溶性固形物隨著水添加量的增加而增加,說明增加水添加量促進原料中水溶性成分溶出[18].當料液比增加至1∶8以上時,料液中的可溶性固形物含量明顯下降,這是由于過多水對料液起到稀釋作用[19].

2.1.2 水提溫度對沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影響

由圖2可知,當溫度在60～80 ℃ 時,料液中的可溶性固形物不斷增加,說明溫度升高可以明顯提高原料中水溶性成分溶出.當溫度增加至 80 ℃ 以上時,料液中可溶性固形物出現輕微下降及逐步穩定現象,這可能是達到一定溫度后,使水溶性物質已基本完全溶出且溫度過高會破壞部分活性成分,故而使得溫度對其影響不再明顯[19].

圖1 料液比對沙棘普洱茶粉料液中可溶性固形物的影響

圖2 水提溫度對沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影響

2.1.3 水提時間對沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影響

由圖3可知,在提取時間在 3 h 以內時,料液中的可溶性固形物不斷增加,說明隨時間增加原料中水溶性成分會不斷溶出.當將提取時間增加至 4 h 以上時,料液中可溶性固形物會逐步穩定,這可能是一段時間后,水溶性物質已基本溶出且部分活性成分有所損失,故而料液中的可溶性固形物含量不再增加[19].

2.1.4 pH對沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影響

由圖4可知,料液中pH值在8以下時,料液中的可溶性固形物不斷增加,當將pH值增加至9時,料液中可溶性固形物略有下降,這可能是由于過堿環境不利于茶多酚等物質溶出,故而導致料液中的可溶性固形物含量有所下降[19].

圖3 水提時間對沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影響

圖4 pH對沙棘普洱茶料液中可溶性固形物的影響

2.2 響應面優化分析

2.2.1 響應面實驗結果

在單因素的基礎上,選取料液比(A)、水提溫度(B)、水提時間(C)、pH(D) 4個因素為變量,以沙棘普洱茶料液中可溶性固形物為響應值,采用Design-Expert 8.0.6統計軟件進行4因素3水平試驗.實驗設計及結果如表2所示.

采用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行二次多元回歸分析,對自變量A、B、C、D和可溶性固形物進行多元二項式方程擬合.回歸方程,如下：

Y=-64.804 17-2.483 33×A+0.58×B+2.508 33×C+9.275 00×D+(5.000 00E-003)×A×B+0.025×A×C+0.2A×D-(5.000 00E+003)×B×C+0.025 000×B×D+0.125 00×C×D-0.420 83×A2-(5.083 33E+003)×B2-0.583 33×C2-0.620 83×D2

表2 響應面實驗設計及結果

2.2.2 響應面方差分析

對回歸方程進行方差分析,結果見表3.回歸方程顯著性檢驗P<0.05,表明模型具有顯著性;失擬項P=0.826 0>0.05,表明方程擬合程度較高,無明顯失擬存在,此模型成立[20].

可溶性固形物的響應面圖見圖5～10,響應面圖可以直觀地反映各因素間的交互作用及各因素與響應值間的關系.響應面坡度越陡表示兩因素交互作用越大,反之則表示兩因素交互作用不顯著.等高線呈圓形表示兩因素之間交互作用不顯著,呈橢圓形或馬鞍形則表示兩因素之間交互作用顯著[20].

表3 方差分析結果

續表3

(A) (B)圖5 提取溫度和料液比的響應面(A)和等高線圖(B)

(A) (B)圖6 提取時間和料液比的響應面(A)和等高線圖(B)

(A) (B)圖7 pH和料液比的響應面(A)和等高線圖(B)

(A) (B)圖8 提取時間和提取溫度的響應面(A)和等高線圖(B)

(A) (B)圖9 提取溫度和pH的響應面(A)和等高線圖(B)

(A) (B)圖10 pH和提取時間的響應面(A)和等高線圖(B)

經軟件分析,沙棘普洱茶粉的最佳工藝是：料液比為1∶8(g/mL),提取溫度為 78.4 ℃,提取時間為 2.8 h,pH為8.3,預測可溶性固形物為4.9%.為了便于控制實驗條件,將最佳工藝調整為料液比為1∶8(g/mL)、提取溫度為 79 ℃,提取時間為 3 h,底物pH為8.3.應此條件進行3次平行試驗,平均可溶性固形物含量為4.8%±0.1%(RSD<2%),與預測值接近,說明該模型可用于擬合分析,結果穩定可靠,也與其他研究的相關提取參數一致[13,21].

2.3 不原料配比下沙棘普洱茶粉活性成分檢測及體外抗氧化實驗結果

2.3.1 不同原料配比下沙棘普洱茶粉活性成分檢測

由表4所示,5種配比的沙棘普洱茶粉均含有相關活性物質,其中普洱茶粉中各成分含量較高,沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)為3種混合茶粉中活性成分含量最高的,此外沙棘茶粉中沙棘總黃酮含量相對較高.

表4 樣品理化指標檢測 (mg/100g)

2.3.2 DPPH自由基清除能力測定

由圖11所示,在相同活性成分濃度含量、反應時間條件下,沙棘茶粉與沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)的DPPH自由基清除能力最強,普洱茶粉和沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)均有較強的清除能力,沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶1)最弱,且均有劑量依賴性.其中,沙棘茶粉及沙棘普洱茶粉的IC50(半清除率濃度)均在 1.0 mg/mL 以下.45 min 時,3.5 mg/mL 的不同溶液對DPPH自由基清除能力為：Vc>沙棘茶粉>普洱茶粉>沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)>沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)>沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶1).

(A)濃度測試 (B)反應時長測試圖11 DPPH抗氧化試驗

2.3.3 ABTS自由基清除能力測定

由圖12所示,在測定范圍內,沙棘茶粉與沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)的ABTS自由基清除能力最強,普洱茶粉與沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)對ABTS的清除能力基本一致,而沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶1)清除能力相對較弱,所有測試成分均具有劑量依賴性,而所有茶粉的IC50均在 1.0 mg/mL 以下.40 min 時,3.5 mg/mL 的不同活性成分溶液對ABTS自由基清除能力為：Vc>沙棘茶粉>沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)>普洱茶粉>沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)>沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶1).

(A)濃度測試 (B)反應時長測試圖12 ABTS抗氧化試驗

2.3.4 FRAP抗氧化能力測定

由圖13可知,普洱茶粉、沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)對FRAP鐵離子均有較強的還原能力,而沙棘茶粉則相對較弱.

2.3.5 CuPRAC抗氧化能力測定

由圖14可知,從清除率來看,沙棘普洱茶粉(1∶4)對Cu2+離子的還原能力最強,普洱茶粉次之,沙棘普洱茶粉(4∶1)也有較強還原能力,而沙棘茶粉及沙棘普洱茶粉(1∶1)還原能力相對較弱,且均呈現劑量依賴性.

圖13 FRAP抗氧化試驗(濃度測試)

圖14 CuPRAC抗氧化試驗(濃度測試)

3 討論與結論

研究表明,沙棘葉中富含黃酮類、多酚等營養成分,是開發成功能性食品、藥品、保健食品等的潛在原材料,此外,通過充分利用沙棘葉,不但可以利用廢棄資源,還可以提高人們健康水平,進而產生巨大的經濟價值[22].經研究表明,沙棘葉水溶提取物對羥基自由基及超氧陰離子自由基均有較強的清除能力,其清除率達到80%以上[2],進一步驗證了沙棘葉中存在抗氧化能力較強的生物活性物質.普洱茶因其在陳化過程中其品質型理化指標,如茶多酚、茶色素、多糖、氨基酸等均會發生變化[23],而香氣組分會發生富集,從而使其更具飲用價值[24].利用其所制作的普洱茶粉能夠顯著提高高血脂癥大鼠肝組織細胞中GSH-Px酶、SOD酶活力及降低MDA含量,從而起到降低血脂的作用,其抗氧化性明顯高于六堡茶和黑茶粉[15].

本研究基于單因素實驗、響應面優化實驗,討論沙棘普洱茶浸提過程中的關鍵工藝條件,得到了最優工藝參數.此外,通過使用體外抗氧化實驗的方法對不同原料沙棘葉與普洱茶末配比下所制備的茶粉進行對比實驗,實驗發現沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)、沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)相對于普洱茶粉、沙棘茶粉均具有較強的綜合體外抗氧化活性,而相關理化檢測結果顯示其所含活性成分也相對較高,說明通過沙棘葉與普洱茶的復配,其茶粉內活性成分富集,具有更強的抗氧化活性,更有益于人體健康[25].

本研究通過單因素實驗及響應面法設計優化了沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)水提的最佳工藝條件,結果表明,沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)的最佳工藝條件為：料液比為1∶8(g/mL)、提取溫度為 79 ℃,提取時間為 3 h,底物pH為8.3.應用此條件進行3次平行試驗,平均可溶性固形物達到4.8%.此外,通過對不同配料比的沙棘普洱茶粉進行體外抗氧化實驗,發現沙棘茶粉及沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=4∶1)對ABTS、DPPH的清除能力最強,普洱茶粉的總抗氧化能力最強,沙棘普洱茶粉(沙棘葉∶普洱茶末=1∶4)對Cu2+的還原能力最強.此外,理化指標檢測顯示沙棘普洱茶粉相對于單一茶粉所含相關活性成分(茶多酚、茶褐素及總黃酮)更均衡,進一步說明沙棘普洱茶粉可以富集相關活性成分,提高體外抗氧化能力.由此,經過對沙棘普洱茶粉水提工藝及抗氧化能力進行研究,可以為其進一步綜合利用沙棘、普洱資源進而開發功能性茶粉提供了一定的科學依據.