同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質譜法測定咪鮮胺原藥中17種二噁英類化合物

王洪妮，張麗麗，俞斌，陳海華

（江蘇全威檢測有限公司，江蘇常州 213164）

咪鮮胺作為一種低毒殺菌劑，被廣泛用于防治蔬菜瓜果的炭疽病、葉斑病、枯萎病等[1-2]。目前市售的咪鮮胺原藥大多是以2，4，6-三氯苯酚為原料，依次與1，2-二氯乙烷、丙胺、光氣、咪唑等反應制得[3-4]。該合成路線中會伴隨以含氯化合物作為前驅體經縮合反應生成的二噁英類副產物[5-6]，二噁英類化合物會通過咪鮮胺原藥的生產和使用擴散到生態環境中，造成一定程度的污染。二噁英類化合物屬于持久性有機污染物，被國際研究中心列為一級致癌物，具有不可逆的致癌、致畸、致突變毒性，其與呼吸毒性、皮膚毒性、肝毒性、生殖毒性、神經系統毒性和內分泌毒性等多種毒性作用[7-8]，對生態環境和人體健康產生較大危害，因此檢測咪鮮胺原藥中二噁英類化合物，對于加強持久性有機污染物防治，保護人類家園具有重要意義。

二噁英類化合物的檢測方法主要有氣相色譜-三重四極桿質譜法、氣相色譜-串聯質譜法、高分辨氣相色譜-高分辨質譜法、酶誘導法、體外熒光素酶法、酶聯免疫分析法等[9-12]，其中高分辨氣相色譜-高分辨質譜法是國際上公認的最權威的二噁英類化合物檢測方法，能精確地檢測出二噁英類化合物的種類，并準確定量，是我國市場上出具檢測報告的唯一方法[13]。目前我國二噁英檢測主要集中在環境、食品領域，尚未有咪鮮胺原藥中二噁英類污染物檢測的相關報道?？紤]到咪鮮胺農藥應用的廣泛性，以及二噁英類化合物超痕量檢測的復雜性，筆者建立了一種同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質譜法測定咪鮮胺原藥中17 種二噁英類化合物。該方法實用性強，靈敏度高，特異性好，可為包括咪鮮胺原藥在內的含氯有機農藥中二噁英類化合物的檢測提供技術參考。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高分辨氣相色譜-高分辨雙聚焦磁質譜聯用儀：Thermo Trace 1310-DFS 型，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

電子分析天平：YP10002 型，感量為0.01 g，上海越平科學儀器有限公司。

強磁力攪拌器：98-2 型，鞏義市予華儀器有限責任公司。

旋轉蒸發儀：YRE-201D型，鞏義市予華儀器有限責任公司。

全自動氮空吹掃儀：YGC-16A 型，天津艾維歐科技發展有限公司。

微量注射器：10 μL-N 型，哈美頓(上海)實驗器材有限公司。

二噁英類混合標準溶液Ⅰ：包含15 種同位素13C12標記的二噁英類化合物，溶劑為壬烷，各組分質量濃度見表1，美國劍橋CIL (同位素標準品)公司。

表1 二噁英類混合標準溶液信息Tab.1 Information of dioxin mixed standard solution

二噁英類混合標準溶液Ⅱ：包含2 種同位素13C12標記的二噁英類化合物，溶劑為壬烷，各組分質量濃度見表1，美國劍橋CIL (同位素標準品)公司。

二噁英類混合標準溶液Ⅲ：包含17種二噁英類化合物，溶劑為壬烷，各組分質量濃度見表1，美國劍橋CIL (同位素標準品)公司。

二噁英類混合標準溶液Ⅳ：包含17種二噁英類化合物，由二噁英類混合標準溶液Ⅲ稀釋制得，溶劑為壬烷，各組分質量濃度見表1。

二噁英類混合標準溶液CS1～CS5：包含17 種二噁英類化合物和17 種同位素13C12標記的二噁英類化合物，溶劑為壬烷，各組分質量濃度見表1，美國劍橋CIL (同位素標準品)公司。

正己烷：農殘級，上海星可高純溶劑有限公司。

甲苯：農殘級，麥吉睿珀(上海)生物科技有限公司。

二氯甲烷：農殘級，上海星可高純溶劑有限公司。

中性硅膠：60N型，日本關東化學株式會社。

活性炭硅膠：二噁英類化合物分析專用，日本關東化學株式會社。

無水硫酸鈉：優級純，天津市科密歐化學試劑有限公司。

咪鮮胺原藥樣品：市售。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 氣相色譜儀

色譜柱：TR-Dioxin-5MS 型毛細管柱[60 m×0.25 mm，0.25 μm，賽默飛世爾科技(中國)有限公司]；進樣口溫度：280 ℃；載氣：高純氦氣；載氣流量：1 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣體積：1 μL；升溫程序：初始溫度為140 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持1 min，以5 ℃/min的速率升溫至220 ℃，保持16 min，以5 ℃/min 的速率升溫至235 ℃，保持7 min，以5 ℃/min 的速率升溫至310 ℃，保持10 min。

1.2.2 高分辨雙聚焦磁質譜儀

離子源：電子轟擊(EI)；檢測方式：選擇離子監測(MID)；離子源溫度：260 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；電子能量：45 eV；分辨率：大于10 000。

1.3 相對響應因子計算

分別取二噁英類混合標準溶液CS1～CS5，按照1.2儀器工作條件進行測定，由工作站軟件Target Quan分析數據，參考GB 5009.205—2013《食品安全國家標準 食品中二噁英及其類似物毒性當量的測定》計算相對響應因子及其平均值，該相對響應因子的相對標準偏差應小于20%，否則需重新試驗并計算。

1.4 實驗方法

1.4.1 樣品提取

稱取10.00 g (精確至0.01 g)咪鮮胺原藥樣品于燒杯中，加入200 mL正己烷-二氯甲烷(體積比為5∶1)混合溶劑溶解，樣品全部溶解后用微量注射器加入5 μL二噁英類混合標準溶液Ⅰ，再加入30 g酸化硅膠(由44 g 濃硫酸和56 g 中性硅膠配制而成，下同)，磁力攪拌2 h，用無水硫酸鈉小柱過濾；燒杯中剩余的酸化硅膠加入50 mL 正己烷清洗，磁力攪拌30 min，用無水硫酸鈉小柱過濾；重復清洗3 次，收集全部過濾液作為樣品提取液，濃縮至2 mL左右待下一步凈化。若酸化硅膠的顏色較深，則重復酸化硅膠提取過程，直至酸化硅膠為淺黃色。

1.4.2 樣品凈化

選用多層硅膠柱與活性炭硅膠柱組合方式凈化。多層硅膠柱填料從下到上依次為4 g無水硫酸鈉、3 g中性硅膠、5 g堿性硅膠(由40 mL質量濃度為50 g/L氫氧化鈉溶液和98 g中性硅膠配制而成)、2 g中性硅膠、10 g 酸化硅膠、2 g 中性硅膠、4 g 無水硫酸鈉。用40 mL 正己烷淋洗活化柱子后上樣，用120 mL 正己烷淋洗多層硅膠柱，接收洗出液，濃縮后待活性炭硅膠柱凈化。

活性炭硅膠柱填料為1 g活性炭硅膠，用40 mL正己烷清洗活化柱子后上樣，依次用25 mL正己烷、40 mL正己烷-二氯甲烷(體積比為3∶1)混合溶劑淋洗柱子，棄去洗出液，翻轉活性炭硅膠柱，用60 mL甲苯淋洗翻轉后的活性炭硅膠柱，接收該甲苯洗出液，濃縮后用二氯甲烷定量轉移至2 mL全回收自動進樣瓶中，用高純氮氣吹除多余溶劑，濃縮至近干后，加入5 μL 二噁英類混合標準溶液Ⅱ和20 μL 壬烷，作為樣品溶液。

1.4.3 樣品測定

凈化后的樣品溶液按照1.2儀器工作條件測定，根據1.3計算的相對響應因子平均值，由工作站軟件TargetQuan 分析數據，參考HJ 77.3—2008《固體廢物 二噁英類的測定 同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質譜法》，以同位素稀釋二級內標法定量計算17種2，3，7，8-氯代二噁英類化合物質量濃度。

2 結果與討論

2.1 提取方法選擇和優化

二噁英類化合物常用的提取方法有索氏提取法、加速溶劑法、液液萃取法、酸化硅膠吸附法等[14]。咪鮮胺原藥熔點(46.5～49.3 ℃)較低，不適宜采用索氏提取和加速溶劑提取方式提??；咪鮮胺原藥微溶于水(25 ℃時在水中溶解度為34.4 mg/L)，也不適宜采用液液萃取方式提取。酸化硅膠可吸附多種離子或非離子性官能團化合物，如生物堿、糖脂、多環芳香族化合物及胺類物質等，且吸附容量大，不易造成過載，可有效吸附咪鮮胺化合物而不吸附二噁英類物質，從而達到分離提取二噁英類化合物的目的，方便快捷，成本低，故選擇酸化硅膠吸附法提取樣品。

2.2 提取溶劑選擇

分別選擇乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷及正己烷-二氯甲烷混合溶劑作為提取溶劑，考察不同溶劑溶解咪鮮胺原藥后酸化硅膠的吸附效果。結果發現，正己烷-二氯甲烷混合溶劑提取效果最好，樣品經乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷單一溶劑溶解后，酸化硅膠無法完全吸附咪鮮胺，上清液濃縮后會出現咪鮮胺化合物殘留。進一步考察不同體積比的正己烷-二氯甲烷混合溶劑對酸化硅膠吸附效果的影響。結果發現，當正己烷與二氯甲烷的體積比為1∶1時，酸化硅膠無法完全吸附去除咪鮮胺，上清液濃縮后有咪鮮胺化合物殘留；而當正己烷與二氯甲烷的體積比為10∶1時，無法完全溶解咪鮮胺原藥。調整正己烷與二氯甲烷的體積比，同時綜合考慮混合溶劑的毒性，在保證樣品提取效果的基礎上盡量減少二氯甲烷用量。結果表明，當正己烷與二氯甲烷的體積比為5∶1 時能完全溶解咪鮮胺原藥，酸化硅膠可吸附全部咪鮮胺，上清液濃縮后沒有咪鮮胺化合物殘留，提取效果最好，故選擇正己烷-二氯甲烷混合溶劑的體積比為5∶1。

2.3 色譜條件優化

選擇賽默飛世爾科技(中國)有限公司生產的二噁英類化合物檢測專用TR-Dioxin-5MS 型毛細管柱，固定相為5%苯基-95%甲基聚硅氧烷，柱長60 m。色譜條件參考HJ 77.3—2008 設定，升溫程序、進樣方式未作改變，進樣口溫度略有調整，結合GB 5009.205—2013，將進樣口溫度升高10 ℃，調整為280 ℃，確保樣品氣化完全，降低高氯代二噁英類化合物的損失，優化結果見1.2.1。

在優化的色譜條件下分別測定咪鮮胺原藥和二噁英類混合標準溶液(CS3)，總離子流色譜圖如圖1所示。圖1結果表明，該色譜柱抗干擾能力強，在高分辨率條件下，可實現17種二噁英類化合物的良好分離，樣品基質不產生干擾。

圖1 咪鮮胺原藥和二噁英類混合標準溶液（CS3）總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of prochloraz and dioxin mixed standard solution（CS3）

2.4 質譜條件優化

質譜條件參考HJ 77.3—2008設定，并按該標準進行分辨率調節和質量校正，優化結果見1.2.2。

2.5 線性方程與方法檢出限

在1.2儀器工作條件下，分別測定二噁英類混合標準溶液CS1～CS5，以二噁英類化合物質量濃度為橫坐標，以二噁英類化合物兩個監測離子色譜峰面積之和與對應的同位素13C12標記的二噁英類化合物兩個監測離子峰面積之和的比值為縱坐標，繪制標準工作曲線，計算線性方程和相關系數。

以正己烷-二氯甲烷混合溶劑(體積比為5∶1)為空白試劑，添加5 μL 二噁英類混合標準溶液Ⅳ，按1.4 實驗方法重復測定7 次，計算測定值的標準偏差，以3倍標準偏差作為方法檢出限[15]，根據稱樣質量換算成樣品中的含量，以質量分數表示。

17種二噁英類化合物的質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數及檢出限見表2。由表2 可知，17種二噁英類化合物的質量濃度在對應范圍內與色譜峰面積比值線性關系良好，相關系數為0.999 7～0.999 9。當稱樣量為10 g 時，咪鮮胺原藥樣品中二噁英類化合物的檢出限為0.01～0.1 ng/kg，表明該方法靈敏度高，滿足分析要求。

表2 17種二噁英類化合物質量濃度線性范圍、線性方程、相關系數及檢出限Tab.2 Linear range，linear equation，correlation coefficient and detection limit of 17 dioxins

2.6 精密度試驗

取同一批次咪鮮胺原藥樣品6份，按1.4實驗方法進行測定，結果見表3。由表3 可知，測定結果的相對標準偏差為4.3%～13.6%，表明該方法精密度較高，滿足分析要求。此外，咪鮮胺原藥中二噁英類化合物測定結果呈現多氯代二苯并-對-二噁英比多氯代二苯并呋喃含量高的趨勢，二噁英類化合物分布規律基本符合二噁英類化合物合成機理，即前驅物反應主要生成多氯代二苯并-對-二噁英[16-18]。

表3 精密度試驗結果Tab.3 Results of precision test

2.7 加標回收試驗

取咪鮮胺原藥樣品，分別添加低、高2個加標水平的17種二噁英類化合物混合標準溶液(由二噁英類混合標準溶液Ⅲ稀釋制得，各組分添加質量分數見表4)，按照1.4 實驗方法進行檢測，每個加標水平平行測定6次，計算17種二噁英類化合物的回收率，結果列于表4。由表4可知，17種二噁英類化合物回收率為76.2%～115.8%，表明該方法準確度較高，滿足分析要求。

表4 加標回收試驗結果Tab.4 Results of recovery test

3 結語

建立了同位素稀釋高分辨氣相色譜-高分辨質譜法測定咪鮮胺原藥中17 種二噁英類化合物含量的方法，通過優化提取方法，簡化了樣品處理操作步驟。該方法實用性強、靈敏度高、選擇性好，可為包含咪鮮胺原藥在內的含氯農藥中二噁英類化合物的檢測提供技術支持。