耐乙草胺促生菌篩選及其對玉米幼苗的促生效應

張鳳麟，黃寧，李雷，陳偉東，季欣悅，包英哲，王鴻斌

（1.吉林農業大學資源與環境學院，長春 130118；2.農業農村部鹽堿土改良與利用（東北內陸鹽堿地）重點實驗室，長春 130118；3.吉林省商品糧基地土壤資源可持續利用重點實驗室，長春 130118；4.吉林省公主嶺市植檢植保站，吉林 公主嶺 136100）

玉米是吉林省主要糧食作物之一，為提高玉米產量，農民習慣施用大量的化肥和除草劑，導致土壤和水體受到污染，土壤微生物結構被破壞，保肥保水能力降低[1]。如何在保證作物產量的同時，改善和利用黑土地，充分發揮經濟與糧食作物在黑土的生產潛力，是人們共同關注的熱點問題。

植物根際促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR）是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一類可促進植物生長及其對礦質營養的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌類[2]。PGPR 促生的方式主要有：①通過微生物固氮過程，將空氣中的游離氮轉變為植物可利用的氮素[3]；②溶磷促生菌通過釋放有機酸溶解土壤中難溶的磷元素，使植物獲得可吸收的磷[4]；③解鉀促生菌通過與礦物質接觸的直接作用方式或分泌多種物質的間接方式加速土壤中緩效態鉀向交換性鉀或水溶性鉀轉化，便于植物吸收利用[5]。除了促進植物吸收三大營養元素外，PGPR還有很多直接或間接的促生方式正在被挖掘。陳越等[6]分離篩選出產IAA（吲哚乙酸）能力高達141 mg·L-1的咸海鮮球菌屬（Jeotgalicoccussp.）m-60，可以促進煙草種子萌發及幼苗生長。Lau 等[7]研究發現7 株可抑制土傳病的促生菌，具有產生鐵載體和幾丁質酶的能力。明立偉等[8]在測定促生菌Bam688 時發現，該菌株具有提高作物抗氧化特性及維持滲透調節平衡的能力。宋揚[9]從40 種鹽堿地土著植物的根際土壤中分離得到一株腸桿菌屬細菌AD2-2，具有較強耐鹽堿能力，能夠分泌酸性物質降低植物根際pH 以促進鹽堿條件下植株根系生長。De Araujo 等[10]研究發現RS59-6菌株具有在水分脅迫下促進玉米生長的潛力。PGPR 菌劑作為一種新型生物肥料，有效推動了有機農業的發展，在農業以及環境修復等方面具有良好應用前景。但目前已有的文獻很少提及對除草劑有抗性的促生菌株，篩選出具有對除草劑具有抗性且有良好促生能力的促生菌，將是微生物菌劑開發的新方向。

鑒于此，本研究從吉林省梨樹縣施用乙草胺的玉米地中，挑選長勢良好的玉米植株，收集其根際土壤，分離篩選出了兩株耐乙草胺的優勢菌，對其進行促生功能鑒定分析，并通過促發芽試驗及盆栽試驗探究其在田間施用的可行性，以期為利用微生物增產增效提供優質的微生物資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試土壤

本試驗樣品取自吉林省梨樹縣西鳳凰山村，供試土壤為施用乙草胺（東北玉米種植區最常用的除草劑之一）且長勢較好的玉米植株根際土壤。

1.1.2 培養基

LB 培養基（Luria-Bertani 培養基）：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，去離子水1 000 mL，pH 6.0～7.0。

改良Aleksandrov 培養基[11]：葡萄糖5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeCl30.005 g，CaCO30.1 g，Ca2（PO4）32 g，含鉀礦物3 g，瓊脂20 g，溴百里酚藍0.1 g，去離子水1 000 mL。

Ashby 無氮培養基：蔗糖10 g，NaCl 0.12 g，K2HPO4·3H2O 0.5 g，CaCO31 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，去離子水1 000 mL。

NBRIP 培養基：葡萄糖10 g，Ca2（PO4）35 g，MgCl25 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KCl 0.2 g，（NH4）2SO40.1 g，去離子水1 000 mL。

L-TSB 培養基：色氨酸0.1 g，胰酪胨17 g，NaCl 5 g，K2HPO4·3H2O 2.5 g，葡萄糖2.5 g，大豆木瓜蛋白酶水解物3 g，去離子水1 000 mL。

改良CAS 培養基[12]：20%蔗糖溶液1 mL，10%酸水解酪素3 mL，1 mmol·L-1CaCl2100 μL，MgSO42 mL，瓊脂1.8 g，磷酸鹽緩沖液5 mL，CAS染液5 mL。

1.1.3 盆栽樣品

供試玉米品種為鄭單958。

1.2 菌株初步篩選

稱取根際土壤10 g，倒入帶玻璃珠的100 mL 無菌水瓶中，振蕩20 min，得到土壤懸液，再稀釋1×105倍，備用[13]。根據乙草胺的大田施用量（5～10 mg·L-1），制作分別含有100、200、300 mg·L-1乙草胺的LB平板，用移液槍吸取100 μL 稀釋液注入平板中，并用涂布棒涂布均勻，每個濃度重復3 次，置于30 ℃恒溫培養箱中培養。結合菌落直徑、菌落數量，選擇優勢菌落，用平板劃線分離純化3 代后接種到液體LB 培養基中進行富集。按1∶4的比例（0.2 mL甘油、0.8 mL菌液）保存于1 mL離心管中，-80 ℃保存。

1.2.1 解鉀菌篩選

將保存的優勢菌株制成菌懸液，采用點接法接種在Aleksandrov 固體培養基上，菌落生長且出現黃色暈圈，則說明具有解鉀能力，根據暈圈大小初步確定菌株解鉀能力強弱。

1.2.2 溶磷菌篩選

將優勢菌株的菌懸液稀釋，涂布于NBRIP 平板培養基上，28 ℃培養72 h，出現透明溶磷圈，則說明具有溶磷能力。

1.2.3 固氮菌篩選

采用稀釋涂布法將優勢菌株的菌懸液均勻涂布在Ashby無氮培養基上，28 ℃培養7 d，可以生長則視為具有固氮能力，根據菌落生長直徑判斷其固氮能力大小。

1.2.4 IAA分泌菌篩選

將具有以上功能的優勢菌株接種于L-TSB 培養基中，28 ℃、200 r·min-1振蕩48 h 后，8 000 r·min-1離心10 min。采用Salkowski 比色法，通過反應液顏色變化進行判斷：顏色變為粉紅色為具有分泌IAA 能力，根據顏色深淺判斷分泌能力強弱。

1.2.5 產鐵載體菌株篩選

將具有固氮、溶磷、解鉀、產IAA 功能的菌株點接于CAS 平板上，置于28 ℃培養箱中培養3 d，若菌株產生鐵載體，CAS 平板應由藍色變為橙色（橙色鐵螯合圈），根據橙色鐵載體暈圈的大小初步確定菌株分泌鐵載體的能力。

1.3 菌株促生能力的定量測定

1.3.1 菌株解鉀量測定

將初篩時有解鉀圈的菌株接種至100 mL Aleksandrov 液體培養基（不含溴百里酚藍）中，以未接菌的培養基作為空白對照，30 ℃、100 r·min-1振蕩5 d，培養結束時，檢測培養基pH。10 000 r·min-1離心10 min。上清液用火焰分光光度計測定有效鉀含量。

1.3.2 菌株溶磷量測定

將初篩中出現透明圈的菌株接種于裝有100 mL NBRIP 液體培養基的250 mL 三角瓶中，不接菌的NBRIP 培養液為空白對照，28 ℃、180 r·min-1振蕩5 d，測定培養基pH。10 000 r·min-1離心10 min，取2 mL 上清液與1 mL 鉬銻抗混合劑混合后定容至50 mL，反應30 min，660 nm比色測定有效磷含量。

1.3.3 菌株分泌IAA水平測定

將初篩時呈粉紅色的反應液置于紫外分光光度計中測定OD530值，隨后代入標準曲線中計算IAA含量。

1.4 菌株鑒定

選取初篩與定量測定中促生能力較強的2 株優勢菌株，對其進行測序。利用通用引物27F 和1492R作為上下游引物擴增目標菌株的16S rRNA 編碼基因，將拼接得到的基因序列上傳NCBI，利用BLAST進行同源性序列比對，采用Mega 7.0軟件中的鄰接法構建菌株的系統發育樹。

1.5 優勢菌株對玉米的促生效果驗證

1.5.1 菌懸液的制備

將篩選的具有促生功能的細菌菌株接入100 mL的LB 培養基中，28 ℃、150 r·min-1振蕩培養至OD600值約為1.500，用無菌水將其稀釋至菌體濃度為1×108CFU·mL-1，作為菌懸液備用。

1.5.2 玉米種子的促發芽試驗

挑選大小一致且無破損的玉米種子，用10%的次氯酸鈉溶液將玉米種子浸泡10 min，再用無菌水反復洗滌種子。完成后將種子胚乳向上，平鋪在墊有濕潤無菌紗布的培養皿中，每個處理100 粒。以無菌水為對照，噴施不同菌種的菌懸液。25 ℃恒溫黑暗培養3～5 d。觀察并統計種子萌發率。發芽率=發芽種子數/供試種子數×100%。

1.5.3 玉米幼苗促生試驗

采用盆栽方式檢測抗性菌株對玉米幼苗的促生效果。取玉米種子按上述方法進行催芽，待玉米苗長出3片葉子時選取長勢一致的植物進行移栽。在上口徑21.3 cm、高20 cm的圓形花盆中進行試驗，每盆裝滅菌風干土3 kg，種3 顆玉米苗，每個處理6 盆。共設6個處理：空白對照（CK）；單施乙草胺（A）；單施自制JL7菌劑（JL7）；乙草胺與JL7 菌劑混合（AJL7）；單施自制JL16 菌劑（JL16）；乙草胺與JL16 菌劑混合（AJL16）。移栽前一次性噴施200 mL混合液，其中乙草胺濃度為20 mg·L-1，活菌數約為1×106CFU·mL-1。盆栽放置于網室中，隨機擺放，根據情況施加等量無菌水。待出現三葉一心后進行收樣，測定并記錄每個玉米植株的株高、莖粗、根直徑、根長。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選

從玉米根際土壤中分離獲得23 株細菌，對各菌株進行耐乙草胺試驗。根據初篩時的生長情況，將乙草胺最大濃度提高到700 mg·L-1。表1為不同乙草胺濃度下菌株的生長情況，其中5 株耐乙草胺能力較強的抗性優勢菌株為JL3、JL7、JL9、JL16、JL21，最高抗乙草胺濃度可達700 mg·L-1。

表1 不同乙草胺濃度下菌株的生長情況Table 1 The growth of different strains under different acetochlor concentration

2.2 菌株的促生性能

對5 株抗乙草胺優勢菌進行固氮、溶磷、解鉀、分泌IAA、分泌鐵載體的能力測定。結果表明：4株菌具有固氮能力，其中JL16 能力較強，生長菌落數最多，均值為113.33，與其他4 株菌產生的菌落數均有顯著差異（P＜0.05）；5株菌均有溶磷功能，但各菌株溶磷效果差異顯著，JL7溶磷指數（溶磷指數=透明圈直徑/菌落直徑）高達4.18，與JL3相比增加了237.10%；4株菌具有解鉀能力，能力從大到小依次為JL7＞JL3＞JL9＞JL16，JL7 的可溶性指數為16.22，JL16 則為0；JL3 和JL7 的主要代謝產物為IAA，反應顏色較深；JL7 和JL16 在CAS 鐵載體檢測培養基上生長時出現的橙色光暈較為明顯。圖1 為效果最為明顯的JL7 和JL16兩菌株的促生效果圖。

圖1 部分菌株的促生能力效果圖Figure 1 Renderings of the growth promoting ability of the strains

2.3 可溶性鉀含量的動態變化

由圖2可知，0～24 h為5株菌株的生長對數期，可溶性鉀含量增加迅速。對5 株菌株的解鉀量進行測定發現，溶鉀能力依次為JL3＞JL9＞JL7＞JL16＞JL21＞CK。JL21 的解鉀量最低，為13.50 mg·L-1，JL3 解鉀能力最強，解鉀量高達47.50 mg·L-1，較CK 增加了295.83%，顯著高于其他處理。24 h后，上清液中可溶性鉀含量仍緩慢增加，這可能是第一批解鉀菌死亡后釋放細胞內的鉀所致。

圖2 不同菌株的解鉀能力Figure 2 The potassium solubilization ability of different strains

在測定可溶性鉀含量的同時測定其pH 值，結果如圖3 所示。由圖3 可知，JL3、JL7、JL9、JL16 菌株的菌懸液呈酸性，在菌株加入培養基后pH 迅速降低，JL9 最為明顯，其pH 較CK 降低0.57 個單位，總體呈先快速下降后緩慢上升趨勢。0～24 h，細菌快速繁殖，分泌大量強有機酸[14]，導致pH 極速下降，生長對數期后菌株濃度保持穩定。72 h 后，pH 升高，這可能是溶液中的鉀離子含量增加導致，具體機制有待進一步探究。120 h 后，JL9 的pH 為4.46，與其他菌株之間差異顯著（P＜0.05）。

圖3 解鉀過程中pH值的變化Figure 3 The change of pH value during potassium dissolution

2.4 可溶性無機磷含量的動態變化

由圖4 可知，溶磷量在72 h 后保持穩定，120 h后，上清液含磷量大小依次為JL7＞JL3＞JL9＞JL16＞JL21＞CK，JL7 的溶磷量為223.21 mg·L-1，相比CK 增加177.10 mg·L-1。在72 h時溶磷量略有降低，推測可能是由于后期培養基中營養成分缺少，微生物需吸收少部分可溶性磷來維持生長。

圖4 不同菌株的溶磷能力Figure 4 The ability of different strains to dissolve phosphorus

微生物富集過程中會分泌甲酸、乙酸、乙醇酸等有機酸，從而降低上清液的pH值，使磷可溶性和有效性增強，供植物吸收和利用。這與圖5 結果相符，可溶性磷含量與pH 呈反比，含量越高，pH 越低。24 h后，JL3、JL7、JL9 這3 株溶磷能力較強的菌株所在的培養基上清液的pH 在不同時間點出現少量回升，原因可能是微生物本身具有一定的調節pH 的能力，釋放了氨基氮或產生的酸被微生物利用，導致pH 有一定上升。

圖5 溶磷過程中pH值的變化Figure 5 The change of pH value during phosphorus dissolution

2.5 分泌IAA能力測定

由圖6可知，JL3和JL7兩菌株產IAA的能力顯著高于其余3 株菌，IAA 產量分別為82.10 mg·L-1和82.40 mg·L-1。由于不同菌株的代謝產物不同，可以推斷JL3 和JL7 通過吲哚-3-丙酮酸酯（IPyA）途徑[15]合成大量IAA，故IAA 為其主要代謝產物。JL16 也能夠產生IAA，但產量不大，故IAA 為其次要代謝產物，而JL9、JL21則不分泌IAA。

圖6 不同菌株產IAA的能力Figure 6 IAA production capacity of different strains

2.6 優勢菌株16S rRNA分子鑒定

對5株菌的促生能力進行對比，結果如圖7所示。JL3、JL7、JL16 這3 株菌的綜合能力較強，而JL7 與JL16 對乙草胺的抗性最強，所以對這2 株菌進行測序，并將獲得的16S rRNA 基因序列上傳NCBI 進行BLAST 比對，構建系統發育樹，結果如圖8 所示。由圖8 可知，JL7 為腸桿菌屬（Enterobactersp.），JL16 為醋菌屬（Acetobactersp.）。

圖7 不同菌株的促生能力Figure 7 Growth promoting ability of different strains

2.7 菌株對玉米種子的促發芽作用

表2 為不同處理對玉米種子發芽率的影響。由表2 可知，接種JL7 組的發芽速度較快，培養72 h 后，發芽率為81.75%。與CK 相比，JL7 和JL16 組的72 h發芽率分別增長了9.42、3.84 個百分點（P＜0.05）。培養120 h 后，3 個處理的發芽率表現為JL7＞JL16≈CK，JL7 比CK 增加6.51 個百分點（P＜0.05）。以上結果說明，JL7 與JL16 菌株對玉米種子發芽有顯著的促進作用，可以提高發芽率，其中JL7菌株能力最強。

經處理后的玉米種子長勢如圖9 所示。對這些玉米種子的芽長和根長進行測定，結果如表3 所示。接種JL16 組的長勢最好，與CK 相比，芽長顯著增加52.53%（P＜0.05），根長增加23.22%，但無顯著差異。接種JL7組的芽長比CK組增加28.16%，根長比CK組減少12.31%，但差異不顯著。經分析可知，JL7 與JL16 菌株均對玉米地上部生長有促進作用，JL16 可以促進根系發育，但JL7 可能由于分泌了某些生長素，出現抑制根系生長的現象。

圖9 JL7、JL16對玉米種子發芽的促進作用Figure 9 Growth promoting effect of JL7，JL16 strains on maize seed germination

表3 不同處理對玉米種子芽長和根長的影響Table 3 Effects of different treatments on seed bud length and root length of maize

2.8 菌株對玉米植株生長的促進作用

玉米盆栽試驗結果如圖10所示，表4為不同處理對玉米幼苗生長的影響。結果表明，JL7 和JL16 對玉米株高、莖粗、根長、根直徑均有不同程度的促進作用，且在土壤中仍對乙草胺有一定抗性。當JL7 菌株單獨接種時，玉米幼苗的根直徑和莖粗顯著大于CK，分別增加68.63%、30.67%，但其余指標增加不明顯，且根長仍低于CK，與促發芽試驗結果吻合。由此推測，JL7 菌株會產生某種生長素起到壯根壯苗的效果，但會在幼苗期抑制根系生長。單獨接種JL16 菌株時，根直徑、根長、莖粗、株高分別比CK 增加47.06%、28.61%、20.77%、21.53%。單獨施用乙草胺時，玉米幼苗的根系生長受阻，莖粗較小，該結果與Li等[16]的研究結果相符，原因可能是玉米種子與乙草胺在土壤中接觸，對乙草胺有一定的吸收和轉運[17]。加入JL7 和JL16（處理AJL7、AJL16）后，乙草胺毒性明顯減弱，說明兩個菌株在與乙草胺混合后仍存活并起到促生作用。

圖10 不同處理對玉米生長的影響Figure 10 Effects of different treatments on maize growth

表4 不同處理對玉米幼苗生長的影響Table 4 Effects of different treatments on growth of maize seedlings

3 討論

植物促生菌具有改善土壤營養環境[18]、分泌植物生長激素[19]以及產生能夠抑制病原菌的抗生素、溶解酶等[20-21]作用，已成為國內外研究的熱點。

本研究從施用乙草胺的玉米根際土壤樣品中分離獲得了23 株細菌，通過乙草胺抗性試驗，挑選出5株在含有較高濃度乙草胺的培養基中依然存活的抗性優勢菌株，其中JL16的最高乙草胺耐受濃度為700mg·L-1，略高于陳森等[22]在施用乙·芐復配制劑的稻田土壤中分離篩選的黏質沙雷式菌（Serratia marcescens）、惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）和硝化還原假單胞菌（Pseudomonas nitroreducens）（耐受濃度600 mg·L-1）。羅瑋等[23]分離獲得了一株能以乙草胺為唯一碳氮源的銅綠假單胞菌，在200 mg·L-1乙草胺濃度下可以正常存活。目前已有研究大多探究乙草胺抗性菌株的降解途徑及機理，而關于菌株既可以耐乙草胺又具備促生功能的研究鮮有報道。

通過不同的促生功能試驗，本研究發現5 株細菌的固氮、溶磷、解鉀、分泌鐵載體、分泌IAA 能力有不同程度的差異。綜合能力最強的兩株菌分別為腸桿菌屬的JL7 和醋菌屬的JL16。呂朝陽等[24]曾篩選出一株有分泌IAA 和溶磷能力且對番茄有促生作用的陰溝腸桿菌（Enterobacter cloacae），王雪玲[25]研究發現通過抗生素抗性誘導后的5 株腸桿菌屬細菌有較高的溶鎘能力，且對油菜和芥菜有促生作用，而對醋菌屬菌株的研究主要圍繞固氮作用開展[26-27]。

在解鉀試驗中，5 種菌株作用后的培養基上清液中可溶性鉀含量呈緩慢持續增加狀態，該結果與Ebrahimi 等[28]的研究結果吻合，這是由于解鉀菌在分解鉀長石粉時，一部分鉀存在于上清液中，另一部分被微生物細胞同化，積累在菌體中。部分微生物死亡后，不斷釋放細胞內的可溶性鉀，一段時間后可溶性鉀含量仍增加。這也可以解釋pH先下降后上升的原因，微生物富集過程會分泌大量有機酸[29]，從而降低上清液的pH值，但由于可溶性鉀含量仍緩慢增加，故pH也有緩慢增長的趨勢。

經過鑒定，耐乙草胺且促生能力最強的JL7 和JL16 菌株分別為腸桿菌屬（Enterobactersp.）和醋菌屬（Acetobactersp.）。目前已報道的植物根際促生菌大多為芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Psewdomonas）、伯克霍氏菌屬（Burkholderia）等[30-31]，而現階段國內外鮮見腸桿菌屬（Enterobacter）和醋菌屬（Acetobacter）作為植物根際促生菌的報道，其對乙草胺抗性等的相關報道更是少之又少。

盆栽試驗中2 株細菌的促生能力結果表明，2 種菌株均對玉米種子的發芽與幼苗生長有促進作用。但JL7 出現了促進根系粗壯但抑制根伸長的情況，推測其可能分泌了某種壯根的生長素，但是會影響根系縱向發育，其機理尚不明確，有待進一步研究。在促生能力測定時，JL7 的綜合能力強于JL16，但在盆栽試驗中，施入JL16 菌懸液的處理卻長勢更好，可能由于土壤的酸堿度和原有無機鹽含量更適合JL16 菌株的生長繁殖，并且可能存在降解殘留乙草胺的情況，在后續研究中會對這一問題進行深入研究。

4 結論

本試驗通過測定菌株的乙草胺抗性、促生能力及施加菌株對植株形態的影響，得到以下結論：

（1）篩選得到的2株優勢菌株JL7和JL16，耐乙草胺濃度高達700 mg·L-1，并且在溶磷、解鉀、固氮、產IAA、產鐵載體方面均具有較強能力。

（2）經16S rRNA 分子鑒定，JL7 為腸桿菌屬（Enterobactersp.），JL16為醋菌屬（Acetobactersp.）。

（3）JL7、JL16 可以顯著提高玉米種子的發芽率、縮短種子發芽時間，并且對玉米幼苗的根長、根直徑、莖粗、株高等生長性狀有顯著促進作用。

綜上所述，本研究分離得到的JL7、JL16 菌株既可以減輕乙草胺對植株的危害，還能進一步促進植株生長發育，具有良好的應用前景。研究可豐富植物促生菌的種類，為開發研制新的微生物源植物生長劑及微生物肥料提供原材料。