Cd脅迫下接種根瘤菌對紫花苜蓿氮代謝的影響

孫文君，吳基正，李元

（1.云南農業大學動物科學技術學院，昆明 650202；2.云南農業大學資源與環境學院，昆明 650202）

氮素被稱為“生命元素”[1]，在植物生命活動中居首要地位[2]，占植物生長所需礦質元素的40%以上，是植物生長發育所必需的主要營養來源。目前，環境中的氮大多來源于空氣中的N2，多數植物生長可利用的氮形態主要為而這些氮形態能否被利用取決于不同的氮轉化效應，包括豆科植物-根瘤菌共生體系的固氮作用[2]。生物固氮能將大氣中的分子態氮還原成氨，為植物提供氮素，可減少化肥的使用，在農業生產和環境保護方面發揮著重要作用[3]。

紫花苜蓿（Medicago SativaL.）是豆科苜蓿屬深根性多年生牧草[4]，有產量高、品質好、環境適應性強等特點，故有“牧草之王”的美稱[5]。紫花苜蓿與根瘤菌形成固氮能力較強的生物固氮體系，根瘤菌為紫花苜蓿提供氨，可調節整個細胞的代謝水平以適應外界環境的脅迫，亦可通過外排、氧化或隔離等作用機制來解毒，使紫花苜蓿在重金屬污染區域正常生長[6-8]。重金屬鎘（Cd）的生物毒性及化學活性較強，在生物體內不參與酶促反應與氮代謝過程，是生物生長的非必需元素，其含量超標會影響植物正常生長和細胞代謝，從而降低農作物的品質與產量，嚴重影響土壤的生態環境，目前土壤Cd污染已引起了國內外科研人員的廣泛關注[9-11]。有研究發現在礦區自然分布的紫花苜蓿對Cd 的耐受能力高于Cr、Zn、Cu 和Pb 幾種重金屬[10]。紫花苜蓿被認為是修復Cd 污染土壤的理想作物[12]。但紫花苜蓿與根瘤菌的生物固氮過程極其復雜，易受到重金屬、寒、旱等環境因素的影響[13]，故探究紫花苜蓿根瘤菌氮代謝對Cd的響應具有重要意義。

目前，對于Cd 脅迫下紫花苜蓿的生理生化和生長特性已有較深入的研究，但關于接種根瘤菌后紫花苜蓿氮代謝對Cd響應的研究較少。本研究通過研究接種根瘤菌后紫花苜蓿氮代謝酶活和氮素含量對Cd污染土壤的響應，明確Cd 污染條件下紫花苜蓿接種根瘤菌的氮代謝機理，為Cd 污染土壤紫花苜蓿提高氮素累積，以及合理利用紫花苜蓿、根瘤菌提供基礎性研究數據。

1 材料與方法

1.1 供試土壤與紫花苜蓿品種

試驗于2021 年6—10 月在云南農業大學資源與環境學院試驗基地溫室大棚進行。供試土壤取自云南農業大學東校區后山農場，屬紅壤土，其pH值5.82，有機質含量為15.02 g·kg-1，全氮含量為1.77 g·kg-1，堿解氮含量為116.4 mg·kg-1，全磷含量為1.5 g·kg-1，有效磷含量為63.25 mg·kg-1，全鉀含量為12.18 g·kg-1，速效鉀含量為57.79 mg·kg-1，總Cd含量為0.38 mg·kg-1，經風干后的土樣過篩并進行高溫滅菌，混勻后裝盆備用。

紫花苜蓿由云南農業大學動物科學技術學院草業科學實驗室提供，品種為“ 維多利亞”和“WL525HQ”。

1.2 試驗設計

采用溫室土培試驗，外源Cd（濃度為50 mg·kg-1，采用CdCl2·2.5H2O 與去離子水配制）與過2 mm 篩的土壤反復混合均勻，在溫室下穩定7 d，種植紫花苜蓿至開花期前（種植期為100 d）。共分為8 個處理（表1），各處理重復3 次。試驗用花盆規格為49 cm×15 cm×19 cm，每盆裝入6.0 kg土壤。

表1 試驗處理設置Table 1 The experimental treatments

1.2.1 種子萌發

挑選顆粒飽滿、大小均勻的紫花苜蓿種子，依次用75%乙醇浸泡10 min、蒸餾水沖洗5 次，20%次氯酸鈉浸泡10 min、蒸餾水沖洗5 遍后浸泡30 min，平鋪在培養皿（9 cm）中，放入25 ℃的培養箱，催芽1 d。

1.2.2 根瘤菌培養

用營養瓊脂培養基（牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g）培養中華根瘤菌225038菌株（北納細胞微生物保藏管理中心），接種根瘤菌至固體培養基平板上。28 ℃培養3 d 后，挑取單個菌落接種到液體培養基中，28 ℃振蕩培養制成菌懸液，培養至OD 值為0.8～1.2時可進行接種。

1.2.3 根瘤菌接種及處理

用無菌鑷子將催芽至1～2 cm 的紫花苜蓿種子移入土壤中，在每株紫花苜蓿根周圍加入1 mL 菌懸液，每個花盆中種植20 株，待紫花苜蓿長出第一片子葉時，補加等量菌懸液，于溫室中培養，期間定時觀察結瘤情況。

1.3 指標測定

待植株生長至100 d時，以盆為單位收獲植株，將整株紫花苜蓿于105 ℃殺青30 min，后置于70 ℃烘至恒質量，研磨備用?？偟坎捎脛P氏定氮法測定[14]，硝態氮、銨態氮含量使用5%硫酸-過氧化氫提取比色法測定[15-16]，游離氨基酸采用茚三酮溶液顯色法測定[17]，可溶性蛋白采用考馬斯亮藍法測定[18]，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法測定[19]。地上、地下部硝酸還原酶（NR）、亞硝酸還原酶（NiR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、天冬酰胺合成酶（AS）和谷氨酸脫氫酶（GDH）的活性使用酶活性測定試劑盒（Solarbio，北京索萊寶科技有限公司）測定。

1.4 統計分析

數據用SPSS進行方差分析，以平均值±標準誤差表示，用Origin 2018繪制相關圖表。

2 結果與分析

2.1 接種根瘤菌對Cd脅迫下紫花苜蓿NR的影響

Cd 脅迫對紫花苜蓿的NR 活性產生不同程度的抑制作用（圖1）。0 mg·kg-1Cd處理下，接種根瘤菌與不接種的維多利亞、WL525HQ 地上部NR 活性差異不顯著（P＞0.05），接種根瘤菌的WL525HQ地下部NR活性較不接種處理顯著增強51.04%（P＜0.05）。50 mg·kg-1Cd 處理下，與未接種相比，接種根瘤菌WL525HQ 地上部NR 活性提高164.66%（P＜0.05），維多利亞地下部NR 活性提升99.46%（P＜0.05）。與0 mg·kg-1相比，50 mg·kg-1Cd 處理未接種的維多利亞地上、地下部NR 活性分別下降29.89%、70.42%，WL525HQ 地上、地下部NR 活性分別下降85.01%、79.98%。

圖1 硝酸還原酶（NR）活性對Cd脅迫的響應Figure 1 Response of NR activity to Cd stress

2.2 接種根瘤菌對Cd脅迫下紫花苜蓿NiR的影響

0 mg·kg-1Cd 處理下，接種根瘤菌與未接種的維多利亞植株的NiR 活性差異顯著（P＜0.05），地上、地下部NiR 活性分別提高12.99%、5.11%（P＜0.05）。50 mg·kg-1Cd 處理下，與未接種組相比，接種根瘤菌維多利亞地上部NiR活性顯著提高13.93%（P＜0.05）。與0 mg·kg-1相比，50 mg·kg-1Cd處理未接種的維多利亞地下部NiR活性下降33.29%，WL525HQ地上、地下部NiR活性分別下降61.43%、63.67%（圖2）。

圖2 亞硝酸還原酶（NiR）活性對Cd脅迫的響應Figure 2 Response of NiR activity to Cd stress

2.3 接種根瘤菌對Cd脅迫下紫花苜蓿GS的影響

0 mg·kg-1Cd處理下，與未接種相比，接種根瘤菌的WL525HQ 地上、地下部GS 活性分別提高8.66%、30.56%（P＜0.05）。但接種根瘤菌對維多利亞植株GS活性影響不顯著（P＞0.05）。與0 mg·kg-1相比，50 mg·kg-1Cd處理下未接種的維多利亞地上部GS活性降低11%（圖3）。

圖3 谷氨酰胺合成酶（GS）活性對Cd脅迫的響應Figure 3 Response of GS activity to Cd Stress

2.4 接種根瘤菌對Cd脅迫下紫花苜蓿GOGAT的影響

0 mg·kg-1Cd處理下，與未接種處理相比，接種根瘤菌顯著提高WL525HQ 植株的GOGAT 活性（P＜0.05），地上、地下部分別提升95.53%、38.34%。50 mg·kg-1Cd 處理下，接種根瘤菌WL525HQ 紫花苜蓿地下部GOGAT 活性顯著提高8.42%（P＜0.05），但接種根瘤菌對維多利亞植株GOGAT 活性影響不顯著（P＞0.05）（圖4）。

圖4 谷氨酸合成酶（GOGAT）活性對Cd脅迫的響應Figure 4 Response of GOGAT activity to Cd stress

2.5 接種根瘤菌對Cd脅迫下紫花苜蓿AS的影響

0 mg·kg-1Cd處理下，與未接種處理相比，接種根瘤菌使維多利亞地上部AS 活性提升33.30%（P＜0.05），WL525HQ 地上、地下部AS 活性分別顯著增升24.37%、15.06%（P＜0.05）。50 mg·kg-1Cd 處理下，接種根瘤菌WL525HQ 地上、地下部AS 活性分別增加43.36%、41.63%。與0 mg·kg-1相比，50 mg·kg-1Cd處理降低紫花苜蓿AS 活性，且Cd 對WL525HQ 的抑制作用較維多利亞更顯著（P＜0.05）（圖5）。

圖5 天冬酰胺合成酶（AS）活性對Cd脅迫的響應Figure 5 Response of AS activity to Cd stress

2.6 接種根瘤菌對Cd脅迫下紫花苜蓿GDH的影響

0 mg·kg-1Cd 處理下，接種根瘤菌與未接種紫花苜蓿植株的GDH 活性差異不顯著（P＞0.05）。50 mg·kg-1Cd 處理下，接種根瘤菌WL525HQ 植株地上、地下部的GDH 活性較未接種處理分別下降19.59%、50.91%（P＜0.05）。與0 mg·kg-1相比，50 mg·kg-1Cd處理使WL525HQ 未接種根瘤菌植株地上、地下部GDH活性分別提升54.00%、135.00%（P＜0.05），對接種根瘤菌維多利亞植株GDH 活性的影響不顯著（P＞0.05）（圖6）。

圖6 谷氨酸脫氫酶（GDH）活性對Cd脅迫的響應Figure 6 Response of GDH activity to Cd stress

2.7 接種根瘤菌對Cd脅迫下紫花苜蓿含氮物質的影響

0 mg·kg-1Cd 處理下，接種根瘤菌使維多利亞、WL525HQ 硝態氮含量比未接種處理分別提高15.03%、13.07%（P＜0.05），WL525HQ可溶性蛋白含量提高12.08%，維多利亞游離氨基酸、脯氨酸含量增幅最大，分別為20.24%、71.03%（P＜0.05），接種根瘤菌的WL525HQ 較未接種組總氮含量顯著提高14.28%（P＜0.05）。50 mg·kg-1Cd處理下，接種根瘤菌使維多利亞、WL525HQ 氨態氮含量增加6.87%、21.67%（P＜0.05），可溶性蛋白含量增加6.24%、5.82%（P＜0.05），游離氨基酸含量增加16.10%和18.70%（P＜0.05），維多利亞脯氨酸、總氮含量增加67.92%、9.48%（P＜0.05）。與0 mg·kg-1相比，50 mg·kg-1Cd處理降低未接種紫花苜蓿的硝態氮、氨態氮、可溶性蛋白及總氮含量，增加游離氨基酸及脯氨酸含量（P＜0.05），未接種維多利亞、WL525HQ 硝態氮含量分別下降23.90%、55.55%（P＜0.05），游離氨基酸含量增加42.17%、61.84%（P＜0.05），同時50 mg·kg-1Cd 處理誘導紫花苜蓿的脯氨酸含量增多，維多利亞、WL525HQ 分別提高92.52%、85.85%（表2）。

表2 Cd對紫花苜蓿氮素形態和含量的影響Table 2 Effects of Cd on nitrogen form and content of alfalfa

3 討論

3.1 Cd 脅迫下接種根瘤菌對紫花苜蓿氮代謝關鍵酶的影響

GS 和GOGAT 是植物氮代謝過程中合成氨基酸的主要酶。其中，GS 參與植株氮代謝途徑的多個調節過程，也是影響氮同化的關鍵酶[31]，通過與GOGAT結合催化谷氨酰胺合成谷氨酸，GS/GOGAT 循環對植物體內平衡具有重要的協同作用[32-33]。本研究發現Cd 對紫花苜蓿的GS 活性有一定的抑制作用（圖3），當植物處于逆境（如受到Cd脅迫或營養缺乏）時，同化增強且蛋白質發生降解，使得NADH-GDH通路中的GDH 活性顯著增大，誘導脅迫保護分子合成，根瘤菌能同時通過增強GS/GOGAT 循環、NADHGDH 模式以及增加NR、NiR 的還原產物，促進共生體系將無機氮轉化為有機氮，從而抵抗不利環境的脅迫[34-36]。AS 是廣泛存在于生物體內的一類氨基轉移酶，能催化谷氨酰胺的氨基向天冬氨酸轉移，天冬酰胺的形成與累積是一種解毒反應[37]。Lam等[38]利用分子生物學技術發現擬南芥AS 基因ASN1過表達使體內天冬酰胺累積量增多，改善了逆境中的氮素營養狀況，證實AS對植物氮代謝以及氮的“源-庫”關系調節具有至關重要的作用。

3.2 Cd脅迫下接種根瘤菌對紫花苜蓿含氮物質的影響

氮是植物體內核酸、氨基酸和蛋白質等大分子有機氮化合物的重要組成元素[39]，能直接影響植物的正常生長、品質及產量等[40]。氨基酸含量在植物應對逆境脅迫中的作用尤為重要[41]。研究表明，在受到非生物脅迫時植物體內游離氨基酸含量不斷增加[42]。本研究表明，與無Cd 處理相比，Cd 處理使紫花苜蓿的游離氨基酸含量增多，是由于細胞受到脅迫損傷，植物需積累大量游離氨基酸以抵御Cd 的毒害[43]。已有研究發現，較高含量的脯氨酸可以減弱逆境脅迫引起的滲透損傷[44]，植物對脯氨酸的累積能力與抵御逆境的能力有一定的相關性[45]，因而其可以作為脅迫指示劑。本研究中，接種根瘤菌處理使紫花苜蓿共生體系脯氨酸含量增多，說明接種根瘤菌的紫花苜?？剐杂兴岣?，在處于相同逆境時，根瘤菌協助植株通過產生更多的脯氨酸來緩解Cd 的脅迫。這表明接種根瘤菌能夠減少Cd 脅迫對紫花苜蓿造成的細胞損傷，增強胞間穩定性，維持細胞內外環境的平衡，從而使紫花苜蓿具有更強的氮代謝能力與滲透調節能力。有研究顯示，豆科植物-根瘤菌共生系統的固氮量約占生物固氮總量的65%[46]。李凱等[47]也發現，接種根瘤菌的大豆產量及含氮量顯著增加。本試驗接種根瘤菌處理后也得出同樣結果，兩種紫花苜蓿的含氮量均有不同程度的提高，說明接種根瘤菌通過促進Cd脅迫下紫花苜蓿的氮代謝過程提高了植物對氮素的吸收。

4 結論

（1）Cd 脅迫影響紫花苜蓿氮代謝，通過接種根瘤菌調節氮代謝關鍵酶活性介導紫花苜蓿的氮代謝，緩解了Cd對紫花苜蓿氮代謝的毒害作用。

（2）接種根瘤菌使紫花苜?？扇苄缘鞍?、游離氨基酸和脯氨酸含量增加，提高了紫花苜蓿的滲透調節能力。

因此，接種根瘤菌能通過調節紫花苜蓿氮代謝過程來緩解Cd造成的傷害，使紫花苜蓿積累更多的氮素。